專(zhuān)利名稱(chēng)：二羥基丙酮合成酶和二羥基丙酮激酶基因表達(dá)盒串聯(lián)的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高植物同化和吸收甲醛能力 的植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS及其構(gòu)建方法和在提高植物 吸收和耐受外源甲醛能力中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲醛是一種無(wú)色，有強(qiáng)烈刺激氣味的氣體，易溶于水、醇和醚，被廣泛用于工業(yè)生 產(chǎn)中，是膠粘劑工業(yè)應(yīng)用最廣泛的化學(xué)原材料。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高， 各種原料制成的建筑裝飾材料已走入各種室內(nèi)公共場(chǎng)所和家庭，使甲醛成為室內(nèi)空氣污染 公認(rèn)最具代表性的化學(xué)物質(zhì)。室內(nèi)空氣中游離甲醛濃度在中國(guó)規(guī)定的允許值是0.08(mg/ 立方米)，對(duì)新裝修住宅的調(diào)查結(jié)果表明室內(nèi)空氣中甲醛濃度是室外空氣的6. 65倍，為 0. 492mg/m3，在門(mén)窗關(guān)閉時(shí)甲醛濃度超標(biāo)100倍。甲醛為較高毒性物質(zhì)，它反應(yīng)能力極強(qiáng)，能 與蛋白質(zhì)，核酸和脂類(lèi)產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)，是一種非?；顫姷幕衔?，因此對(duì)所有的生物 來(lái)說(shuō)都有很高的毒性長(zhǎng)期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻煙癌、結(jié)腸癌、腦 瘤、月經(jīng)紊亂、細(xì)胞核的基因突變，DNA單鏈內(nèi)交連和DNA與蛋白質(zhì)交連及抑制DNA損傷的修 復(fù)、妊娠綜合癥、引起新生兒染色體異常、白血病，這就是所謂的裝修綜合病(sick-house)。相對(duì)于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游離甲苯二異氰酸酯(TDI)、揮發(fā)性有機(jī)化合物 (V0C)等有害物質(zhì)來(lái)說(shuō)，甲醛具有潛伏周期長(zhǎng)(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、 危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三種一是使用環(huán)保材料；二是開(kāi)窗 通風(fēng)；三是用植物或除污劑清除污染，使用除污劑有二次污染的可能。用室內(nèi)栽培植物清除 甲醛污染，是最自然、最環(huán)保的方式，科學(xué)研究證明確實(shí)有些植物能夠吸收分解甲醛，但吸 收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104 1301-1309)。甲醛是一種非?；顫姷幕衔?，因?yàn)槟芘c蛋白質(zhì)，核酸和脂類(lèi)產(chǎn)生非特異性的反 應(yīng)(Feldman 等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1973，13 :1_49)，因此對(duì)所有的生物 包括植物來(lái)說(shuō)都有很高的毒性。但在生物體內(nèi)通過(guò)各種脫甲基化反應(yīng)，也會(huì)產(chǎn)生低濃度的 甲醛，所以幾乎所有的生物對(duì)甲醛都有各自的解毒機(jī)制。自然界中的大多數(shù)植物屬光能自 養(yǎng)型生物，主要以0)2為碳源，大部分植物通過(guò)光合作用的開(kāi)爾文循環(huán)途徑固定C02。甲醛 也是植物一碳(C1)化合物代謝的一種中間產(chǎn)物，但是大部分甲醛在植物體內(nèi)并不以游離 狀態(tài)存在，而是結(jié)合到內(nèi)源的親核化合物如谷胱甘肽或四氫葉酸上(Chen等，1997，Plant Physiol 115:299-309)。生物化學(xué)和遺傳學(xué)的研究證明依賴(lài)-谷胱苷肽的甲醛脫氫酶(FALDH)在真核生 物中是負(fù)責(zé)甲醛代謝的主要酶，這種酶普遍存在于動(dòng)物和植物組織中。ADH2基因編碼擬南 芥中FALDH，在植物中只有少量的表達(dá)。最近西班牙的一個(gè)研究小組獲得FALDH過(guò)量表達(dá) 的轉(zhuǎn)基因擬南芥，他們的研究結(jié)果表明提高FALDH在轉(zhuǎn)基因植物中的酶活性可使它們吸收 外源甲醛的效力提高25%，而通過(guò)共抑制或反義表達(dá)降低FALDH在轉(zhuǎn)基因植物中的活性，
3可使它們吸收甲醛的速度顯著下降，與野生型相比，對(duì)甲醛的脫毒能力也大大降低，這是 用轉(zhuǎn)基因方法增強(qiáng)植物對(duì)甲醛脫毒作用的首例研究(Achkor等，Plant physiology. 132 2248-2255)。在生命誕生以前，甲醛是地球上原始湯的成分之一，甲醛與生物的關(guān)系從它的誕 生開(kāi)始持續(xù)至今已有好幾十億年了。在這期間，為防止甲醛濃度在體內(nèi)上升，生物體建立了 巧妙的機(jī)制，使之能在含有甲醛的環(huán)境中更好地生存，這一機(jī)制的高度發(fā)展出現(xiàn)在能同化 一碳化合物的微生物中。不管是原核生物還是真核生物，凡是能利用C1化合物(甲烷，甲 醇，甲酸，甲酰胺等)的微生物，在它們代謝作用的初期階段，都產(chǎn)生甲醛，它們的細(xì)胞中都 有能把從各種C1化合物產(chǎn)生的甲醛變成為細(xì)胞的組成成分的同化途徑以及從甲醛獲得細(xì) 胞所需能量的氧化途徑。在甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物中，甲醛在好幾種C1化合物的代謝過(guò)程中是 個(gè)關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，它參與異化作用和同化作用過(guò)程(0皿716等，1978，42 :251-273)。核酮 糖單磷酸途徑(RuMP)是細(xì)菌甲醛同化途徑之一，RuMP中固定甲醛的關(guān)鍵酶是6-磷酸己酮 糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖異構(gòu)酶(PHI)。因?yàn)?-磷酸核酮糖和6-磷酸果糖都是開(kāi)爾 文循環(huán)的中間產(chǎn)物，在植物的葉綠體中如能成功地表達(dá)細(xì)菌的HPS和PHI，那末甲醛就能通 過(guò)光合作用進(jìn)行同化。我們最近的研究結(jié)果表明在擬南芥和煙草的葉綠體中過(guò)量表達(dá)來(lái)自 甲基營(yíng)養(yǎng)菌Mycobacterium gastri MB19的HPS和PHI，能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)甲醛的抗性和 吸收并同化氣體和液體甲醛的能力(Chen et al. ,Plant cell and Physilo，2005)。這就 證明可以利用植物基因工程技術(shù)把微生物的甲醛同化途徑整合到植物的二氧化碳固定途 徑中。甲基營(yíng)養(yǎng)酵母具有利用一碳化合物甲醇的高效代謝機(jī)制，在甲醇的代謝途徑中， 甲醇首先被乙醇氧化酶氧化為甲醛，甲醛是甲醇代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵性的中間產(chǎn)物，它 處于甲醇同化和異化途徑的分支點(diǎn)上。二羥基丙酮合成酶(DAS)催化甲醛同化途徑中的 第一個(gè)反應(yīng)，DAS催化酵母菌中的甲醛和木酮糖5-P形成二羥基丙酮和甘油醛3-磷酸。甲 醇被酒精氧化酶氧化成甲醛后，由它把甲醛固定到D-木酮糖5-磷酸分子上(Yurimoto等， 2005，The Chemical Record. 5 :367_375)。通過(guò)突變體和酶學(xué)特性分析證實(shí)了 DAS的生理 作用是甲醇同化作用的關(guān)鍵酶，被定位在過(guò)氧化物酶體中。目前已從甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌假 絲酵母(Candida boidinii)中克隆到編碼DAS的基因(DHAS1)，進(jìn)一步的調(diào)查結(jié)果證實(shí)DAS 主要參與這種酵母菌細(xì)胞中甲醛的同化作用而非異化作用或脫毒作用(Sakai等，1998， American Society forMicrobiology. 180 5885-5890)。二羥基丙酮對(duì)酵母細(xì)胞來(lái)說(shuō)是有 毒的化合物，在酵母菌中二羥基丙酮激酶(DAK)參與二羥基丙酮的脫毒作用，它催化的反 應(yīng)使二羥基丙酮磷酸化，形成無(wú)毒性的磷酸二羥丙酮，可為酵母細(xì)胞所利用。該酶普遍存在 于大多數(shù)的生物體中，結(jié)合遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法，已從酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆到兩個(gè)編碼DAK的基因(YML070W/DAK1和YML053W/DAK2)，它們所編 碼的蛋白質(zhì)是同型二聚體(Molin 等，2003，The journalof biological chemistry. 278 1415-1423)。從巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中克隆到的DAK基因編碼的蛋白質(zhì)定 位于細(xì)胞質(zhì)中(Liiers 等，Yeast. 1998，Jun 15，14(8) :759_71)。5-磷酸木酮糖和磷酸二羥丙酮及甘油醛3-磷酸都是開(kāi)爾文循環(huán)的中間產(chǎn)物，本 申請(qǐng)人:的研究結(jié)果證明(見(jiàn)本申請(qǐng)人的另一申請(qǐng)專(zhuān)利提高植物吸收和耐受甲醛的方法及 其植物載體與應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)栐?00810058341. 9)在植物的葉綠體中過(guò)量表達(dá)來(lái)自酵母菌的DAS和DAK，把酵母菌的甲醛同化途徑整合到植物的二氧化碳固定途徑(開(kāi)爾文循環(huán)途徑) 中，在轉(zhuǎn)基因植物中利用DAS和DAK可以構(gòu)建一條甲醛同化途徑。但是利用DAS和DAK構(gòu) 建甲醛同化途徑時(shí)涉及到兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)化操作，如果把這兩個(gè)基因亞克隆于兩種含有不同 篩選標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體上，做轉(zhuǎn)基因植物時(shí)就要在獲得單個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因植物時(shí)再 做一次轉(zhuǎn)化試驗(yàn)才能獲得兩個(gè)基因的雙轉(zhuǎn)基因植物，或得到單個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因植物后進(jìn)行 雜交才能獲得雙轉(zhuǎn)基因植物，這兩種方法都需要耗費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間，增加一倍的工作量。