專利名稱：與小麥千粒重和粒長主效qtl緊密連鎖的分子標(biāo)記及其獲取方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥分子生物技術(shù)與育種應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說是ー種與增加小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其獲取方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，因此高產(chǎn)小麥品種的選育一直被育種家高度重視。小麥產(chǎn)量性狀是復(fù)雜的數(shù)量 性狀，受多個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)(Quantitative traitlocus, QTL)控制，具有遺傳カ低、受環(huán)境影響大、選擇難度高的特性，所以在選育高產(chǎn)小麥品種時(shí)，傳統(tǒng)的育種方法常存在時(shí)間長、耗費(fèi)大、成本高、成果小的問題。分子標(biāo)記輔助育種是ー種采用與特定性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記作為輔助手段進(jìn)行育種的有效方法，具有不受環(huán)境條件限制、在植物發(fā)育的各個(gè)組織和生育時(shí)期均可檢測、選擇效率高的優(yōu)勢。研究證明，主要受籽粒大小性狀影響的千粒重是最穩(wěn)定的產(chǎn)量直接構(gòu)成因素(Giura and Saulescu,Euphytica. 89: 77-80，1996) ;Snape等曾報(bào)道過籽粒大小與產(chǎn)量高度相關(guān)(Euphytica.154: 401-408，2007)?？梢?，小麥的產(chǎn)量與籽粒大小和千粒重具有顯著相關(guān)性。因此，研究千粒重和桿粒大小基因，通過分子標(biāo)記技術(shù)，提聞小麥桿粒大小和千粒重獲得聞廣小麥新品種，在育種工作中具有極其重要的意義。小麥山農(nóng)品系0431是1994年“國際冬春麥雜交篩選圃”(美國，康奈爾大學(xué))的F3·合“Grtpi85504 // MI76-77-S29 / ALD”選育的的ー個(gè)大粒、抗病(條紋病、葉銹病、白粉病、根腐病)和抗干熱風(fēng)的品系，綜合農(nóng)藝性狀好，是研究千粒重和籽粒大小基因的優(yōu)異種質(zhì)資源。目前，尚未有與其千粒重和粒長主效數(shù)量基因位點(diǎn)QTL相連鎖的分子標(biāo)記報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其獲取方法和應(yīng)用，通過發(fā)明獲得的與千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，來檢測小麥品種或品系中是否具有増加千粒重和粒長的QTL，以加快小麥高產(chǎn)品種的選育進(jìn)程。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明所提供的ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記為wmc386和barc216，其所述分子標(biāo)記wmc386的引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO: I所述、右端核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所述；所述分子標(biāo)記如的引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述、右端核苷酸序列如SEQ ID N0:4所述。ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，它包括以下步驟采用分子標(biāo)記wmc386的引物
左端核苷酸序列 ATCACTGAAACGAAATGAGCGG (如 SEQ ID NO: I 所述)
右端核苷酸序列 TGGTTGGCGGTTTTTCTCTACA (如 SEQ ID NO:2 所述)和分子標(biāo)記barc216的引物
左端核苷酸序列 TGACGACCCAATCCATAGACA (如 SEQ ID N0:3 所述)、
右端核苷酸序列 GGTGATTATTCGTGAGTTCCCTGTG (如 SEQ ID NO:4 所述)
對小麥品系山農(nóng)0431的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為20 μ 1，H2O 5. 75μ 1，10XPCR緩沖液 10.0 yl，Taq酶 0.25 μ 1，左右端引物 2.0 μ I,DNA 2. O μ I ;擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4 min;94°C變性40 s，55°C退火45 s，72°C延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ;10°C保存；擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為190 bp和100 bp，即得到與小麥千粒重和粒長主效QTL連鎖的分子標(biāo)記。 本發(fā)明所述的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記在選育高產(chǎn)小麥中的應(yīng)用，即為將與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記用于檢測小麥品種或品系的方法，該方法它包括以下步驟
a.用wmc386和barc216的標(biāo)記引物對小麥品種或品系的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR 擴(kuò)增體系為 20 μ ，包含 H2O 5. 75 yl，10XPCR 緩沖液 10. O μ ，Taq 酶 0.25 μ I,左右端引物2.0 μ I,DNA 2.0 μ I ;擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4 min;94°C變性40 s，55°C退火45 s，72°C延伸50 S，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ;10°C保存；
