專利名稱：缺乏巖藻糖殘基的抗cd30單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生物(例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了PEG化一種抗體，一般可使一個或多個PEG基團(tuán)與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物反應(yīng)。優(yōu)選地，通過與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。本文所用的術(shù)語“聚乙二醇”包括用來衍生化其他蛋白質(zhì)的任何PEG形式，如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，將要PEG化的抗體是一種非糖基化的抗體。將蛋白質(zhì)PEG化的方法在本領(lǐng)域中公知，并且可以用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401384。
抗體工程化方法 如上所述，能夠利用具有此處公開的VH和VK序列的脫巖藻糖基化抗-CD30抗體，通過修飾VH和/或VK序列或與之連接的恒定區(qū)，產(chǎn)生新的抗-CD30抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明的抗-CD30抗體例如5F11、17G1或2H9的結(jié)構(gòu)特征，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的脫巖藻糖基化抗-CD30抗體，該抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如與人CD30結(jié)合。如上所述，例如，5F11、17G1或2H9的一個或多個CDR區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他CDR重組組合，從而產(chǎn)生另外的、重組改造的本發(fā)明的抗-CD30抗體。其他類型的修飾包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種VH和/或VK序列，或其一個或多個CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定實(shí)際制備(即表達(dá)為蛋白質(zhì))具有此處提供的一種或多種VH和/或VK序列，或其一個或多個CDR區(qū)的抗體。而是用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生由原始序列衍生的“第二代”序列，然后制備該“第二代”序列，并將其表達(dá)為蛋白質(zhì)。
因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗-CD30抗體的方法，包括 (a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO7、8和9的CDR1序列、選自SEQ ID NO10、11和12的CDR2序列、和/或選自SEQ ID NO13、14和15的CDR 3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO16、17和18的CDR1序列、選自SEQ ID NO19、20和21的CDR2序列、和/或選自SEQID NO22、23和24的CDR3序列； (b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和 (c)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)所述改變的抗體序列。然后可以使用本文公開的方法將這樣制備的改變的抗體序列制成脫巖藻糖基化的形式，以獲得脫巖藻糖基化的改變的抗-CD30抗體。
改變的抗體的功能特性可以用本領(lǐng)域中使用的和/或此處所還的，如實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(例如流式細(xì)胞術(shù)、結(jié)合測定、ADCC測定)來評價。
在改造本發(fā)明抗體的方法的某些實(shí)施方案中，可以沿全部或部分抗-CD30抗體編碼序列隨機(jī)或選擇性引入突變，并可以針對結(jié)合活性和/或如此處所述的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗-CD30抗體。突變方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679也記載了利用計(jì)算篩選方法優(yōu)化抗體的生理化學(xué)性質(zhì)的方法。
編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子 本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。本文使用的術(shù)語“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選雙鏈DNA。這些核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本領(lǐng)域公知的其他方法與其他細(xì)胞成分或其他摻雜物(例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì))分離純化時，核酸是“分離的”或“基本上純的”。參見，F(xiàn).Ausubel等ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本發(fā)明的核酸可以是(例如)DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸是cDNA分子。
本發(fā)明的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對于雜交瘤(例如，由下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對于(例如使用噬菌體展示技術(shù))從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體，可以從文庫中回收編碼該抗體的核酸。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼5F11、17G1或2H9單克隆抗體的VH和VL序列的核酸分子。編碼5F11的VH序列的DNA序列顯示在SEQ ID NO30中。編碼5F11的VL序列的DNA序列顯示在SEQ IDNO33中。編碼17G1的VH序列的DNA序列顯示在SEQ ID NO31中。編碼17G1的VL序列的DNA序列顯示在SEQ ID NO34中。編碼2H9的VH序列的DNA序列顯示在SEQ ID NO32中。編碼2H9的VL序列的DNA序列顯示在SEQ ID NO35中。
一旦獲得編碼VH和VL片段的DNA片段，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼VL或VH的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性連接體的另一個DNA片段有效連接。在本文中使用的術(shù)語“有效連接”意思是兩個DNA片段連接在一起，使得這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持在閱讀框內(nèi)。
通過將編碼VH的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VH區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH出版號91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選IgG1或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因來說，編碼VH的DNA可以與只編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另外一種DNA分子有效連接。
通過將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VL區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH出版號91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，但是最優(yōu)選κ恒定區(qū)。
為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一個片段有效連接，使得VH和VL序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其VL和VH區(qū)通過該柔性連接體連接(參見，例如Bird等(1988)Science 242423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；McCafferty等(1990)Nature 348552-554)。
本發(fā)明的核酸組合物通常在來自于cDNA、基因組或其混合物的天然序列(除了修飾的限制性位點(diǎn)等以外)中可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行突變，以提供基因序列。對于編碼序列來說，這些突變可能影響氨基酸序列。具體地說，涉及基本同源于或來源于天然V、D、J、恒定、轉(zhuǎn)換和本文所述的其他這些序列的DNA序列(其中“來源于”是指一種序列與另一種序列相同或由其改進(jìn)而來)。
本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生 通過多種技術(shù)能制備本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256495所述的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然優(yōu)選體細(xì)胞雜交技術(shù)，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。
用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合程序也是公知的。
在各種實(shí)施方案中，抗體可以是，例如，人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標(biāo)鼠雜交瘤中獲得，并且使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其改造為含有非鼠(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見，例如，Cabilly等人的美國專利No.4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠CDR區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)(參見，例如，Winter的美國專利No.5,225,539，和Queen等人的美國專利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。在本領(lǐng)域中公知多種小鼠抗CD30抗體能夠用來產(chǎn)生嵌合或人源化抗CD30抗體，例如AC10、HeFi-1、Ber-H2、Ki-1、HRS-3、Irac、HRS-4、M44、M67和Ber-H8。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗CD30人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在此分別稱作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在此通稱為“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠(Medarex，Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內(nèi)源μ和κ鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474)856-859)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或κ表達(dá)降低，并且響應(yīng)于免疫，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，從而產(chǎn)生高親和力人IgGκ單克隆抗體(Lonberg，N.等(1994)，同上；綜述Lonberg，N.(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 11349-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，在下面的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等(1933)EMBO J.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文在此引入作為參考。進(jìn)一步參見，Lonberg和Kay的美國專利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；和Surani等人的美國專利No.5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公布號WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等人的PCT公布號WO 01/14424。