另 外，也可以通過(guò)兩種載體的共轉(zhuǎn)化獲得雙轉(zhuǎn)基因植物，不過(guò)這種方法成功率很低，對(duì)難轉(zhuǎn)化 的植物更難以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)化操作。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種植物表達(dá)載體(pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS)，該載體含有 1，5 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小 亞基基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和葉綠體基質(zhì)定位序列(T*)及DAS和DAK基因，從而 可以通過(guò)一次轉(zhuǎn)化事件完成DAS和DAK 二個(gè)目的基因的轉(zhuǎn)化操作，利用該載體中的PrbcS 啟動(dòng)子控制DAS和DAK基因在植物葉片中的表達(dá)，并通過(guò)葉綠體基質(zhì)定位序列(T*)把表達(dá) 的DAS和DAK蛋白定位到葉綠體基質(zhì)中，利用DAS和DAK蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中構(gòu)建一條甲 醛的光合作用同化途徑，從而提高植物同化和吸收甲醛能力。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS，為含有番茄 1，5 二磷 酸核酮糖羧化酶Rubisco 3C小亞基基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrbcS及其轉(zhuǎn)移肽序列*T、甲基 營(yíng)養(yǎng)酵母菌假絲酵母的二羥基丙酮合成酶DAS基因和巴斯德畢赤酵母的二羥基丙酮激酶 DAK基因的植物表達(dá)載體。所述的植物表達(dá)載體，其中的DAS基因的GenBank登錄號(hào)為AF086822，DAK基因的 GenBank 登錄號(hào)為 AF019198。所述的植物表達(dá)載體，其起始載體為pK7m34GW2-8m21GW3。所述的植物表達(dá)載體，其中光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrbcS和葉綠體定位序列是從番茄的 基因組中分離出來(lái)的rbcS-3C的啟動(dòng)子及其葉綠體基質(zhì)定位序列，是一個(gè)由Hindlll切割 產(chǎn)生的1.7kb的DNA片斷。植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS，由下述方法構(gòu)建而 成(1)入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的構(gòu)建用SphI 和Xhol 切開(kāi) pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 禾口 pENTR*-PrbcS-*T_DAK， 回收 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 被切割后產(chǎn)生的載體 pEN-L4*-PrbcS-*T_L3* 片斷及 pENTR*-PrbcS-*T-DAK被切割產(chǎn)生的DAK基因的DNA片段，用連接酶把載體片段和DAK基因 的DNA片段連接起來(lái)獲得入門(mén)載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* ；(2)植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的構(gòu)建通過(guò)Gateway 的 LR 反應(yīng)，把入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS-*T-DAK片段和pENTR*-PrbcS-*T_DAS中的PrbcS_*T_DAS片段同時(shí)亞克隆到植物表 達(dá)載體 pK7m34GW2-8m21GW3 中，獲得植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS。植物表達(dá)載體pK2-35S-PrbCS-*T-hps/phi的構(gòu)建方法，包括下述步驟(1)入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的構(gòu)建用SphI 和 Xhol 切開(kāi) pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3* 和 pENTR*-PrbcS-*T_DAK， 回收 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 被切割后產(chǎn)生的載體 pEN-L4*-PrbcS-*T_L3* 片斷及 pENTR*-PrbcS-*T-DAK被切割產(chǎn)生的DAK基因的DNA片段，用連接酶把載體片段和DAK基因 的DNA片段連接起來(lái)獲得入門(mén)載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* ；(2)植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的構(gòu)建通過(guò)Gateway 的 LR 反應(yīng)，把入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS-*T-DAK片段和pENTR*-PrbcS-*T_DAS中的PrbcS_*T_DAS片段同時(shí)亞克隆到植物表 達(dá)載體 pK7m34GW2-8m21GW3 中，獲得植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T -DAS。