一種小麥富脯氨酸類蛋白Tazmh122及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥富脯氨酸類蛋白Tazmh122及其編碼基因和應(yīng)用。一種小麥富脯氨酸類蛋白Tazmh122，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。編碼該小麥富脯氨酸類蛋白Tazmh122的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明提供了一種新的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmh122及其編碼基因。通過(guò)基因工程的方法將本發(fā)明提供的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmh122編碼基因轉(zhuǎn)入小麥中，可以提高小麥的千粒重。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會(huì)影響植物的食品安全性，可在作物育種中應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】-種小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22及其編碼基 因和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪饕募Z食作物之一，其提供的熱量占人類所需總熱量的17%以 上（Khush et al. 2003)，養(yǎng)活了大約40%的全球人口（Gupta et al. 2008)。不斷提高小麥 產(chǎn)量是世界范圍內(nèi)小麥育種的最基本目標(biāo)。
[0003] 富含脯氨酸的蛋白質(zhì)（proline - rich proteins, PRPs)代表一類富含 proline (Pro -)和hydroxyproline (Hyp -)的結(jié)構(gòu)蛋白，這類蛋白質(zhì)在雙子葉植物如大豆、 胡蘿卜和紫花苜蓿及單子葉植物如玉米和小麥等植物中廣泛存在，研究顯示，它們?cè)诤芏?植物中表達(dá)，參與植物發(fā)育的不同方面.例如，種子發(fā)育，豆莢形成，早期結(jié)瘤等.PRPs基因 的表達(dá)還受傷害、真菌、乙烯、細(xì)胞培養(yǎng)、干旱和光照影響，富脯氨酸類蛋白種類繁多，結(jié)構(gòu) 的多樣性決定了功能的多樣性，但對(duì)于它們的確切功能知之甚少，富脯氨酸類蛋白在種子 發(fā)育過(guò)程中的功能還未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種小麥富脯氨酸類蛋白 Tazmhl22〇
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供該小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22的編碼基因。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供編碼基因的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22,氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。該蛋白包 含173個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4. 86,脯氨酸占35. 3%。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)沒(méi)有發(fā)現(xiàn) 與該多肽鏈具有同源性蛋白序列公布，因此麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22是一類新的富脯 氨酸類蛋白。
[0009] 編碼所述的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22的基因。
[0010] 所述的編碼權(quán)利要求1所述的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22的基因，優(yōu)選核苷酸 序列如SEQ ID NO :1所示。
[0011] 含有小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22編碼基因的重組表達(dá)載體。
[0012] 所述的重組表達(dá)載體，優(yōu)選出發(fā)載體為任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中超量 表達(dá)的載體。
[0013] 所述的重組表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選將所述的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22編碼 基因插入PBI121表達(dá)載體PstI酶切位點(diǎn)所得。
[0014] 本發(fā)明所述的編碼小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22的基因在品種改良中的應(yīng)用； 優(yōu)選所述的基因在提1?小麥千粒重中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體在品種改良中的應(yīng)用；優(yōu)選在提高小麥千粒重中的應(yīng) 用。
[0016] 利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中超量表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的富 脯氨酸類基因 Tazmhl22導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得改變植物千粒重的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因 植株。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行篩選，可以對(duì)載體進(jìn)行加工，如加入抗 生素標(biāo)記基因（如：潮霉素、卡那霉素和慶大霉素)，加入抗生素標(biāo)記基因之后的載體用于轉(zhuǎn) 化，可以在轉(zhuǎn)化后的植物培養(yǎng)基中加入抗生素，抑制非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和植株的生長(zhǎng)，有助于 快速和有效的獲得轉(zhuǎn)基因植株。為了便于觀察外源基因的表達(dá)，可以在載體中啟動(dòng)子和外 源基因之間加入報(bào)告基因（GUS基因、GFP和熒火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因），構(gòu)建報(bào)告基因和外 源基因融合表達(dá)的載體，該載體用于遺傳轉(zhuǎn)化，可以通過(guò)觀察報(bào)告基因的表達(dá)與否和表達(dá) 量高低，推測(cè)外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)情況。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，也可以構(gòu)建載 體時(shí)不攜帶任何篩選標(biāo)記基因，而在苗期進(jìn)行PCR檢測(cè)。含有本發(fā)明的Tazmhl22表達(dá)載體 可通過(guò)使用基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道，電擊，顯微注射，Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)?；蛑参?病毒等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞培育成完整的植株。 被轉(zhuǎn)化的植株材料既可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物，如：水稻、棉花、小麥、大豆、 煙草、擬南芥、大麥、高粱、玉米、黃瓜、番茄、楊樹(shù)、草坪草、苜蓿等。
[0017] 有益效果：
[0018] 本發(fā)明提供了一種新的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22及其編碼基因。通過(guò)基因 工程的方法將本發(fā)明提供的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22編碼基因轉(zhuǎn)入小麥中，可以提 高小麥的千粒重。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表 達(dá)不會(huì)影響植物的食品安全性，可在作物育種中應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1轉(zhuǎn)基因小麥的PCR檢測(cè)。