在另一實(shí)施方案中，可以用轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此稱為“KM小鼠”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中詳細(xì)描述。
再者，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-CD30抗體。例如，可以使用一種稱作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等人的美國專利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
而且，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-CD30抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，其被稱作“TC小鼠”；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722-727中描述。另外，本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology20889-894)，其能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-CD30抗體。
也可以使用篩查人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備本發(fā)明的人單克隆抗體。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。參見，例如，Ladner等人的美國專利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美國專利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美國專利No.5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美國專利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以用SCID小鼠制備本發(fā)明的人單克隆抗體，該SCID小鼠中重構(gòu)了人免疫細(xì)胞，因此在免疫時能夠產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這種小鼠在例如Wilson等人的美國專利No.5,476,996和5,698,767中描述。
人Ig小鼠的免疫 當(dāng)使用人Ig小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時，根據(jù)Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO01/14424所述，用純化的或富集的CD30抗原和/或重組CD30或CD30融合蛋白的制劑免疫該小鼠。優(yōu)選地，第一次輸注時小鼠為6-16周齡。例如，可以使用純化的或重組的CD30抗原的制劑(5-50μg)腹膜內(nèi)免疫人Ig小鼠。
產(chǎn)生抗CD30完全人單克隆抗體的詳細(xì)程序在PCT公布WO03/059282中描述。應(yīng)用各種抗原積累的經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應(yīng)答。但是，發(fā)現(xiàn)弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)在沒有佐劑時，全細(xì)胞具有高度免疫原性。在免疫方案進(jìn)程中可以用眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測免疫應(yīng)答。通過ELISA(如下所述)篩選血漿，用具有足夠抗-CD30人免疫球蛋白效價的小鼠進(jìn)行融合。用抗原對小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫，3天后處死并且取出脾臟。預(yù)期每次免疫可能需要進(jìn)行2-3次融合。每一種抗原一般免疫6-24小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另外，HCo7和HCo12轉(zhuǎn)基因可以雜交，產(chǎn)生具有兩種不同人重鏈轉(zhuǎn)基因(HCo7/HCo12)的一種小鼠。
產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生 為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖化細(xì)胞系(例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)融合。針對抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。例如，使用50％PEG，將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL 1580)融合。將細(xì)胞以大約2×105的密度接種于平底微量滴定板中，接著在含有20％胎克隆血清、18％“653”條件基質(zhì)、5％Origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小時加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。大約兩周之后，在用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA針對人單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對于人IgG仍然是陽性，則可以通過有限稀釋將單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。
為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)進(jìn)行親和層析。洗脫下來的IgG通過凝膠電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD280確定濃度?？蓪慰寺】贵w分成等份并且在-80℃下保存。
產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的產(chǎn)生 利用(例如)眾所周知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison，S.(1985)science 2291202)，也能在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行PCR擴(kuò)增或cDNA克隆)，獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，并將該DNA插入到表達(dá)載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術(shù)語“有效連接”意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)該抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相匹配的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分開的載體中，或者，更通常地，將兩個基因插入到同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體基因插入到表達(dá)載體中(例如，抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)連接，或者如果不存在限制性位點(diǎn)的活，則平端連接)。通過將本文描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得VH區(qū)段與載體中的CH區(qū)段有效連接，而VK區(qū)段與載體中的CL區(qū)段有效連接，可以產(chǎn)生任意抗體同種型的全長抗體基因。另外，或者可替代的，重組表達(dá)載體能編碼有利于宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆到載體中，使得信號肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的信號肽)。
除了抗體鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990))中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，例如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強(qiáng)子?？商娲乜梢允褂梅遣《菊{(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動子或β-珠蛋白啟動子。另外，調(diào)節(jié)元件也可由來自諸如SRα啟動子系統(tǒng)等不同來源的序列組成，SRα啟動子系統(tǒng)含有來自SV40早期啟動子的序列和人1型T細(xì)胞白血病病毒的長末端重復(fù)序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8466-472)。
除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于篩選載體已經(jīng)導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞(參見，例如，Axel等人的美國專利No.4,399,216,4,634,665和5,179,017)。例如，選擇性標(biāo)記基因一般給已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞帶來抗藥性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細(xì)胞中用于氨甲喋呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。
為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然在理論上可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞中表達(dá)，最優(yōu)選在哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體，因?yàn)檎婧思?xì)胞，特別是哺乳動物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能裝配和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據(jù)報道，抗體基因的原核表達(dá)無法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 612-13)。