植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS在提高轉(zhuǎn)基因植物吸 收和耐受外源甲醛能力的遺傳工程中的應(yīng)用。本發(fā)明用通路克隆技術(shù)構(gòu)建的植物表達(dá)載體，其含有1，5 二磷酸核酮糖羧化酶 (Rubisco)小亞基基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和葉綠體基質(zhì)定位序列(T*)。所述植物 表達(dá)載體為 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS,還含有 DAS 和 DAK 基因。利用該植 物表達(dá)載體可以通過(guò)一次轉(zhuǎn)化事件完成DAS和DAK兩個(gè)目的基因的轉(zhuǎn)化操作，所述DAS和 DAK基因上游都有番茄Rubisco 3C小亞基的啟動(dòng)子PrbcS和葉綠體定位序列(*T)，DAS和 DAK基因的表達(dá)受PrbcS啟動(dòng)子控制，葉綠體基質(zhì)定位序列(T*)可以把表達(dá)的DAS和DAK 蛋白定位到葉綠體基質(zhì)中，因此可利用DAS和DAK蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中構(gòu)建一條甲醛的光 合作用同化途徑，從而提高植物同化和吸收甲醛能力。因?yàn)镈AS和DAK催化反應(yīng)的底物和產(chǎn)物都是植物開(kāi)爾文循環(huán)的中間產(chǎn)物，本發(fā)明 技術(shù)方案的提出是基于甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌的甲醛同化途徑可以安裝成高等植物開(kāi)爾文循 環(huán)的一個(gè)支路，因此在植物的葉綠體中過(guò)量表達(dá)來(lái)自酵母菌的DAS和DAK可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因 植物對(duì)甲醛的抗性，并提高植物吸收和同化外源甲醛的能力。本發(fā)明載體中，DAS和DAK基因的上游添加有光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrbcS和葉綠體基 質(zhì)定位序列(T*)。本發(fā)明使用的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和葉綠體定位序列是從番茄的基 因組中分離出來(lái)的rbcS-3C的啟動(dòng)子及其葉綠體基質(zhì)定位序列，是一個(gè)由Hindlll切割產(chǎn) 生的 1. 7kb 的 DNA 片斷(Sugita et al.，1987，MGG, 209 :247_256)。本發(fā)明利用光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和葉綠體基質(zhì)定位序列(*T)構(gòu)建DAS和DAK 基因的植物表達(dá)載體，以便在轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體基質(zhì)中過(guò)量表達(dá)DAS和DAK，通過(guò)DAS和 DAK在轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體中構(gòu)建甲醛的光合作用同化途徑，增強(qiáng)植物同化甲醛的效率，進(jìn) 而提高了植物吸收和耐受外源甲醛的能力。


圖 1、重組質(zhì)粒 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的構(gòu)建策略；
圖 2、重組質(zhì)粒 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的檢測(cè)。 A :pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的電泳檢測(cè)。1，負(fù)對(duì)照(5. 8kb 的質(zhì)粒)；2，正對(duì)照
6質(zhì)粒(6. lkb 的質(zhì)粒)；3-6，pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 質(zhì)粒 DNA。B 用 Hindlll 酶切檢測(cè) 重組質(zhì)粒pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*。l，DNA Marker III ；2,入 DNA/HindIII DNA Marker ； 3-5，pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*。C :PCR 檢測(cè)重組質(zhì)粒 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3*。1， DNA Maker III ;2和4，用DAK基因上游引物DAK5和下游引DAK3做PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，3和5 是用PrbcS啟動(dòng)子區(qū)的引物和DAK基因下游引物DAK3做PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物；圖 3、植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-DAS 的構(gòu)建策略；圖 4、重組質(zhì)粒 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的檢測(cè)。A :pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的電泳檢測(cè)。1，負(fù)對(duì)照(14. 