b.將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如wmc386的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為190 bp的分子標(biāo)記和barc216的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為100 bp的分子標(biāo)記同時(shí)出現(xiàn)，則該小麥品種或品系為具有増大千粒重和粒長的基因的的品種或品系，否則，該小麥品種或品系屬于不具有増大千粒重和粒長基因的品種或品系。本發(fā)明提供的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的篩選方法，它包括以下步驟
(i)以小麥品系山農(nóng)0431為母本、小麥品種魯麥21為父本進(jìn)行雜交得到FpF1自交產(chǎn)生F2，采用單粒傳法獲得含有177個(gè)株系的F7代RIL群體；
(ii)用改良CTAB法(VanderBeek et al.，1992)提取所述RIL群體各株系的DNA，采用多樣性微陣列技術(shù)標(biāo)記(DArTs標(biāo)記)、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR標(biāo)記)和基于表達(dá)序列標(biāo)簽的簡單重復(fù)序列標(biāo)記(EST-SSR標(biāo)記)對所述株系進(jìn)行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
(iii)利用MAPMAKER3. O作圖軟件將獲得的所述RIL群體的基因型資料構(gòu)建小麥的分子遺傳圖譜，其LOD ^ 3. O ；
(iv)將所述RIL群體進(jìn)行田間種植，并對RIL群體的各株系分別進(jìn)行表型調(diào)查，獲得各株系的千粒重和粒長的特征數(shù)據(jù)；
(V)利用MAPMAKER 3. O和Windows QTL Cartographer 2· 5作圖軟件,米用復(fù)合區(qū)間作圖法，對每個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型資料與對應(yīng)每個(gè)株系的千粒重和粒長進(jìn)行連鎖分析，在LOD彡3. O時(shí)，染色體5Β上的妙-#/ -財(cái)f區(qū)間中千粒重QTL和粒長QTL的峰值均在wmc386-barc216區(qū)間；
(vi)其勝 cJ浙和如標(biāo)記引物在小麥品系山農(nóng)0431的DNA中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為190 bp和100 bp，即為與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記。在上述方法中所采用的MAPMAKER3. O,Windows QTL Cartographer 2.5軟件均為目前進(jìn)行遺傳作圖和QTL分析的常用軟件，屬于市售商品，可以通過商業(yè)渠道購得。本發(fā)明所述小麥品系山農(nóng)0431的DNA是指對小麥品系山農(nóng)0431植株的葉片分離提取后獲得的DNA。本發(fā)明所述8%聚丙烯酰胺凝膠是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7. 8 g丙烯酰胺和O. 2 g的甲叉丙烯酰胺。
本發(fā)明公開的小麥千粒重和粒長緊密連鎖的分子標(biāo)記wmc386和barc216充分體現(xiàn)了小麥品種或品系的千粒重和粒長的主效QTL，通過該分子標(biāo)記對小麥衍生品種或品系PCR擴(kuò)增，可以很快捷地對小麥品種或品系是否具有千粒重和粒長的QTL進(jìn)行判斷，從而可以快速篩選出具有増加千粒重和粒長QTL的小麥品種或品系，加快高產(chǎn)小麥品種的選育進(jìn)程。將本發(fā)明提供的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記方法用于小麥育種，不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了聞廣小麥品種或品系的選擇效率和質(zhì)量。


圖I為小麥品系山農(nóng)0431的千粒重和粒長主效QTL在染色體5B上的作圖區(qū)間。圖I中空心長方形代表染色體，中間的實(shí)心黑圈代表著絲粒位置，右側(cè)是分子標(biāo)記的名稱，左側(cè)數(shù)字是標(biāo)記之間的遺傳距離，単位是CM ;圖中共有兩種分子標(biāo)記，“《Pt”和“rPt”為DArTs標(biāo)記，bare、gwm與wmc均為SSR標(biāo)記,標(biāo)有黑色下劃線的標(biāo)記為wmc386和barc216 ;染色體左下方的斜線填充的長方形表示QTL作圖區(qū)間，其中GL代表粒長性狀；TGff代表千粒重性狀。圖2為小麥品系山農(nóng)0431為親本的F7代RIL群體的18個(gè)衍生品系用wmc386標(biāo)記弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳條帶圖。圖3為小麥品系山農(nóng)0431為親本的F7代RIL群體的18個(gè)衍生品系用如標(biāo)記弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳條帶圖。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于進(jìn)一歩詳細(xì)說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例I
ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，
采用標(biāo)記引物wmc386,
左端引物序列 ATCACTGAAACGAAATGAGCGG (如 SEQ ID NO: I 所述)