用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選宿主細(xì)胞包括改變所表達(dá)的抗體的巖藻糖基化的細(xì)胞。例如，該宿主細(xì)胞可以是缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶因此該宿主細(xì)胞產(chǎn)生在其碳水化合物中缺乏巖藻糖的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，或者是表達(dá)糖蛋白修飾的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶因此在宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體具有增多的等分(bisecting)GlcNac結(jié)構(gòu)(可阻止糖基化)的宿主細(xì)胞。用于表達(dá)重組抗體的其他哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細(xì)胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220中描述的dhfr-CHO細(xì)胞，和DHFR選擇性標(biāo)記一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621所述)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。特別地，用于NSO骨髓瘤細(xì)胞的另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是WO 87/04462、WO89/01036和EP 338,841公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞中時，通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的時間，或更優(yōu)選地，培養(yǎng)足以使抗體分泌到宿主細(xì)胞所生長的培養(yǎng)基中的時間，而產(chǎn)生抗體。可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體。
免疫偶聯(lián)物 另一方面，本發(fā)明涉及與諸如細(xì)胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素等治療性部分偶聯(lián)的脫巖藻糖基化抗CD30抗體或其片段。這些偶聯(lián)物在此被稱為“免疫偶聯(lián)物”。包括一個或多個細(xì)胞毒素的免疫偶聯(lián)物被稱作“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對細(xì)胞有害(例如殺傷細(xì)胞)的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順鉑)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。
能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它們的衍生物。刺孢霉素抗體偶聯(lián)物的一個例子是可作為商品購得的(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。
可以利用本領(lǐng)域中使用的連接體技術(shù)將細(xì)胞毒素與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素與抗體偶聯(lián)的連接體類型的實(shí)例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的連接體?？梢赃x擇(例如)在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低pH切割或易被蛋白酶切割的連接體，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。
關(guān)于細(xì)胞毒素的類型、用于偶聯(lián)治療劑與抗體的連接體和方法的進(jìn)一步討論，參見Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell3207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 31089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53247-264。
本發(fā)明的抗體也可以與放射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性放射性藥物，也稱作放射性免疫偶聯(lián)物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯(lián)的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦111、釔90和镥177。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。放射性免疫偶聯(lián)物的例子可以作為商品獲得，包括ZevalinTM(IDECPharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能夠利用類似的方法使用本發(fā)明的抗體制備放射性免疫偶聯(lián)物。
本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可以用來修飾特定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。
將這種治療性部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，in Monoclonal Antibodies’84Biological And ClinicalApplications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”，in Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press1985)，和Thorpe等，“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
藥物組合物 另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。這樣的組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以含有與靶抗原上的不同表位結(jié)合或具有互補(bǔ)活性的抗體組合(或免疫偶聯(lián)物)。
本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯(lián)合治療中施用，即與其他藥劑聯(lián)用。例如，聯(lián)合治療可包括本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗CD30抗體聯(lián)合至少一種其他的抗腫瘤劑、抗炎劑或免疫抑制劑。這些治療劑包括甾體和非甾體抗炎藥(NSAIDS)，例如阿司匹林和其他水楊酸鹽，如高劑量的布洛芬(Motrin，Advil)、萘普生(Naprosyn)、舒林酸(奇諾力)、雙氯芬酸(Voltaren)、吡羅昔康(Feldene)、酮洛芬(Orudis)、二氟尼柳(Dolobid)、萘丁美酮(Relafen)、依托度酸(Lodine)、奧沙普秦(Daypro)、吲哚美辛(Indocin)和阿司匹林。可在聯(lián)合治療中使用的治療劑的其他例子在下面本發(fā)明抗體的應(yīng)用一節(jié)中更詳細(xì)地描述。
本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮給藥(如通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，可將活性化合物即抗體或免疫偶聯(lián)物用一種材料包裹，以保護(hù)該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。
本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指保持了親代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等無毒性無機(jī)酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機(jī)酸衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由諸如鈉、鉀、鎂、鈣等堿土金屬衍生的鹽，以及由諸如N，N’-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機(jī)胺衍生的鹽。
本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本發(fā)明藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?、植物油如橄欖油、和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯。例如通過應(yīng)用諸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> 這些組合物也可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含諸如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。
藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容以外，包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中摻入補(bǔ)充的活性化合物。
治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的。可以將組合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用諸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。
通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。
可以與載體材料組合制備單一劑型的活性成分的量根據(jù)所治療的受試者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合制備單一劑型的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100％計(jì)，這個量的范圍是大約0.01％至大約99％的活性成分，優(yōu)選大約0.1％至大約70％，最優(yōu)選大約1％至大約30％的活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體相組合。
調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的所需反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時間施用幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對本發(fā)明劑量單位形式的具體說明取決于且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對于配制這種用于治療個體敏感性的活性化合物的限制。
對于抗體的給藥，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重，或在1-10mg/kg范圍內(nèi)。一個示例性的治療方案需要每周給藥一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3個月一次、或每3-6個月一次。本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗CD30抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該抗體使用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周1mg/kg體重。
在某些方法中，同時施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內(nèi)。抗體通常多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測定患者中抗靶抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以達(dá)到約1-1000μg/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25-300μg/ml。