2kb 的 質(zhì)粒)；3-5，pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 質(zhì)粒 DNA。B 用 EcoRV 酶切檢測(cè) 重組質(zhì)粒 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS。1，入 DNA/HindIII DNA Marker ；2, DNA Marker DL2000 ；3，pENTR*-PrbcS-*T_DAS ；4，pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3*，5-8，pK_35S -PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DASo C :PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS。1，DNA MarkerDL2000 ；2，正對(duì)照(以 pEN-LA*-PrbcS-*T-DAK_L3* 為模板用 DAK5 和 DAK3 弓 | 物做 PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物)；3，以 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 為 模板用DAK5和DAK3引物做PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物；5，正對(duì)照(以pENTR*-PrbcS-*T_DAS為模板 用 DAS5 和 DAS3 引物做 PCR 的的擴(kuò)增產(chǎn)物)；6，以 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD_PrbcS-*T-DAS為模板用DAS5和DAS3引物做PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物；4和7，負(fù)對(duì)照(以pK7m34GW2_8m21GW3 為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物)；圖 5、PCR 檢測(cè)含有植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-DAS 的農(nóng) 桿菌菌落中的DAK(A)和DAS(B)基因片段。A 用DAK5和DAK3引物做PCR檢測(cè)。1，DNA Marker ；2，負(fù)對(duì)照(以 pK7m34GW2_8m21GW3 為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物)；3-6，以 pK-35S_PrbcS-*T -DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS轉(zhuǎn)化子菌落為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。B 用DAS5和DAS3引物做PCR 檢測(cè)。1，DNA Marker ；2，負(fù)對(duì)照(以pK7m34GW2-8m21GW3為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物)；3-6,以pK_ 35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS轉(zhuǎn)化子菌落為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；圖6、擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化程序；圖7、PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組中DAK和DAS插入情況。A 擬南芥的基因組DNA 的電泳檢測(cè)。1-4，擬南芥的基因組DNA ;5，DNA Marker III。B 轉(zhuǎn)基因植株中DAK基因的 PCR檢測(cè)。1，DNA Marker III ；2-3，WT(野生型植物，負(fù)對(duì)照)；4-6，轉(zhuǎn)化pK-35S_PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS F1 代的 3 個(gè)植株系。7，正對(duì)照(以 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物)。C 轉(zhuǎn)基因植株中DAS基因的PCR檢測(cè)。1，DNA Marker III ；2-3, WT (野生型植物，負(fù)對(duì)照)；4-6，轉(zhuǎn)化 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS F1 代的 3個(gè)植株系。7，正對(duì)照(以pEN-L4*-PrbcS-*T-DAS-L3*為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物)；圖8、RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中DAK和DAS的轉(zhuǎn)錄水平。A 轉(zhuǎn)基因植株中DAS 基因的RT-PCR檢測(cè)。1，正對(duì)照(以pENTR*-PrbcS-*T-DAS為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物)；2，DNA Marker ；3-4, WT(野生型植物，負(fù)對(duì)照)；5_10，轉(zhuǎn)基因擬南芥F2代的6個(gè)植株。B 轉(zhuǎn)基因 植株中DAK基因的RT-PCR檢測(cè)。1，正對(duì)照(以pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*為模板的擴(kuò)增 產(chǎn)物)；2，DNA Marker III ；3-4, WT(野生型植物，負(fù)對(duì)照)；5_10，轉(zhuǎn)基因擬南芥F2代的6 個(gè)植株；圖9、轉(zhuǎn)基因擬南芥吸收甲醛能力的檢測(cè)。WT(野生型植物，負(fù)對(duì)照)；KSG6和
