專利名稱：用于抑制LeY糖抗原合成的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重組干涉質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異的DNA序列及根據(jù)該序列構(gòu)建的重組干涉質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一種較為難治的疾病，尚無理想的治療方法。目前，對腫瘤的 治療策略主要是采取外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等綜合手段，但每一種方法仍具有局 限性并可產(chǎn)生一定程度的毒副作用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種依據(jù)腫瘤特異糖抗原合成及腫瘤生長、浸 潤、轉(zhuǎn)移等分子機(jī)制所構(gòu)建的，用于抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶I和IV 的RNA干涉序列及重組干涉質(zhì)粒。本發(fā)明主要是應(yīng)用RNAi (RNAi，RNA interference) 技術(shù)以腫瘤的特異糖抗原為靶位點(diǎn)，抑制細(xì)胞表面Lewis Y(LeY)腫瘤寡糖抗原的合成。 LeY分子結(jié)構(gòu)為Fuc α 1 — 2Gal β — 4(Fuc α 1 — 3)GlcNAc),即通過設(shè)計(jì)并合成LeY腫 瘤寡糖抗原的關(guān)鍵酶巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶KFucosyltransferase I，簡稱FUT1)和巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶IAKFucosyltransferase IV，簡稱FUT4)基因的干涉序列，并采用分子克隆 重組技術(shù)構(gòu)建重組FUTl干涉質(zhì)粒(pSilencer-4. I-FUTISiRNA)和重組FUT4干涉質(zhì)粒 (pSilencer-4. l_FUT4SiRNA)，用于抗腫瘤藥物應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下1.設(shè)計(jì)并合成FUTl和FUT4基因的干涉序列應(yīng)用DNASTAR軟件分析了 GenBank中全部的人的FUT1/FUT4基因的同源序 列，F(xiàn)UT1/FUT4基因的編碼序列的全長分別為1098bp和1218bp，從SiRNA設(shè)計(jì)軟件 獲得的用于抗腫瘤生長的重組FUT1/FUT4的干涉質(zhì)粒的DNA模板序列中各選取7條 作為形成干涉序列的模板DNA序列，長度均為19bp。其中，所設(shè)計(jì)的FUTl基因的干 涉序列為FUT1-1 TGGCCGGTTTGGTAATCAG ；FUT1-2 :AGACTTTGCCCTGCTCACA ；FUT1-3 GAGGAGTACGCGGACTTGA ；FUT1-4 CAGATCCGCAGAGAGTTCA ； FUT1-5 CGGCATGGAGTGGTGTAAA ； FUT1-6 :TGGCCTTCCTGCTAGTCTG ；FUT1-7 TTCGCCTTTCCTCCCCTGC 這些序列在 FUTl 基因中 的位置如圖1所示。所設(shè)計(jì)的FUT4基因的干涉序列為FUT4-1 GCCTGGCAAGTAACCTCTT ； FUT4-2 :GTAACCTCTTCAACTGGAC ； FUT4-3 CGGACGTCTTTGTGCCTTA ； FUT4-4 CATGTGACCGTGGACGTGT ；FUT4-5 :GTTCTACCTGGCTTTCGAG ；FUT4-6 :CTCGTACCTGCTTTTCCTC ； FUT4-7 :GCGGAGGCAGCGCTGCCTG。這些序列在FUT4基因中的位置如圖2所示。2.構(gòu)建重組FUTl干涉質(zhì)粒和構(gòu)建重組FUT4干涉質(zhì)粒①根據(jù)SiRNA設(shè)計(jì)軟件獲得用于抗腫瘤生長的重組FUT1/FUT4的干涉質(zhì)粒的DNA 模板序列，它是以上述FUT1/FUT4基因的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的序列進(jìn)行干涉質(zhì)粒的構(gòu)建。②根據(jù)pSilencer-4. l-CMV-neo (Ambion，Inc)載體結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)插入載體的 FUT1/FUT4干涉質(zhì)粒的DNA模板序列，即以干涉載體的多克隆酶切位點(diǎn)(Hindlll、BamH I)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)與干涉載體有相同粘性末端的FUTl/FUT4SiRNA模板的DNA序列，分別構(gòu) 建 7 個(gè) FUTl 干涉質(zhì)粒pSilencer-4. 1-FUT1 -1 /FUT1-2/FUT1-3/FUT1-4/FUT1-5/FUT1 -6/