可替代地，抗體也可以作為持續(xù)釋放制劑來給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預(yù)防性的還是治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長時間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應(yīng)用中，有時需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進(jìn)展減輕或停止，優(yōu)選直到患者表現(xiàn)為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預(yù)防性方案給患者給藥。
本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可能變化，以獲得可有效實(shí)現(xiàn)對特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)，而對患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括應(yīng)用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時間、所應(yīng)用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時間、與應(yīng)用的特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。
本發(fā)明的抗CD30抗體的“治療有效劑量”優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重程度降低、疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時間增加、或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對于癌性腫瘤的治療，相對于未接受治療的受試者，“治療有效劑量”優(yōu)選地使細(xì)胞生長或腫瘤生長抑制至少約20％，更優(yōu)選至少約40％，更優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約80％?；衔镆种颇[瘤生長的能力可以在預(yù)測對人類腫瘤的功效的動物模型系統(tǒng)中評價。另外，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試驗(yàn)檢查該化合物的體外抑制能力，來評價組合物的這種性能。治療有效量的治療性化合物能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解受試者的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)如下因素確定該量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重程度和選擇的特定組合物或給藥途徑。
本發(fā)明的組合物可以利用本領(lǐng)域公知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結(jié)果而不同。本發(fā)明抗體的優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。本文所用的短語“腸胃外給藥”是指腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。
可替代地，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部。
活性化合物可以與保護(hù)化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護(hù)或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，Sustainedand controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治療性組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國專利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國專利No.4,487,603,該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入式微量輸注泵；美國專利No.4,486,194，該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利No.4,447,233，該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國專利No.4,447,224，該專利公開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入式輸注裝置；美國專利No.4,439,196，該專利公開了具有多腔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國專利No.4,475,196，該專利公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利在此引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊。
在某些實(shí)施方案中，可以配制本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體以確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時)，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質(zhì)體可以包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個或多個部分，從而增強(qiáng)定向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等人的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。
本發(fā)明的應(yīng)用和方法 本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體、抗體組合物和方法，具有涉及診斷和治療與CD30表達(dá)有關(guān)的疾病的許多體外和體內(nèi)診斷和治療應(yīng)用。例如，這些分子可以施用于(例如)在體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，或者例如在體內(nèi)施用于人類受試者，從而治療、預(yù)防或診斷多種疾病。本文使用的術(shù)語“受試者”包括人和非人動物。非人動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、牛、馬、豬、雞、鳥類、兩棲類動物和爬行類動物。優(yōu)選的受試者包括患有以CD30表達(dá)為特征的疾病的人類患者。當(dāng)抗CD30抗體與另一種藥物一起給藥時，這兩種藥物可以相繼或同時給藥。
在體內(nèi)和體外施用本發(fā)明的抗體組合物(例如抗體或免疫偶聯(lián)物)的適當(dāng)途徑在本領(lǐng)域中公知，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，抗體組合物可以通過注射(例如靜脈內(nèi)或皮下)給藥。使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或制劑。
在一個實(shí)施方案中，可以在開始時檢測本發(fā)明的抗體與體外治療或診斷應(yīng)用有關(guān)的結(jié)合活性。例如，可以利用ELISA和流式細(xì)胞測定法檢測本發(fā)明的組合物。而且，可以測定這些分子引發(fā)至少一種效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性的活性，包括抑制表達(dá)CD30的細(xì)胞的生長和/或殺傷。測定效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC的方案在下面的實(shí)施例中描述。
A.檢測方法 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以用來檢測CD30的水平，或在膜表面上含有CD30的細(xì)胞的水平，然后可以將這些水平與特定疾病癥狀相關(guān)聯(lián)。
在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測樣品中CD30抗原的存在或測定CD30抗原的量的方法，包括在允許在抗體或其部分與CD30之間形成復(fù)合物的條件下，將樣品和對照樣品與特異性結(jié)合CD30的脫巖藻糖基化抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸。然后檢測復(fù)合物的形成，其中樣品與對照樣品相比復(fù)合物形成的不同指示樣品中存在CD30抗原。例如，可以使用本發(fā)明的組合物進(jìn)行本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，如ELISA和流式細(xì)胞測定。
因此，在一個方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測樣品中CD30(例如人CD30抗原)的存在或測定CD30的量的方法，包括在允許在抗體或其部分與CD30之間形成復(fù)合物的條件下，將樣品和對照樣品與特異性結(jié)合CD30的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸。然后檢測復(fù)合物的形成，其中樣品與對照樣品相比復(fù)合物形成的不同指示樣品中存在CD30。
本發(fā)明的組合物也可以用來靶向表達(dá)CD30的細(xì)胞，例如用于標(biāo)記這些細(xì)胞。為此應(yīng)用，可以將結(jié)合劑與可以檢測的分子連接。因此，本發(fā)明提供用于離體或在體內(nèi)定位表達(dá)CD30的細(xì)胞的方法?？蓹z測標(biāo)記物可以是，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。
B.CD30+細(xì)胞的生長的抑制 這些抗體可以用來抑制或阻斷CD30功能，這又可以與某些疾病癥狀的預(yù)防或緩解相關(guān)聯(lián)，由此暗示CD30與該疾病有關(guān)。與非疾病狀態(tài)相比疾病狀態(tài)期間CD30表達(dá)的差異可以如下確定在允許在抗體與CD30之間形成復(fù)合物的條件下，使來自該疾病患者的試樣和對照樣品與抗CD30抗體接觸。檢測在抗體與CD30之間形成的任何復(fù)合物，并對樣品和對照進(jìn)行比較。
例如，抗體可以用來在體內(nèi)或在體外引起一種或多種下列生物活性抑制表達(dá)CD30的細(xì)胞的生長和/或殺傷；在人效應(yīng)細(xì)胞存在下介導(dǎo)表達(dá)CD30的細(xì)胞的吞噬作用或ADCC；抑制可溶性CD30的脫落，以阻止CD30配體與CD30結(jié)合，抑制IL-4表達(dá)或介導(dǎo)Th2表型的表達(dá)，例如在低劑量下。如本文所述，與巖藻糖基化形式的抗體相比，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的ADCC活性。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制CD30+細(xì)胞的生長的方法，包括在足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的條件下，使所述細(xì)胞接觸脫巖藻糖基化抗CD30抗體。例如，該細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，抗CD30抗體是人抗體。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以用來調(diào)節(jié)靶細(xì)胞上的CD30水平，例如通過對細(xì)胞表面上的受體加帽(capping)以及將其清除?？?Fc受體抗體的混合物也可以用于該目的。