7KSG7，轉(zhuǎn)基因擬南芥F2代的2個(gè)株系；圖10、轉(zhuǎn)基因擬南芥同化甲醛能力的檢測(cè)。WT(野生型植物，負(fù)對(duì)照)；KSG6和 KSG7，轉(zhuǎn)基因擬南芥F2代的2個(gè)株系；圖11、轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)甲醛抗性的檢測(cè)。WT(野生型植物，負(fù)對(duì)照)；KSG6和KSG7， 轉(zhuǎn)基因擬南芥F2代的2個(gè)株系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但并不以此 限定本發(fā)明。本發(fā)明下述實(shí)施例中所用到的試劑與儀器為試劑主要為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 的構(gòu)建(1)入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 的構(gòu)建用SphI 和 Xhol 切開(kāi) pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*(pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的構(gòu)建方法見(jiàn)本申請(qǐng)人的另一項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01010110946. 5，發(fā)明 名稱(chēng)通路克隆入門(mén)載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*及其構(gòu)建方法和應(yīng)用和pENTR* -PrbcS-*T-DAK (pENTR*-PrbcS-*T_DAK的構(gòu)建方法見(jiàn)本申請(qǐng)人的另一項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)，專(zhuān) 利申請(qǐng)?zhí)?00810058341. 9)，回收pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*被切割后產(chǎn)生的載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-L3* 片斷(4. 3kb)及 pENTR*-PrbcS-*T_DAK 被切割產(chǎn)生的 DAK 基 因的DNA片段(1.8kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒把載體片段和DAK基 因的DNA片段連接起來(lái)獲得入門(mén)載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* (圖1)。用連接反 應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5ci，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好 的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(KmJOiig/ml)的平板上，于37°C過(guò)夜培養(yǎng)，篩選Km抗 性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖2A)，用Hindlll做酶切檢測(cè)，連 接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生三條帶，分子量最大的一條為3. lkb的載體 條帶，第二條為2.2kb的啟動(dòng)子片段，第二條為0.8kb的DAK基因片段(圖2B)。選出 連接成功的質(zhì)粒載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*，用DAK基因的上下游特異性引物 DAK5 (atgtctagtaaacattgggattac)禾口 DAK3 (ctacaacttggtttcagatttg)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增檢測(cè) DAK基因片段，結(jié)果都能擴(kuò)增出一條1.8kb的DAK條帶(圖2C)。再用PrbcS啟動(dòng)子區(qū)的引 物和DAK基因下游引物DAK3做PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為2. Okb (圖2C)，與預(yù)期結(jié)果一 致。選出連接成功的質(zhì)粒載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，挑單 個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。實(shí)施例2 :DAK和DAS基因表達(dá)盒串聯(lián)植物表達(dá)載體的構(gòu)建通過(guò)Gateway 的 LR 反應(yīng)，把入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS-*T-DAK 片段和 pENTR*-PrbcS-*T_DAS(pENTR*-PrbcS-*T_DAK 的構(gòu)建方法見(jiàn)本申請(qǐng) 人的另一項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)?00810058341. 