3FUT1-7；7 個(gè) FUT4 的干涉質(zhì)粒pSilencer-4. 1-FUT4-1 /FUT4-2/FUT4-3/FUT4-4/FUT4-5/ FUT4-6/FUT4-7。每條鏈的5、末端含有HindIII或BamH I的酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)。具 體序列如下FUTl-I (5，-3，)GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGAAGCTTCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTCTCTTGAACTGATTACCAAACCGGCCAGFUT1_2(5，-3，)GATCCAGACTTTGCCCTGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCAGGGCAAAGTCTGGAAGCTTCCAGACTTTGCCCTGCTCACATCTCTTGAATGTGAGCAGGGCAAAGTCTGFUT1_3(5，-3，)GATCCGAGGAGTACGCGGACTTGATTCAAGAGATCAAGTCCGCGTACTCCTCGGAAGCTTCCGAGGAGTACGCGGACTTGATCTCTTGAATCAAGTCCGCGTACTCCTCGFUT1_4(5，-3，)GATCCCAGATCCGCAGAGAGTTCATTCAAGAGATGAACTCTCTGCGGATCTGGGAAGCTTCCCAGATCCGCAGAGAGTTCATCTCTTGAATGAACTCTCTGCGGATCTGGFUT1_5(5，-3，)GATCCCGGCATGGAGTGGTGTAAATTCAAGAGATTTACACCACTCCATGCCGGGAAGCTTCCCGGCATGGAGTGGTGTAAATCTCTTGAATTTACACCACTCCATGCCGGFUT1_6(5，-3，)GATCCTGGCCTTCCTGCTAGTCTGTTCAAGAGACAGACTAGCAGGAAGGCCAGGAAGCTTCCTGGCCTTCCTGCTAGTCTGTCTCTTGAACAGACTAGCAGGAAGGCCAGFUT1_7(5，-3，)GATCCTTCGCCTTTCCTCCCCTGCTTCAAGAGAGCAGGGGAGGAAAGGCGAAGGA
AGCTTCCTTCGCCTTTCCTCCCCTGCTCTCTTGAAGCAGGGGAGGAAAGGCGAAGFUT4_1(5，-3，)GATCCGCCTGGCAAGTAACCTCTTCTCAAGAGAAAGAGGTTACTTGCCAGGCGGAAGCTTCCAGCCTGGCAAGTAACCTCTTTCTCTTGAGAAGAGGTTACTTGCCAGGCGFUT4-2(5:3~)GATCCGTAACCTCTTCAACTGGACTTCAAGAGAGTCCAGTTGAAGAGGTTACGGAAGCTTCCGTAACCTCTTCAACTGGACTCTCTTGAAGTCCAGTTGAAGAGGTTACGFUT4_3(5，-3，)GATCCCGGACGTCTTTGTGCCTTATTCAAGAGATAAGGCACAAAGACGTCCGGGAAGCTTCCCGGACGTCTTTGTGCCTTATCTCTTGAATAAGGCACAAAGACGTCCGGFUT4_4(5，-3，)GATCCCATGTGACCGTGGACGTGTTTCAAGAGAACACGTCCACGGTCACATGGGAAGCTTCCCATGTGACCGTGGACGTGTTCTCTTGAAACACGTCCACGGTCACATGGFUT4_5(5，-3，)GATCCGTTCTACCTGGCTTTCGAGTTCAAGAGACTCGAAAGCCAGGTAGAACGGAAGCTTCCGTTCTACCTGGCTTTCGAGTCTCTTGAACTCGAAAGCCAGGTAGAACG
FUT4_6(5，-3，)GATCCCTCGTACCTGCTTTTCCTCTTCAAGAGAGAGGAAAAGCAGGTACGAGGGAAGCTTCCCTCGTACCTGCTTTTCCTCTCTCTTGAAGAGGAAAAGCAGGTACGAGGFUT4_7(5，-3，) GATCCGCGGAGGCAGCGCTGCCTGTTCAAGAGACAGGCAGCGCTGCCTCCGCGGAAGCTTCCGCGGAGGCAGCGCTGCCTGTCTCTTGAACAGGCAGCGCTGCCTCCGCG③特異的序列合成(Takara公司)后，經(jīng)變性、退火形成55bp (含粘性末端 HindIII, BanH I)的SiRNA模板的雙鏈DNA序列。具體方法是將合成的用于干擾FUTl/ FUT4基因的SiRNA的模板DNA序列的兩條鏈，分別用10-100 μ 1去離子水或者TE (Tris-HCl EDTA)緩沖液溶解，并測定^Onm的吸光值，計(jì)算其DNA濃度。用去離子水或者TE稀釋 (10-500ng/y 1)。吸取稀釋的單鏈樣品加DNA退火緩沖液(含IOmM Tris (pH7. 