靶標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如與本發(fā)明的組合物連接的效應(yīng)細(xì)胞，也可以用作治療劑。用于靶向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人白細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。其他細(xì)胞包括嗜酸性細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其他帶有IgG或IgA受體的細(xì)胞。需要時，效應(yīng)細(xì)胞可以從所治療的受試者中獲得。靶標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞可以作為在生理學(xué)可接受的溶液中的細(xì)胞懸浮液給藥。施用的細(xì)胞數(shù)可以是108-109個的數(shù)量級，但是根據(jù)治療目的而不同。通常，該量足以獲得在靶細(xì)胞處例如在表達(dá)CD30的腫瘤細(xì)胞處的局部化，以及通過例如吞噬作用實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的殺傷。給藥途徑也可以不同。
應(yīng)用靶標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞的治療可以與其他清除靶細(xì)胞的技術(shù)一起進(jìn)行。例如，使用本發(fā)明的組合物和/或具有這些組合物的效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤治療可以與化學(xué)治療一起使用。另外，可以應(yīng)用聯(lián)合免疫治療將兩種不同的細(xì)胞毒性效應(yīng)群體導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞排斥。
C.免疫偶聯(lián)物的應(yīng)用和聯(lián)合治療 在一個實(shí)施方案中，通過將化合物與抗體連接，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可以將靶化合物(例如治療劑、標(biāo)記物、細(xì)胞毒素、放射毒素、免疫抑制劑等)靶向至具有CD30細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。因此，本發(fā)明也提供用于離體或在體內(nèi)定位表達(dá)CD30的細(xì)胞的方法(例如應(yīng)用可檢測標(biāo)記物，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。可替代地，免疫偶聯(lián)物通過將細(xì)胞毒素或放射毒素靶向至CD30，也可以用來殺傷具有CD30細(xì)胞表面受體的細(xì)胞，如靶向至表達(dá)CD30的腫瘤細(xì)胞，由此消除腫瘤細(xì)胞，或靶向至表達(dá)CD30的抗原呈遞細(xì)胞，由此消除APC，作為抑制免疫應(yīng)答(例如在自身免疫病中)的手段。
在另外一些實(shí)施方案中，可以另外用調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或抑制)Fcγ或Fcγ受體的表達(dá)或活性的藥物治療受試者，例如用細(xì)胞因子治療受試者。在治療過程中施用的優(yōu)選細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。
在另一實(shí)施方案中，受試者可以另外用淋巴因子制品來治療?？梢允褂昧馨鸵蜃又破氛T導(dǎo)不高度表達(dá)CD30的癌細(xì)胞高度表達(dá)CD30。淋巴因子制品可以引起腫瘤細(xì)胞之間更均勻的CD30表達(dá)，這可導(dǎo)致更有效的治療。適合施用的淋巴因子制品包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子及其組合。它們可以靜脈施用。淋巴因子的合適的劑量為10,000至1,000,000單位/患者。
在另一實(shí)施方案中，可以對用本發(fā)明的抗體組合物治療的患者另外施用(在施用本發(fā)明的抗體之前、同時或之后)另一種治療劑，如增強(qiáng)或加強(qiáng)人抗體的治療效果的細(xì)胞毒劑或放射性毒劑。抗體可以與該治療劑連接(作為免疫復(fù)合物)，或者可以與該治療劑分開給藥。對于后者(分開給藥)，抗體可以在治療劑之前、之后或同時給藥，或者可以與其他已知治療(如抗癌治療，例如放射治療)共同應(yīng)用。這些治療劑特別包括，抗腫瘤劑，如多柔比星(阿霉素)、順鉑、硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、羥基脲，它們本身僅在對患者具有毒性或亞毒性的水平時有效。順鉑以100mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每21天1次。本發(fā)明的抗-CD30抗體或其抗原結(jié)合片段與化療劑的共同給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過對人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的不同機(jī)制起作用。這種共同給藥能夠解決由于發(fā)展耐藥性或腫瘤細(xì)胞抗原性改變(這將使它們對抗體沒有反應(yīng)性)引起的問題。
D.自身免疫病的治療 該組合物可以在體外或在體內(nèi)用于治療由CD30介導(dǎo)的或與CD30有關(guān)的疾病，例如，以CD30的表達(dá)(典型地，過量表達(dá))為特征的疾病，例如由巨噬細(xì)胞、活化的嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或NK細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，如移植排斥或移植物抗宿主病(GVHD)?？扇苄訡D30定期從表達(dá)CD30的細(xì)胞表面上脫落，已經(jīng)報道了在多種致瘤和自身免疫病患者的血清中sCD30水平升高。因此，本發(fā)明抗體的另一用途包括疾病的預(yù)防或治療，涉及阻斷或抑制sCD30的脫落。
通過抗體與CD30接觸(例如通過給受試者施用抗體)，CD30誘導(dǎo)這種活性的能力受到抑制，因此，相關(guān)疾病得到治療。抗體組合物可以單獨(dú)施用或與另外一種治療劑如免疫抑制劑一起施用，該另外一種治療劑和抗體組合物一起或協(xié)同作用，以治療或預(yù)防CD30介導(dǎo)的疾病。優(yōu)選的抗體與CD30特異性表位結(jié)合，因此有利地抑制CD30誘導(dǎo)的活性，但是不干擾結(jié)構(gòu)上相關(guān)的表面抗原的活性。組合物可以用于治療任何由CD30表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，包括但不限于自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，系統(tǒng)性硬化病、特應(yīng)性皮炎、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病、Omen綜合征、慢性腎衰竭、特發(fā)性血小板減少性紫癲(ITP)、炎性腸病(IBD；包括克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和乳糜瀉)、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、急性傳染性單核細(xì)胞增多、HIV、皰疹病毒相關(guān)的疾病、多發(fā)性硬化癥(MS)、溶血性貧血、甲狀腺炎、僵人綜合征、尋常天皰瘡和重癥肌無力(MG)。
E.癌癥的治療 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抑制受試者中CD30+腫瘤細(xì)胞(即表達(dá)CD30的腫瘤細(xì)胞)生長的方法，其中給受試者施用本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗CD30抗體，使CD30+腫瘤細(xì)胞的生長受到抑制。對于人類受試者，抗體優(yōu)選是人源化或人抗體。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是何杰金病腫瘤細(xì)胞。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)腫瘤細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞可以來自選自下組的疾病非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞淋巴瘤、成人T細(xì)胞淋巴瘤(ATL)、HIV相關(guān)體腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他CD30+T-細(xì)胞淋巴瘤和CD30+B細(xì)胞淋巴瘤。
該方法包括給受試者施用有效治療或預(yù)防疾病的量的本發(fā)明的抗體組合物?？贵w組合物可以單獨(dú)施用或與諸如細(xì)胞毒劑或放射性毒劑等另一種治療劑一起施用，該另一種治療劑與抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同起作用，以治療或預(yù)防與CD30表達(dá)相關(guān)的疾病。
藥盒 本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括藥盒，該藥盒包括本發(fā)明的抗體和使用說明。該藥盒可以進(jìn)一步含有一種或多種另外的試劑，如免疫刺激劑、細(xì)胞毒劑或放射性毒劑，或一種或多種本發(fā)明的其他抗體(例如，具有補(bǔ)充活性的人抗體，它與第一人抗體不同地與CD30抗原上的表位結(jié)合)。藥盒一般包括標(biāo)明藥盒內(nèi)容物目標(biāo)用途的標(biāo)簽。術(shù)語標(biāo)簽包括在藥盒上提供或與藥盒一起提供或以其他方式隨藥盒提供的任何書面或記錄材料。
本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實(shí)施例進(jìn)行闡述，不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為進(jìn)一步的限制。全部附圖和在本申請中引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開專利申請的內(nèi)容均在此引用作為參考。
實(shí)施例 實(shí)施例1脫巖藻糖基化抗CD30單克隆抗體的制備和表征 在該實(shí)施例中，在缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞系中表達(dá)完全人類抗CD30單克隆抗體，使得該細(xì)胞系產(chǎn)生在其碳水化合物中缺乏巖藻糖的蛋白質(zhì)。使用多種化學(xué)分析技術(shù)，包括毛細(xì)管電泳、氨基酸序列比較、通過質(zhì)譜分析的質(zhì)量差異、和通過毛細(xì)管等電聚焦的電荷差異，相對于巖藻糖基化抗CD30抗體(在含有巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的不同細(xì)胞系中表達(dá))檢測脫巖藻糖基化抗體，來確定抗體之間結(jié)構(gòu)和特征的差異。
抗CD30完全人類單克隆抗體5F11最早在PCT公開WO 03/059282中描述。5F11重鏈的氨基酸和核苷酸序列在

圖1A中顯示，5F11輕鏈的氨基酸和核苷酸序列在圖1B中顯示。將5F11重鏈和輕鏈可變區(qū)序列亞克隆到表達(dá)載體內(nèi)。將包括其信號序列和最佳Kozak序列的5F11κ可變區(qū)cDNA亞克隆為與人κ恒定區(qū)在閱讀框內(nèi)。將包括其信號序列和最佳Kozak序列的5F11重鏈可變區(qū)cDNA亞克隆為與人γ1重鏈恒定區(qū)在閱讀框內(nèi)。輕鏈和重鏈表達(dá)由人遍在蛋白C啟動子引導(dǎo)(Nenoi，M.等人.Gene 175179，1996)。該表達(dá)載體在序列號為60/500,803的美國專利申請中詳細(xì)描述，其內(nèi)容引入本文作為參考。
通過DNA電穿孔將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到FUT8-/-宿主細(xì)胞系Ms704內(nèi)。通過使用兩個置換載體定向破壞CHO/DG44細(xì)胞中的FUT8基因，來產(chǎn)生Ms 704FUT8-/-細(xì)胞系，這在Yamane等人的美國專利申請20040110704和Yamane-Ohnuki等人.(2004)Biotechnol Bioeng87614-22中更全面地描述。Ms704細(xì)胞適合在添加了100μM次黃嘌呤和16μM胸苷(Invitrogen#11067-030)和6mM L-谷氨酰胺(Invitrogen#25030-081)的生長培養(yǎng)基EX-CELLTM 325PF CHO培養(yǎng)基(JRH#14335)中懸浮培養(yǎng)生長。