右端引物序列 TGGTTGGCGGTTTTTCTCTACA (如 SEQ ID NO:2 所述)
和標(biāo)記引物barc216,
左端引物序列 TGACGACCCAATCCATAGACA (如 SEQ ID NO:3 所述)
右端引物序列 GGTGATTATTCGTGAGTTCCCTGTG (如 SEQ ID N0:4 所述)
對小麥品系山農(nóng)0431的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為20 μ 1，H2O 5. 75μ 1，10XPCR緩沖液 10.0 yl，Taq酶 0.25 μ 1，左右端引物 2.0 μ I,DNA 2. O μ I ;擴(kuò)增條件為94 °C預(yù)變性4 min; 94 °C變性40 S，55 °C退火45 s，72°C延伸50 S，35個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min ;10°C保存；所使用的PCR儀型號為BIO_RAD S1000 THERMAL CYCLER (本發(fā)明中所有PCR擴(kuò)增均采用該型號PCR儀);擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為190 bp和100 bp,即為小麥千粒重和粒長主效QTL的分子
ο本發(fā)明提供的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的篩選方法，它包括以下步驟
(i)以大粒小麥品系山農(nóng)0431為母本、以普通小麥品種魯麥21為父本進(jìn)行雜交得到雜種F1, F1自交產(chǎn)生F2，采用單粒傳法 獲得含有177個(gè)株系的F7代RIL群體；
(ii)用改良的CTAB法，即改良的十六烷基三甲基溴化銨法(VanderBeek et al.，1992)提取上述RIL群體各株系的DNA，采用多祥性微陣列技術(shù)標(biāo)記(DArTs標(biāo)記)、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR標(biāo)記)和基于表達(dá)序列標(biāo)簽的簡單重復(fù)序列標(biāo)記(EST-SSR標(biāo)記)對所述株系進(jìn)行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
其中SSR標(biāo)記和EST-SSR標(biāo)記分析是將篩選株系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在所述8%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離分析，根據(jù)分子標(biāo)記篩選結(jié)果，篩選出親本間有多態(tài)的引物，親本間有多態(tài)的引物在所選株系中進(jìn)行分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；DArTs標(biāo)記分析是通過與芯片雜交的技術(shù)來辨別不同基因組之間多態(tài)性的方法，將各株系基因組DNA經(jīng)過兩種不同切割頻率的限制性內(nèi)切酶酶切，再利用切割頻率低的限制性內(nèi)切酶識別序列的接頭與酶切片斷相連接，繼而通過與該酶切接頭相對應(yīng)的引物來實(shí)現(xiàn)對該特異片斷的PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增子用于構(gòu)建克隆文庫，進(jìn)而將其經(jīng)過熒光標(biāo)記，經(jīng)變性后點(diǎn)于芯片上作為探針。所要檢測的目標(biāo)DNA也需經(jīng)過同樣的內(nèi)切酶切割和PCR擴(kuò)增，然后就可與經(jīng)過熒光標(biāo)記的靶序列探針來雜交，獲得所述RIL群體的基因型資料；
改良的CTAB法提取葉片中DNA的步驟為取O. 15 O. 2 g新鮮葉片放入2 ml離心管中，迅速放入液氮中至少10 S，快速磨成細(xì)粉；加入I ml已預(yù)熱至65°C的CTAB提取液，65°C溫育I h，每20 min顛倒混勻離心管或者輕微震蕩溫育；置于4°C冰箱或室溫冷卻至15°C以下；加入I ml溫度4°C的按體積比為1:1的酚和氯仿，上下混勻30 min，然后1000rpm離心20 min ;取700 μ I上清液,加入等體積的體積比為24:1的氯仿-異戍醇,上下混勻30 min,保證樣品與氯仿充分混和；10000 rpm離心20 min ;取上清液500 μ I,加入等體積的冰異丙醇，輕輕上下顛倒管子15次，可以看到核酸沉淀；4°C冰箱靜置30 min左右；10000 rpm離心30 min，棄上清液，I ml 70%的こ醇洗滌沉淀兩次；棄こ醇，吹干DNA，用250μ I I X TE 溶解 DNA ;加入 I. O μ I 2 mg/ml 的 RNase，37°C水浴 30 min 去除 RNA，即得到所需 DNA ；
(iii)利用MAPMAKER3. O作圖軟件，將獲得的RIL群體的基因型資料構(gòu)建具有740個(gè)標(biāo)記的小麥的分子遺傳圖譜，以LOD彡3. O為標(biāo)準(zhǔn)；其中740個(gè)標(biāo)記是由617個(gè)DArTs、118個(gè)SSR和5個(gè)EST-SSR組成；
(iv)將RIL群體進(jìn)行了兩年共六個(gè)試驗(yàn)環(huán)境的田間種植及表型鑒定，分別考查不同年份和不同環(huán)境條件下的各個(gè)株系的籽粒性狀和千粒重，其中兩年六個(gè)試驗(yàn)環(huán)境即2010年泰安、2011年泰安、2011年菏澤、2011年泰安農(nóng)科院、2011年煙臺(tái)和2011年淄博。其中小麥種植方法RIL群體中每個(gè)株系種植5行，行長2 m、行間距25 cm、每行種植70粒種子，正常生長及收獲；千粒重測定方法將收獲后各株系的小麥種子取500粒稱重，重復(fù)3次，取平均值計(jì)算千粒重；粒長測定方法將收獲后各株系的小麥種子取20粒，首尾相接擺成直線量長度，重復(fù)3次，計(jì)算籽粒粒長。