4), 50mM NaCl，ImMEDTA)于90_98°C變性3_10分鐘，冷卻至37°C并維持1小時(shí)，于_20°C溫度保存此 退火產(chǎn)物，備用。④pSilencer-4. 1-FUTl/FUT4SiRNA 重組質(zhì)粒構(gòu)建取pSilencer-4. l-CMV-neo (10_500ng)于 37°C進(jìn)行 HindIII 和 BamH I 雙酶切 1-3 小時(shí)，酶切后純化產(chǎn)物與退火產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接反應(yīng)如下取1-20 μ 1退火產(chǎn)物、1-20 μ 1 載體酶切后純化產(chǎn)物、1-20 μ 1連接酶、1-20 μ 1連接緩沖液，最后加去離子水至10-200 μ 1 于16°c過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5CI大腸桿菌，利用氨芐青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆 子，小量提取質(zhì)粒后酶切鑒定，如圖3和圖4。將鑒定正確的克隆子進(jìn)行大量提取質(zhì)粒。研究表明腫瘤糖抗原的異常合成是惡性腫瘤增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移的主要原因，并為 其惡性轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志之一。特異的腫瘤糖抗原的合成是由糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性決定的， 并且糖抗原的合成水平與糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。FUT1/FUT4是合成LeY腫瘤寡 糖的關(guān)鍵酶。FUTl為α 1，2-巖藻糖化糖基轉(zhuǎn)移酶(a 1，2_FUT)，與LeY腫瘤寡糖抗原末端 α 1，2巖藻糖基的合成有關(guān)，催化合成α 1，2-巖藻糖苷鍵；而FUT4為α 1，3_巖藻糖化糖基 轉(zhuǎn)移酶(a 1，3_FUT)，催化合成α 1，3_巖藻糖苷鍵。LeY腫瘤寡糖抗原是細(xì)胞表面糖復(fù)合 物(糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖)中的糖鏈成分，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中合成異常增加，與 腫瘤增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移、臨床分期(分級)及預(yù)后密切相關(guān)。因此，通過下調(diào)FUTl和FUT4表 達(dá)水平將以降低LeY腫瘤寡糖抗原的合成量是有效的靶點(diǎn)，該方面的研究目前國內(nèi)外尚未 見報(bào)道。本發(fā)明利用RNA干涉技術(shù)，構(gòu)建重組FUTl和FUT4干涉質(zhì)粒，通過抑制腫瘤細(xì)胞特 異的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的合成和表達(dá)，降低LeY腫瘤寡糖抗原的合成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長、 浸潤和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)采用本發(fā)明構(gòu)建重組的FUTl和FUT干涉質(zhì)粒 為臨床腫瘤的靶向基因治療提供新的思路和手段，它不僅效果明顯而且毒副作用小、安全， 同時(shí)患者治療周期短，是一種高效、安全、經(jīng)濟(jì)的抗腫瘤模式。


圖1是本發(fā)明FUTl基因的干涉質(zhì)粒的DNA模板序列在基因上的位置圖。圖2是本發(fā)明FUT4基因的干涉質(zhì)粒的DNA模板序列在基因上的位置圖。圖3是本發(fā)明FUTl基因的干涉質(zhì)粒酶切鑒定分析圖。
圖4是本發(fā)明FUT4基因的干涉質(zhì)粒酶切鑒定分析圖。圖5是本發(fā)明干涉質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431腫瘤細(xì)胞后FUTl基因的RT-PCR分析圖。圖6是本發(fā)明干涉質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431腫瘤細(xì)胞后FUT4基因的RT-PCR分析圖。圖7是本發(fā)明FUTl干涉質(zhì)粒(FUT1-1和FUT1-2)轉(zhuǎn)染A431腫瘤細(xì)胞后LeY合成 量流式細(xì)胞檢測圖。圖8是本發(fā)明FOT4干涉質(zhì)粒(FOT4-1和FOT4-2)轉(zhuǎn)染A431腫瘤細(xì)胞后LeY合成 量流式細(xì)胞檢測圖。圖9是本發(fā)明FUTl干涉質(zhì)粒(FUT1-1和FUT1-2)轉(zhuǎn)染A431腫瘤細(xì)胞生長抑制作 用的圖。