[0020] 其中B、C、D、E為不同的轉(zhuǎn)基因株系，Bobwhite表不進(jìn)彳丁轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)時(shí)的受體材 料，為進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化的常用基因型，陽(yáng)性對(duì)照為攜帶有小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22 編碼基因的表達(dá)載體。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā) 明。
[0022] 實(shí)施例lTazmhl22蛋白的獲得。
[0023] 記錄小麥品種望水白每穗小花開(kāi)花時(shí)間，取開(kāi)花后3天，10天的種子，取材后立即 用液氮冷凍。取700mg凍存的種子，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL10%三氯 醋酸/丙酮振蕩混勻、-20°C沉淀1小時(shí)；4°C 15, OOOg離心15min，沉淀重新懸浮于5mL冷 丙酮中，-201：放置2小時(shí)；41：15,00(^離心151^11，沉淀懸浮于80%的冷丙酮中，-201： 放置1小時(shí)，離心去丙酮，將沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入IOyL裂解液（7M脲，2M硫 脲，4%CHAPS，1%CA，0. 3%蛋白酶抑制劑，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C攪拌抽提 15min后加入14mM的DTT ;4°C再攪拌20min，然后35, OOOg離心lOmin，上清即為蛋白抽提 液。將蛋白提取液進(jìn)行等電聚焦后，進(jìn)行SDS -PAGE電泳。電泳緩沖液用Tris -Glycine -SDS 緩沖液，溫度設(shè)為17°C ;先用2. 5W/膠預(yù)電泳30min后，再用5W/膠電泳至溴酚藍(lán)到玻璃板 下緣為止。電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行銀染。取一個(gè)分子量為18. 045千道爾頓，等電點(diǎn)為 4. 86的蛋白點(diǎn)即為Tazmhl22蛋白。
[0024] 實(shí)施例2 :編碼Tazmhl22蛋白的cDNA序列的獲得。
[0025] 對(duì)實(shí)施例1得到的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析獲得其氨基酸組成信息，根據(jù)對(duì)應(yīng)肽 片段的EST用來(lái)搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)，得到了 4條EST序列：BM135088. 1，BJ250155. 1， CN007768. 1和BJ244353. 1，將上述4條EST序列進(jìn)行拼接，然后用MacVector軟件設(shè) 計(jì)引物 Pl，Pl 引物對(duì)如下：F-5' -ATGGCGGGTGGCAAAGCCGCTCTGC-3'（SEQ ID NO. 3) ;R : 5'-CTAGACATTGGGCTTGTAGGCAGGC-3'（SEQ ID NO. 4)。以望水白開(kāi)花后 3 天的種子 cDNA 作 為模板，用英俊公司的Trizol試劑盒提取小麥種子的總RNA，采用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成單鏈cDNA。用引物Pl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μ L，包括5ng 模板，F(xiàn) 和 R 引物各 5pmol，dATP, dTTP, dCTP 和 dGTP 各 5nmol，37. 3nmol MgC12, 0· 5 單位的 DNA聚合酶，lx PCR緩沖液。擴(kuò)增的程序是：94°C變性3分鐘；30個(gè)循環(huán)，94°C變性20秒， 51°C退火30秒，72 °C延伸1分鐘；最后72 °C延伸5分鐘。通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得了包含開(kāi)放讀 碼框的522bp的核苷酸序列，將該核苷酸與T-載體在16°C連接30min，連接體系為10 μ L， 包括T-載體1 μ L，PCR產(chǎn)物4 μ L，連接酶1 μ L，連接酶緩沖液1 μ L，ddH203 μ L。連接產(chǎn)物 通過(guò)42°C熱擊40秒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中，送至華大基因公司測(cè)序，所得序列如SEQ ID NO :1所示。該序列編碼173個(gè)氨基酸，如SEQ ID NO :2所示，等電點(diǎn)為4. 86。
[0026] 實(shí)施例3 :轉(zhuǎn)Tazmhl22基因小麥的千粒重得到提高。
[0027] 以望水白開(kāi)花后3天的種子cDNA作為模板，利用引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，P2引物 對(duì)如下：F-5' -GTACCTGCAGATGAAGATGGGCCCGT-3'（SEQ ID N0.5);R-5' -TGCACTGCAGTCA AACCCCAAGTTTG-3'（SEQ ID NO. 6)。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶PstI進(jìn)行酶 切后，與經(jīng)過(guò)同樣限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切的PBI121表達(dá)載體進(jìn)行連接，獲得由CaMV35S啟 動(dòng)子啟動(dòng)的TaJRL2超量表達(dá)的質(zhì)粒載體。構(gòu)建好的載體通過(guò)熱擊法轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿 菌菌株中，通過(guò)含有50 μ g/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得陽(yáng)性克隆。參照1993 年Weeks發(fā)表在Plant Physiol第102期1077 -1084頁(yè)上的文章中的材料與方法，以幼胚 短暫培養(yǎng)產(chǎn)生的可以較高頻率再生出可育植株的愈傷組織為受體，采用基因槍法將Actin 啟動(dòng)子控制下的Tazmhl22基因?qū)胄←湶牧螧obwhite中，將基因槍轉(zhuǎn)化后的愈傷放置于 含有30mg/L G418的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，剪取獲得的再生苗葉片，提取DNA進(jìn)行PCR 檢測(cè)，獲得Tazmhl22超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥。統(tǒng)計(jì)T3代轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥千粒 重?cái)?shù)據(jù)。結(jié)果表明，以未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的小麥材料Bobwhite為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因植株千粒重得到提 高（表1)。
[0028] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種小麥富脯氨酸類蛋白1&觀1!122，其特征在于氨基酸序列如3￡〇10勵(lì)：2所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼權(quán)利要求1所述的小麥富脯氨酸類蛋白Tazmhl22的基 因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于出發(fā)載體為任何一種可以引導(dǎo)外 源基因在植物中超量表達(dá)的載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于將所述的小麥富脯氨酸類蛋白 Tazmhl22編碼基因插入PBI121表達(dá)載體PstI酶切位點(diǎn)所得。
7. 權(quán)利要求2所述的基因在品種改良中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求2所述的基因在提高小麥千粒重 中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求4?6中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體在品種改良中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求4?6中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá) 載體在提高小麥千粒重中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104497111SQ201310726948
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】馬正強(qiáng), 賈海燕, 馬省偉, 馬麗 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)