9)中的PrbcS_*T_DAS片段同時(shí)亞克隆到植 物表達(dá)載體pK7m34GW2-8m21GW3 (Gateway的目的載體，購(gòu)自比利時(shí)VIB/Gent公司)中，獲得植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS(圖3)。具體的做法是用 質(zhì)粒抽提試劑盒純化Gateway的目的載體pK7m34GW2-8m21GW3，在Gateway的LR反應(yīng)體 系中加 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 和 pENTR*-PrbcS-*T_DAS 及 pK7m34GW2-8m21GW3 各 150ng，lul LR Clonase plusEnzyme Mix (Invitrogen)，混均于 25°C反應(yīng)過(guò)夜，通過(guò)整合酶 的作用把 PrbcS-*T-DAK 和 PrbcS_*T_DAS 整合到 pK7m34GW2_8m21GW3 中獲得串聯(lián) DAK 和 DAS 表達(dá)盒的植物表達(dá)載體質(zhì)粒 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS(圖 3)。用 反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5ci，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好 的大腸桿菌涂于加有壯觀(guān)霉素(SpeJOyg/ml)的平板上，于37°C過(guò)夜培養(yǎng)，篩選Spe抗 性重組子菌落，從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖4A)，用EcoRVCTaKaRa)做酶切檢 測(cè)，同時(shí)以 pENTR*-PrbcS-*T-DAS 和 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 為正對(duì)照，整合成功的 質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生五條帶(圖4B)，第一條為10. 7kb的載體帶，第二條為 3. lkb，第三條為DAS基因被切割后產(chǎn)生的片段2. lkb，與pENTR*-PrbcS-*T-DAS中的DAS 被EcoRV切割后產(chǎn)生的DAS片段分子量一致(圖4B)，第四條為1. 3kb，第五條為DAK基 因被切割后產(chǎn)生的片段0. 8kb，與pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*中的DAK被EcoRV切割后 產(chǎn)生的DAK片段分子量一致(圖4B)。選出整合成功的質(zhì)粒載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS，用 DAS 基因的上下游特異性引物 DAS5 (ATGGCTCTCGCAAAAGCTGCTTC) 和 DAS3 (TTATTGATCATGTTTTGGTTTTTC)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增檢測(cè) DAS 基因片段，以 pK_35S_ PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS 為模板都能擴(kuò)增出一條 2. lkb 的 DAS 條帶，與 pENTR*-PrbcS-*T-DAS用為模板擴(kuò)增到的條帶分子量一致(圖4C)。同時(shí)也用DAK基 因的上下游特異性引物DAK5和DAK3進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)DAK基因片段，以pK_35S_P rbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS為模板都能擴(kuò)增出一條1. 8kb的DAK條帶，與用 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*中為模板擴(kuò)增到的條帶分子量一致(圖4C)。確認(rèn)是整合成功 的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。PK-35S -PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS攜帶的植物篩選標(biāo)記基因?yàn)榭敲顾?Km)抗性基因 (NPTII)，這樣可用加有Km的平板篩選轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)施例3 用DAK和DAS基因表達(dá)盒串聯(lián)的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pK-35S_Prb cS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壯觀(guān)霉素的平板 上篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的 電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀(BI0-RAD)滑槽 中，用1mm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數(shù)進(jìn)行電擊，電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯， 迅速加入0. 5mlS0C培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1. 