將要用于電穿孔的載體DNA經(jīng)乙醇沉淀，并重懸浮在10mM Tris7.6，1mM EDTA中。使用1、5、10、15或20μg DNA進(jìn)行20次電穿孔，每種DNA濃度進(jìn)行4次電穿孔。通過在蔗糖緩沖溶液(SBS)中洗滌細(xì)胞并將細(xì)胞以1×107細(xì)胞/ml SBS溶液的濃度重懸浮，來準(zhǔn)備Ms704細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。400μl細(xì)胞與構(gòu)建體DNA混合，使用230伏、400微法拉第電容和13歐姆電阻的設(shè)置進(jìn)行電穿孔(BTX MolecularDelivery Systems#600電細(xì)胞操作器)。從電穿孔杯中取出細(xì)胞，加入20ml生長培養(yǎng)基。將細(xì)胞以每孔200μl細(xì)胞的密度加至96孔板上，大約為4×104細(xì)胞/孔。電穿孔2天后，從每孔中除去150μl培養(yǎng)基，更換為150μl選擇培養(yǎng)基，即含400μg/ml G418(Invitrogen#10131-035)的生長培養(yǎng)基。每3-7天，將每孔150μl選擇培養(yǎng)基更換為新鮮的選擇培養(yǎng)基。使用類似的程序用相同的5F11構(gòu)建體對CHO DG44宿主細(xì)胞(FUT 8+/+)進(jìn)行電穿孔，建立表達(dá)含有巖藻糖基化碳水化合物的重組5F11抗體的CHO DG44轉(zhuǎn)染子。
將產(chǎn)量最高的Ms704和CHO DG44克隆擴(kuò)增，通過蛋白A親和層析法從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化重組5F11抗體。
由Ms704產(chǎn)生的N-連接的寡糖和CHO DG44產(chǎn)生的抗CD30單克隆抗體樣品的比較分析通過毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)的熒光法(cLIF)來進(jìn)行(Chen和Evangelista(1998)Electrophoresis 151892)。通過加入肽N-聚糖酶(Prozyme)并溫育過夜來釋放被被純化抗體的N連接的寡糖。乙醇沉淀該蛋白質(zhì)，將含有碳水化合物的上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，使用Speedvac干燥。重懸浮該碳水化合物，在脫唾液酸化和巖藻糖殘基損失最小化的溫和還原性胺化條件下用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯(APTS)進(jìn)行衍生化。使用激光誘發(fā)的熒光檢測器(Beckman Coulter)通過毛細(xì)管電泳來分析反應(yīng)加合物(Ma和Nashabeh(1999)Anal.Chem.715185)。在從Ms704細(xì)胞系和從CHO DG44細(xì)胞系獲得的抗體之間觀察到寡糖譜的差異，這與Ms704衍生的抗CD30抗體中不存在巖藻糖殘基相一致。
為了證實(shí)在Ms704細(xì)胞中表達(dá)的抗體上不存在巖藻糖殘基，進(jìn)行單糖組成分析。結(jié)果在下面的表1中示出 表1單糖分析 單糖分析的結(jié)果證實(shí)在Ms704細(xì)胞中表達(dá)的抗體缺乏巖藻糖殘基。
除了毛細(xì)管電泳和單糖分析所顯示的寡糖的差異以外，Ms704和CHO DG44衍生的抗CD30抗體蛋白質(zhì)樣品基本上相同。N末端蛋白質(zhì)序列的分析顯示N末端氨基酸序列相同。Ms704和CHO DG44衍生的抗CD30抗體的輕鏈的質(zhì)譜分析分別獲得23,740和23,742的質(zhì)量，這在儀器的誤差之內(nèi)。還使用標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管等電聚焦試劑盒試驗(yàn)(BeckmanCoulter)檢測了這兩種抗體，顯示這兩種抗體樣品具有相同的等電點(diǎn)，為8.6。這些研究表明，除了Ms704衍生的抗體的碳水化合物成分的脫巖藻糖基化以外，Ms704和CHO DG44細(xì)胞衍生的抗體樣品的蛋白質(zhì)成分基本上相同。
實(shí)施例2脫巖藻糖基化抗CD30抗體的ADCC活性的評價 抗CD30單克隆抗體5F11能夠通過效應(yīng)細(xì)胞群體的募集經(jīng)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)殺傷CD30+細(xì)胞。在該實(shí)施例中，利用細(xì)胞毒性鉻釋放試驗(yàn)檢測了在效應(yīng)細(xì)胞存在下脫巖藻糖基化5F11(defuc-5F11)單克隆抗體殺傷CD30+細(xì)胞系的能力。
人效應(yīng)細(xì)胞如下用全血制備。通過標(biāo)準(zhǔn)Ficoll-paque分離法從肝素化的全血中純化人外周血單核細(xì)胞。將該細(xì)胞重懸浮在含有10％FBS和200U/ml人IL-2的RPMI1640培養(yǎng)基中，并在37℃下溫育過夜。次日，收集細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗一次，并以1×107細(xì)胞/ml的濃度重懸浮。二百萬個靶CD30+細(xì)胞與200μCi51Cr在1ml總體積中37℃溫育1小時。將靶細(xì)胞洗一次，重懸浮在1ml培養(yǎng)基中，再于37℃溫育30分鐘。最后一次溫育后，將靶細(xì)胞洗一次，使終濃度為1×105細(xì)胞/ml。
開始時利用標(biāo)準(zhǔn)FACS分析檢測CD30+細(xì)胞系L540(人何杰金氏淋巴瘤；DSMZ保藏號ACC 72)、L428(人何杰金氏淋巴瘤；DSMZ保藏號ACC 197)、L1236(人何杰金氏淋巴瘤；DSMZ保藏號ACC 530)和Karpas(人T細(xì)胞淋巴瘤；DSMZ保藏號ACC 31)細(xì)胞系與巖藻糖基化5F11(fuc-5F11)和defuc-5F11的結(jié)合。對于fuc-5F11和defuc-5F11，在一定的抗體濃度范圍內(nèi)，每個靶細(xì)胞顯示出類似的結(jié)合譜。根據(jù)平均熒光強(qiáng)度確定的CD30表達(dá)水平在L540中最高，然后是Karpas，L428，最低的CD30表達(dá)是在L1236細(xì)胞上。
如下所述，利用改良的51Cr抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)檢測L540、L428、L1236和Karpas細(xì)胞。每個靶細(xì)胞系(100μl標(biāo)記的CD30+細(xì)胞)與50μl效應(yīng)細(xì)胞和50μl抗體一起溫育。在整個實(shí)驗(yàn)過程中均使用1∶50的靶∶效比。在所有研究中還進(jìn)行以下的陰性對照a)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞而不含抗體，b)靶細(xì)胞而沒有效應(yīng)細(xì)胞，c)孔中含有靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，存在1％Triton X-100，和d)人IgG1同種型對照。在37℃溫育4小時后，收集上清液，用γ計(jì)數(shù)器(CobraII auto-gamma，來自Packard Instruments)計(jì)數(shù)，閱讀窗口為240-400keV。將每分鐘的計(jì)數(shù)作為抗體濃度的函數(shù)作圖，并使用Prism軟件(San Diego，CA)利用非線性回歸S形劑量應(yīng)答(可變斜率)分析這些數(shù)據(jù)。采用不同濃度的fuc-5F11和defuc-5F11，L540、L428、L1236和Karpas細(xì)胞系的細(xì)胞毒性曲線分別在圖4-7中顯示。
裂解百分比用以下方程式來確定 ％裂解＝(樣品CPM-無抗體CPM)/TritonX CPM-無抗體CPM)X100 以25μg/ml的抗體濃度和1∶50的靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞比例檢測％裂解。也計(jì)算每種靶細(xì)胞的EC50值。結(jié)果總結(jié)在下面的表2中。
表2脫巖藻糖基化抗CD30單克隆抗體的細(xì)胞毒性能力 Defuc-5F11顯示比fuc-5F11抗體高1.61倍(對于L540細(xì)胞)至3.25倍(對于L1236細(xì)胞)的裂解百分比。defuc-5F11這種提高的能力導(dǎo)致在fuc-5F11沒有可測量的效果的抗體濃度時defuc-5F11產(chǎn)生可測量的細(xì)胞裂解。例如，對于L1236細(xì)胞，其具有低水平的CD30表達(dá)，0.1μg/ml的defuc-5F11導(dǎo)致10％的特異性裂解，而相同濃度的fuc-5F11沒有可測量的效果(見圖6)。根據(jù)EC50值的比例測定，Defuc-5F11的ADCC活性比fuc-5F11抗體強(qiáng)4.7倍(對于L540細(xì)胞)至27.1倍(對于L1236細(xì)胞)。
實(shí)施例3抗CD30抗體的ADCC活性的評價 在該實(shí)施例中，利用熒光細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測抗CD30單克隆抗體在效應(yīng)細(xì)胞存在下通過抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)殺傷CD30+細(xì)胞系的能力。人效應(yīng)細(xì)胞如上所述制備，ADCC測定如上所述進(jìn)行。從圖9中可以看出，當(dāng)使用脫巖藻糖基化抗CD30抗體時，與親本抗CD30抗體相比具有提高的ADCC活性。另外，脫巖藻糖基化抗CD30抗體比親本抗體更強(qiáng)，與親本抗CD30抗體相比EC50降低即證明了這一點(diǎn)。脫巖藻糖基化抗CD30抗體的最大裂解百分比較高這一事實(shí)證明了該抗體也更加有效。使用任一種抗體，抗-CD16(3G8)抗體有效抑制ADCC，提示該裂解由CD16介導(dǎo)。
實(shí)施例4使用人效應(yīng)細(xì)胞增強(qiáng)了ADCC ADCC測定如上所述進(jìn)行。在該實(shí)驗(yàn)中，將小鼠效應(yīng)細(xì)胞與人效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行比較。從圖10可以看出，當(dāng)使用小鼠效應(yīng)細(xì)胞時，親本抗CD30抗體與脫巖藻糖基化抗體相比ADCC沒有提高，但是當(dāng)檢測人效應(yīng)細(xì)胞時，與親本抗CD30抗體相比，脫巖藻糖基化抗體導(dǎo)致ADCC顯著增強(qiáng)。
實(shí)施例5使用來自短尾猴的效應(yīng)細(xì)胞比較親本和脫巖藻糖基化抗體的ADCC測定 從短尾猴獲得全血。用50U/ml rIL-2刺激紅細(xì)胞被裂解的短尾猴外周血細(xì)胞，并在含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。在研究當(dāng)天，將短尾猴細(xì)胞以1×107細(xì)胞/mL重懸浮在測定緩沖液(RPMI1640，10％FBS，2.5mM丙磺舒)中。標(biāo)記CD30陽性靶細(xì)胞Karpas 299，用洗滌緩沖液(PBS，2.5mM丙磺舒，20mM HEPES)洗三次，對于1∶50的靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞比例調(diào)節(jié)至1×105細(xì)胞/mL。如上所述進(jìn)行ADCC測定。我們使用從短尾猴血液中純化的效應(yīng)細(xì)胞比較了親本抗CD30抗體和脫巖藻糖基化抗體的活性。對于親本抗體觀察到適中的ADCC活性(在10μg/mL時大約7-10％細(xì)胞裂解)。相反，脫巖藻糖基化抗體誘導(dǎo)顯著較高百分比的裂解(在10μg/mL時大約10-30％細(xì)胞裂解)和降低的EC50(參見圖11)。
實(shí)施例6抗CD30單克隆抗體對L540細(xì)胞、活化的人和短尾猴外周血細(xì)胞的結(jié)合親和力的Scatchard分析 測定了親本和脫巖藻糖基化抗CD30抗體的結(jié)合親和力。我們比較了這兩種抗體對于CD30陽性L540細(xì)胞以及PHA/Con A活化的人或短尾猴外周血單核細(xì)胞的結(jié)合親和力。