圖10是本發(fā)明FUT4干涉質(zhì)粒(FUT4-1和FUT4-2)轉(zhuǎn)染A431腫瘤細(xì)胞生長的抑 制作用的圖。圖11是本發(fā)明FUTl的不同干涉質(zhì)粒對增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)抑制作用的 圖。圖12是本發(fā)明FUT4的不同干涉質(zhì)粒對增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)的抑制作用 的圖。圖13是本發(fā)明影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)各組小鼠瘤體積的分析圖。圖14是本發(fā)明影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)各組小鼠瘤重量的分析圖。
具體實(shí)施例方式例1構(gòu)建重組FUTl干涉質(zhì)粒①根據(jù)SiRNA設(shè)計(jì)軟件獲得用于抗腫瘤生長的重組FUTl干涉質(zhì)粒的DNA模板序 列，它是以上述FUTl基因的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的序列進(jìn)行干涉質(zhì)粒的構(gòu)建。每條鏈的5、末 端含有HindIII或BamH I的酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)。具體如下FUTl-I (5，-3，)GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGAAGCTTCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTCTCTTGAACTGATTACCAAACCGGCCAGFUT1_2(5，-3，)GATCCAGACTTTGCCCTGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCAGGGCAAAGTCTGGAAGCTTCCAGACTTTGCCCTGCTCACATCTCTTGAATGTGAGCAGGGCAAAGTCTG②根據(jù)pSilencer-4. l-CMV-neo載體結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)插入載體的FUTl干涉質(zhì)粒 的DNA模板序列，即以干涉載體的多克隆酶切位點(diǎn)(HindIII、BamH I)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)與干涉 載體有相同粘性末端的FUTlSiRNA模板的DNA序列，分別構(gòu)建pSilencer-4. 1-FUT1-1和 pSilencer-4. I-FUT1-2 的干涉質(zhì)粒。③特異的序列合成(Takara公司)后，經(jīng)變性、退火形成55bp (含粘性末端 HindIIKBamH I)的SiRNA模板的雙鏈DNA序列。將合成的用于干擾FUTl基因的SiRNA的 模板DNA序列的兩條鏈，分別用ΙΟΟμΙ去離子水溶解，取Ιμ 去離子水按1 10的體積 比例稀釋，測定260nm的吸光值，計(jì)算其DNA濃度(約33 μ g/ml)，用去離子水稀釋至SOng/ μ 1，吸取每條鏈 10 μ 1 力卩 100 μ 1 IXDNA 退火緩沖液(含 IOmM Tris (ρΗ7· 4)，50mM NaCl， ImM EDTA)于98°C變性3分鐘，冷卻至37°C并維持1小時(shí)，于_20°C溫度保存此退火產(chǎn)物，
④pSilencer-4. I-FUTl重組干涉質(zhì)粒構(gòu)建對pSilencer-4. l-CMV-neo (90ng)于 37°C進(jìn)行 HindIII 和 BamH I 雙酶切 2 小時(shí)， 酶切后回收產(chǎn)物與退火產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接反應(yīng)如下取2μ 1退火產(chǎn)物、2 μ 1載體酶切后 純化回收產(chǎn)物、2 μ 1連接酶、2 μ 1連接緩沖液，最后加2 μ 1去離子水至10 μ 1于16°C過夜 連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌，利用氨芐青霉素(Amp)抗性篩選陽性克隆子，小量提 取質(zhì)粒后酶切鑒定。將鑒定正確的克隆子大量提取質(zhì)粒。例2構(gòu)建重組FUT4干涉質(zhì)粒①根據(jù)SiRNA設(shè)計(jì)軟件獲得用于抗腫瘤生長的重組FUT4干涉質(zhì)粒的DNA模板序 列，它是以上述FUT4基因的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的序列進(jìn)行干涉質(zhì)粒的構(gòu)建。每條鏈的5、末 端含有HindIII或BamH I的酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)。