(V)利用 MAPMAKER 3. O 和 Windows QTL Cartographer 2.5 作圖軟件的前后回歸方法，以LOD ^ 3. O為標(biāo)準(zhǔn)，對每個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型資料與對應(yīng)每個(gè)株系的千粒重和粒長進(jìn)行連鎖分析并作 (vi)由QTL分析可得在染色體5B上分別發(fā)現(xiàn)4個(gè)環(huán)境條件下重復(fù)出現(xiàn)千粒重QTL和5個(gè)環(huán)境條件下重復(fù)出現(xiàn)粒長QTL峰值的區(qū)間為wmc386-barc216，如職I、表I所示。表I千粒重和粒長的QTL分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記為wmc386和barc216，其所述分子標(biāo)記wmc386的引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO: I所述、右端核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述；所述分子標(biāo)記如的引物左端核苷酸序列如SEQID NO:3所述、右端核苷酸序列如SEQ ID N0:4所述。
2.ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于它包括以下步驟 以wmc386和barc216標(biāo)記弓I物對小麥品系山農(nóng)0431的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為H20 5.75 μ 1，10XPCR緩沖液10. O μ 1，Taq酶O. 25 μ 1，左右端引物2.0μ 1，DNA 2. O μ I ;擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性 4 min ;94°C變性 40 s，55°C退火 45 s，72°C延伸50 S，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ;10°C保存；擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為190 bp和100 bp，即為小麥千粒重和粒長主效QTL的分子標(biāo)記；其中wmC386標(biāo)記引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO: I所述、右端核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所述標(biāo)記引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所述、右 端核苷酸序列如SEQ ID N0:4所述。
3.—種檢測小麥品種或品系的方法，其特征在于它包括以下步驟， a.用wmc386和barc216的標(biāo)記引物對小麥品種或品系的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR 擴(kuò)增體系為 20 μ ，包含 H2O 5. 75 yl，10XPCR 緩沖液 10. O μ ，Taq 酶 0.25 μ I,左右端引物2.0 μ I,DNA 2.0 μ I ;擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4 min;94°C變性40 s，55°C退火45 s，72°C延伸50 S，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ;10°C保存； b.將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如wmc386的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為190 bp的分子標(biāo)記和barc216的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為100 bp的分子標(biāo)記同時(shí)出現(xiàn)，則該小麥品種或品系為具有増大千粒重和粒長的基因的品種或品系，否則，該小麥品種或品系屬于不具有増大千粒重和粒長基因的品種或品系。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于所述小麥品系山農(nóng)0431的DNA是指對小麥品系山農(nóng)0431植株的葉片分離提取后獲得的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于所述8%聚丙烯酰胺凝膠是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7. 8 g丙烯酰胺和O. 2 g的甲叉丙烯酰胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測小麥品種或品系的方法，其特征在于所述的小麥的品種或品系為以小麥品系山農(nóng)0431為親本，通過采用常規(guī)雜交并繁衍至F2代以上、組織培養(yǎng)或玉米與小麥雜交誘導(dǎo)單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種或品系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其獲取方法和應(yīng)用，采用標(biāo)記引物wmc386和barc216對小麥品系山農(nóng)0431的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為190bp和100bp，即為小麥千粒重和粒長主效QTL的分子標(biāo)記。本發(fā)明所提供的小麥千粒重和粒長主效QTL分子標(biāo)記可用于檢測小麥品種或品系中是否含有增加千粒重和粒長的QTL，以便快速篩選出具有增加千粒重和粒長的QTL的小麥品種或品系用于育種，可大大加快小麥高產(chǎn)品種的選育進(jìn)程。
文檔編號C12Q1/68GK102690822SQ201210178139
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者李斯深, 蒲艷艷 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)