用2μg/ml PHA、10μg/ml Con A和50U/ml rIL-2刺激人或短尾猴外周血細(xì)胞，并以1×106細(xì)胞/ml的密度在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。在研究當(dāng)天，洗滌細(xì)胞，在結(jié)合緩沖液(RPMI 1640+10％FBS)中調(diào)節(jié)至2×107細(xì)胞/ml。作為對照，在這些研究中使用CD30陽性L540細(xì)胞(調(diào)節(jié)至4-8×106細(xì)胞/ml)，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)高水平的抗原。將細(xì)胞置于冰上，直到開始實(shí)驗(yàn)。微孔玻璃纖維濾板(MAFBN0B50)用1％脫脂奶粉水溶液包被，并在4℃下貯存過夜。用0.2ml結(jié)合緩沖液洗板三次。向最大結(jié)合孔中加入單獨(dú)50微升緩沖液(總結(jié)合)。向?qū)φ湛字屑尤雴为?dú)25微升緩沖液。向所有孔中加入體積為25μl的不同濃度的125I-抗-CD30抗體。向?qū)φ湛字屑尤塍w積為25μl的300-400倍過量的不同濃度的未標(biāo)記的抗體(非特異性結(jié)合)，并向所有孔中加入在結(jié)合緩沖液中的25μl CD30陽性L540細(xì)胞或被刺激的人或短尾猴外周血細(xì)胞。將板在4℃搖床上以200RPM溫育2小時。在溫育結(jié)束時，用0.2ml冷洗滌緩沖液(RPMI1640，10％FBS，500mM NaCl)洗微孔板兩次。取出濾板，用γ計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。使用Prism軟件(San Diego，CA)用單位點(diǎn)結(jié)合參數(shù)進(jìn)行平衡結(jié)合的評價。
根據(jù)上述Scatchard結(jié)合測定，親本CD30抗體對于L540細(xì)胞的KD接近1.4nM，而脫巖藻糖基化抗體具有1.9nM的KD(表3)。這表明除去巖藻糖后親和力改變極少。使用細(xì)胞系以外的原代細(xì)胞重復(fù)這些研究。另外，檢測對每個細(xì)胞上顯著表達(dá)較少受體的細(xì)胞的親和力。如上所述制備活化的人外周血細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)親本和脫巖藻糖基化抗CD30抗體的KD分別為1.1和2.7nM。
最后，比較了親本和脫巖藻糖基化抗體對于PHA、Con A和rIL-2活化的短尾猴外周血單核細(xì)胞的結(jié)合親和力。發(fā)現(xiàn)親本和脫巖藻糖基化抗體的KD分別接近0.47nM和0.83nM。
表3 Scatchard分析 等同方案 僅僅應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就將認(rèn)識到或者能夠確定本文描述的本發(fā)明特定實(shí)施方案的許多等同方案。這些等同方案包含在下面的權(quán)利要求書中。
序列表概述
序列表
<110>米德列斯公司
<120>缺乏巖藻糖殘基的抗CD30單克隆抗體
<130>MXI-333PC
<140>
<141>
<150>60/654,197
<151>2005-02-18
<160>35
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>112
<212>PRT
<213>人
<400>1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210>2
<211>116
<212>PRT
<213>人
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>3
<211>116
<212>PRT
<213>人
<400>3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>5
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>6
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>6
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>7
Ala Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>8
Asn Ser Trp Met Ser
1 5
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>9
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>10
Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>11
Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>12
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>12
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>13
<211>4
<212>PRT
<213>人
<400>13
Leu Thr Ala Tyr
1
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>14
Val His Trp Tyr Phe His Leu
1 5
<210>15
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>15
Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>16
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Thr
1 5 10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>17
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>18
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>18
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>19
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>20
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>20
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210>21
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>21
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>22
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile Thr
1 5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>23
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>24
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr
1 5
<210>25
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210>26
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>27
<211>94
<212>PRT
<213>人
<400>27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
85 90
<210>28
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
<210>29
<211>94
<212>PRT
<213>人
<400>29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Giy Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr
85 90
<210>30
<211>336
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<400>30
cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt gct tac96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att144
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
ggg gac atc aat cat ggt gga ggc acc aac tac aac ccg tcc ctc aag192
Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg240
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
aag ctg aac tct gta acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg288
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
agc cta act gcc tac tgg ggc cag gga agc ctg gtc acc gtc tcc tca336
Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210>31
<211>348
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(348)
<400>31
gag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc acc ttt agt aac tct96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
tgg atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg144
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aac ata aac gaa gat gga agt gag aaa ttc tat gtg gac tct gtg192
Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc ttc tcc aga gac aac gcc gag aac tca ctg tat240
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg agg gtt cat tgg tacttc cat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc 336
Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
100 105 110
act gtc tcc tca 348
Thr Val Ser Ser
115
<210>32
<211>348
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(348)
<400>32
cag gtg cag cta eag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tce ttc agt ggt tac96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att144
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
ggg gaa atc aat cat agt gga agc acc aag tac acc ccg tcc ctc aag192
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
agc cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag cac caa ttc tcc ctg240
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg288
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aga gag act gtc tac tac ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc336
Arg Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
100 105 110
act gtc tcc tca348
Thr Val Ser Ser
115
<210>33
<211>321