具體如下FUT4_1(5，-3，)GATCCGCCTGGCAAGTAACCTCTTCTCAAGAGAAAGAGGTTACTTGCCAGGCGGAAGCTTCCAGCCTGGCAAGTAACCTCTTTCTCTTGAGAAGAGGTTACTTGCCAGGCGFUT4-2(5:3~)GATCCGTAACCTCTTCAACTGGACTTCAAGAGAGTCCAGTTGAAGAGGTTACGGAAGCTTCCGTAACCTCTTCAACTGGACTCTCTTGAAGTCCAGTTGAAGAGGTTACG②根據(jù)pSilencer-4. l-CMV-neo載體結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)插入載體的FUT4干涉質(zhì)粒 的DNA模板序列，即以干涉載體的多克隆酶切位點(diǎn)(HindIII、BamH I)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)與干涉 載體有相同粘性末端的FU1MSiRNA模板的DNA序列，分別構(gòu)建pSilencer-4. 1-FUT4-1和 pSilencer-4. 1-FUT4-2 的干涉質(zhì)粒。③特異的序列合成(Takara公司)后，經(jīng)變性、退火形成55bp (含粘性末端 HindIII、BamH I)的SiRNA模板的雙鏈DNA序列。將合成的用于干擾FUT4基因的SiRNA 的模板DNA序列的兩條鏈，分別用50μ1去離子水溶解，取0.5μ1去離子水按1 10的體 積比例稀釋，測定260nm的吸光值，計(jì)算其DNA濃度，用去離子水稀釋至lOOng/μ 1，吸取每 條鏈 10 μ 1 力口 46 μ 1 IXDNA 退火緩沖液(含 IOmM Tris (ρΗ7· 4)，50mM NaCl，ImM EDTA)于 90°C變性10分鐘，冷卻至37°C并維持1小時(shí)，于_20°C溫度保存此退火產(chǎn)物，備用。④pSilencer-4. l_FUT4SiRNA 重組干涉質(zhì)粒構(gòu)建對pSilencer-4. l-CMV-neo (300ng)于 37°C 進(jìn)行 HindIII 和 BamH I 雙酶切 3 小 時(shí)，酶切后回收產(chǎn)物與退火產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接反應(yīng)如下取5μ 1退火產(chǎn)物、5μ 1載體酶切 后回收產(chǎn)物、5 μ 1連接酶、5 μ 1連接緩沖液，最后加去離子至50 μ 1于16°C過夜連接。連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌，利用氨芐青霉素(Amp)抗性標(biāo)記篩選陽性克隆子，小量提取質(zhì)粒 后酶切鑒定。將鑒定正確的克隆子大量提取質(zhì)粒。以下為本發(fā)明的檢測結(jié)果1. pSilencer-4. 1-FUT1/FUT4 SiRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 A431 腫瘤細(xì)胞，采用 RT-PCR檢 測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞FUT1/FUT4表達(dá)明顯下降，如圖5和圖6所示。2. pSilencer-4. 1-FUT1/FUT4 SiRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431腫瘤細(xì)胞后，采用流式細(xì) 胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)LeY的合成顯著降低，如圖7和圖8所示。3. pSilencer-4. 1-FUT1/FUT4 SiRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431腫瘤細(xì)胞，經(jīng)噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞生長顯著降低，如圖9和圖10所示。4. pSilencer-4. 1-FUT1/FUT4 SiRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 A431 腫瘤細(xì)胞，采用 Western blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)PCNA的表達(dá)量明顯減少，如圖11和圖12所示。5. pSilencer-4. I-FUT1-1/FUT4-1重組質(zhì)粒抑制動(dòng)物模型中腫瘤生長作用(1)用胰酶消化A431腫瘤細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用生理鹽水制備細(xì)胞懸液，并用臺 盼藍(lán)法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使每0. Iml生理鹽水中含A431細(xì)胞個(gè)數(shù)為2X106。取4_6周齡的 裸鼠(η = 6 8)，每只鼠右腋皮膚下注射0.1ml腫瘤細(xì)胞懸液。對照組等量注射生理鹽 水。(2)實(shí)驗(yàn)分為四組空白組、空載體組、FUTl-I干涉質(zhì)粒組和FUT4-1干涉質(zhì)粒組。 于注射A431腫瘤細(xì)胞懸液次日開始，每隔1天注射干涉質(zhì)粒(150 μ g/次/鼠)，共10次。 (3)每日觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組鼠的生長狀態(tài)、種植腫瘤大小變化，并稱重。實(shí)驗(yàn)持續(xù)22天后 處死裸鼠，并測量瘤體積(表1)和測定瘤重量(表2)。表1實(shí)驗(yàn)各組瘤體積的分析
權(quán)利要求
1.一種用于抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV所構(gòu)建的重組的巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶IV干涉序列FUT4-1，其特征在于其序列如下GCCTGGCAAGTAACCTCTT。
2.一種用于抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV所構(gòu)建的重組的巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶IV干涉質(zhì)粒，其特征在于它是以RNA干涉載體pSilencer-4. I-CMV neo的多克 隆特異酶切位點(diǎn)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)與干涉載體有相同粘性末端的FUT4SiRNA模板的DNA序列，構(gòu) 建1個(gè)FUT4的含F(xiàn)UT4-1干涉序列的干涉質(zhì)粒pSilencer_4. 1-FUT4-1。
3.一種用于抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV所構(gòu)建的重組的巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶IV干涉質(zhì)粒的制備方法，其特征在于①將合成的用于干涉FUT4基因的FUT4-1 干涉序列的模板DNA，用去離子水或者TE緩沖液溶解，測定260nm的吸光值，并計(jì)算DNA濃 度，②取溶解后的樣品加入DNA退火緩沖液中，于90-98°C變性3_10分鐘，冷卻后低溫保存 備用，③對RNA干涉載體pSilencer-4. 1-CMV-neo于37°C進(jìn)行特異限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生 與干涉序列匹配的粘性末端，④酶切產(chǎn)物純化后與②中制備保存的產(chǎn)物進(jìn)行連接，⑤將上 述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌并利用載體的抗性標(biāo)記篩選陽性克隆子，⑥提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶 切鑒定，⑦用酶切鑒定正確的克隆子制備質(zhì)粒。
4.一種用于抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV所構(gòu)建的重組的巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶IV干涉質(zhì)粒，其特征在于該重組的含F(xiàn)UT4-1干涉序列的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV干 涉質(zhì)粒作為制備抗腫瘤藥物應(yīng)用。
全文摘要
一種用于抑制LeY糖抗原合成的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV的RNA干涉序列及重組干涉質(zhì)粒，其主要內(nèi)容是設(shè)計(jì)并篩選出巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶I和IV的各7條FUT1/FUT4 SiRNA模板的DNA序列，分別以RNA干涉載體(pSilencer-4.1-CMV neo)的多克隆特異酶切位點(diǎn)為基礎(chǔ)構(gòu)建7個(gè)FUT1和7個(gè)FUT4的重組干涉質(zhì)粒，并應(yīng)用這些干涉質(zhì)粒作為抗腫瘤藥物。這些干涉質(zhì)粒具有明顯的抑制腫瘤生長的作用，是一種高效、安全、經(jīng)濟(jì)的腫瘤基因治療模式。
文檔編號C12N15/85GK102094019SQ20101010858
公開日2011年6月15日 申請日期2007年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月15日
發(fā)明者劉基巍, 富力, 張振波, 燕秋, 王曉琦, 閆杰 申請人:燕秋