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>33
gac atc cag atg acc cag tct cca acc tca ctg tct gca tct gta gga48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
tta acc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc144
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat gat agt tac cct atc288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile
85 90 95
acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>34
<211>324
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>34
gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt192
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctg gag240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt agc tca ccg288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa324
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>35
<211>321
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>35
gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gta agc agc aac96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ctc agt ggc192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt caa cag cgt agc aac tgg ccg tgg288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 10權(quán)利要求
1.一種分離的抗CD30抗體，其缺乏巖藻糖殘基。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體增強(qiáng)表達(dá)細(xì)胞表面CD30的細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性。
3.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體在巖藻糖基化形式時在體外不誘導(dǎo)L1236細(xì)胞(DSMZ保藏號Acc530)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，但是在脫巖藻糖基化形式時在體外誘導(dǎo)L1236的ADCC，其中在0.1μg/ml的抗體濃度和1∶50的靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞比例下通過ADCC測定法評價ADCC。
4.權(quán)利要求3的抗體，與該抗體的巖藻糖基化形式相比，該抗體的缺乏巖藻糖的形式在體外增強(qiáng)L540細(xì)胞(DSMZ保藏號ACC72)、L428細(xì)胞(DSMZ保藏號ACC197)和Karpas細(xì)胞(DSMZ保藏號ACC31)的ADCC，其中在0.1μg/ml的抗體濃度和1∶50的靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞比例下通過ADCC測定法評價ADCC。
5.權(quán)利要求1的抗體，它是單克隆抗體。
6.權(quán)利要求5的抗體，它是人源化或嵌合抗體。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述人源化或嵌合抗體是由選自AC10、HeFi-1、Ber-H2、Ki-1、Ki-4、HRS-3、Irac、HRS-4、M44、M67和Ber-H8的小鼠抗CD30抗體制備的。
8.權(quán)利要求5的抗體，它是人抗體。
9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述人抗體包括人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)，其中
(a)人重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO1、2和3的氨基酸序列；
(b)人輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO4、5和6的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO4的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO5的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO3的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO6的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求5的抗體，包括
(a)包含選自SEQ ID NO7、8和9的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDR1；
(b)包含選自SEQ ID NO10、11和12的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDR2；
(c)包含選自SEQ ID NO13、14和15的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDR3；
(d)包含選自SEQ ID NO16、17和18的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR1；
(e)包含選自SEQ ID NO19、20和21的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR2；和
(f)包含選自SEQ ID NO22、23和24的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
14.權(quán)利要求13的抗體，包括
(a)包含SEQ ID NO7的人重鏈可變區(qū)CDR1；
(b)包含SEQ ID NO10的人重鏈可變區(qū)CDR2；
(c)包含SEQ ID NO13的人重鏈可變區(qū)CDR3；
(d)包含SEQ ID NO16的人輕鏈可變區(qū)CDR1；
(e)包含SEQ ID NO19的人輕鏈可變區(qū)CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO22的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
15.權(quán)利要求13的抗體，包括
(a)包含SEQ ID NO8的人重鏈可變區(qū)CDR1；
(b)包含SEQ ID NO11的人重鏈可變區(qū)CDR2；
(c)包含SEQ ID NO14的人重鏈可變區(qū)CDR3；
(d)包含SEQ ID NO17的人輕鏈可變區(qū)CDR1；
(e)包含SEQ ID NO20的人輕鏈可變區(qū)CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO23的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
16.權(quán)利要求13的抗體，包括
(a)包含SEQ ID NO9的人重鏈可變區(qū)CDR1；
(b)包含SEQ ID NO12的人重鏈可變區(qū)CDR2；
(c)包含SEQ ID NO15的人重鏈可變區(qū)CDR3；
(d)包含SEQ ID NO18的人輕鏈可變區(qū)CDR1；
(e)包含SEQ ID NO21的人輕鏈可變區(qū)CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO24的人輕鏈可變區(qū)CDR3。
17.權(quán)利要求8的抗體，其包括產(chǎn)自或來源于人VH4-34或VH3-07基因的重鏈可變區(qū)。
18.權(quán)利要求8的抗體，其包括產(chǎn)自或來源于人VkL15、A27或L6基因的輕鏈可變區(qū)。
19.權(quán)利要求8的抗體，其包括產(chǎn)自或來源于人VH4-34或VH3-07基因的重鏈可變區(qū)和產(chǎn)自或來源于人VkL15、A27或L6基因的輕鏈可變區(qū)。
20.一種宿主細(xì)胞，包括編碼抗CD30抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，其中所述宿主細(xì)胞缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使所述宿主細(xì)胞表達(dá)的抗CD30抗體缺乏巖藻糖殘基。
21.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因是人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因。
22.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是FUT8。
23.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，它是CHO細(xì)胞。
24.一種抑制CD30+細(xì)胞生長的方法，包括使所述細(xì)胞與脫巖藻糖基化抗CD30抗體在足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的條件下接觸。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗CD30抗體是人抗體。
27.一種抑制受試者中表達(dá)CD30的腫瘤細(xì)胞生長的方法，包括給所述受試者施用有效抑制受試者中表達(dá)CD30的腫瘤細(xì)胞生長的量的脫巖藻糖基化抗CD30抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗CD30抗體是人抗體。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是何杰金氏病(HD)腫瘤細(xì)胞。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)腫瘤細(xì)胞。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞來自選自下組的疾病非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、周圍T細(xì)胞淋巴瘤、倫南德氏淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞淋巴瘤、成人T細(xì)胞淋巴瘤(ATL)、HIV相關(guān)體腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤、CD30+T細(xì)胞淋巴瘤和CD30+B細(xì)胞淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及缺乏巖藻糖殘基的抗CD30抗體。本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)活性，包括裂解不被巖藻糖基化形式抗體裂解的表達(dá)CD30的細(xì)胞系的能力。本發(fā)明還提供表達(dá)缺乏巖藻糖殘基的抗CD30抗體的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。也提供了使用抗體抑制CD30+細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞生長的方法。
文檔編號C07K16/30GK101128486SQ200680005356
公開日2008年2月20日 申請日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日
發(fā)明者J·M·卡達(dá)雷里, A·N·布萊克 申請人:米德列斯公司