5ml的離心管中；28°C，200rpm搖床培養(yǎng)3_5h ； 室溫下，7500rpm離心lmin，棄大部分上清，保留100 yl將細(xì)胞懸??；把農(nóng)桿菌涂布于有壯 觀(guān)霉素(SpejOyg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取 農(nóng)桿菌菌落放入20 u 1 ddH20中，98°C處理15分鐘后取出10 u 1農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反 應(yīng)的模板。用DAK和DAS基因上下游特異性引物作PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)化成功的菌落均能擴(kuò)增出 1. 8kb (圖5A)的DAK基因條帶和2. lkb的DAS基因條帶(圖5B)，經(jīng)菌落PCR確認(rèn)的轉(zhuǎn)化 子菌落用于轉(zhuǎn)化植物。實(shí)施例4 用含有DAK和DAS基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥
挑取攜帶有質(zhì)粒pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS的農(nóng)桿菌單菌落接 種于 50ml 的 LB 培養(yǎng)基中(含 Spe，100 u g/ml)，180rpm, 28°C培養(yǎng) 24h，待菌液 OD600 至 1. 0 左右，離心lOmin (3000rpm)，沉淀菌體。用5%的蔗糖溶液懸浮菌體使菌體的0D6(1(1值為0. 5。 選取容易轉(zhuǎn)化的模式植物擬南芥(生態(tài)型Columbia)作轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，首先將擬南芥栽培于小 杯的土壤中，用抽蕾期的擬南芥植株做轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(圖6)，轉(zhuǎn)化試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)在農(nóng)桿菌懸浮液 中加入表面活性劑Silwet L-77(0. 005% )，把有擬南芥花蕾的枝條置于農(nóng)桿菌懸浮液中， 通過(guò)抽真空使農(nóng)桿菌進(jìn)入擬南芥花蕾的子房中。轉(zhuǎn)化結(jié)束后用吸水紙吸干植物表面的蔗糖 溶液，于黑暗中培養(yǎng)一天，然后置于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，收集種子。用次氯酸鈉對(duì)種子進(jìn)行表 面消毒，播于含有卡那霉素(50 y g/ml)的MS培養(yǎng)基上，篩選具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植 株(F1代)，移栽到混有腐殖土的土壤上，待植物長(zhǎng)大后取其葉片進(jìn)行PCR檢測(cè)。實(shí)施例5 :DAK和DAS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的插入情況的檢測(cè)為了確認(rèn)具有卡那霉素抗性的F1代植株確實(shí)含有DAK和DAS基因，用PCR方法 對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)基因植株作進(jìn)一步的鑒定。首先采用CTAB法提取植物基因組稱(chēng)取植物葉 片lOOmg左右置于1.5ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入900 yl預(yù)熱 到 65°C 的 2XCTAB 緩沖液(Tris-HCl pH 7. 5100mM, EDTA 20mM, NaCll. 4M, CTAB 2% ), 65°C度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500 yl氯仿-異戊醇混合液(24 1)搖勻， 4°C離心10min(7500rpm)后轉(zhuǎn)移上清至1. 5ml EP管；再次加入500 yl氯仿-異戊醇混 合液(24 1)搖勻，4°C離心10min(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10體 積3M pH5. 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4°C離心20min(12000rpm)；棄上清，用75% 乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 基因組的質(zhì)量(圖7A)。以基因組DNA為模板，用DAK基因的上下游特異性引物(DAK5和 DAK3)和DAS基因上下游特異性引物(DAS5和DAS3)作PCR檢測(cè)。在PCR反應(yīng)混合液中 加入50ng的基因組DNA作為模板，同時(shí)加入50ng的DAS基因上下游特異性引物(DAS5和 DAS3)、1. 8 ii ldNTP (2. 5mM)，10 ii 1 的 5 X 反應(yīng) Buffer 禾口 0. 5 ii 1 的 Taq (2. 5U/ u 1) DNA 聚合 酶(天根生化科技)，加雙蒸水使反應(yīng)終體積為20 yl。在PCR儀上于94oC加熱3分鐘，然 后按照94oC、45秒，50oC、45秒，72oC、2分鐘的程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，最后在72oC延 長(zhǎng)反應(yīng)10分鐘的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAS基因的DNA片段。在另一個(gè)PCR反應(yīng)混合液 中加入50ng的基因組DNA作為模板，同時(shí)加入50ngDAK基因的特異性引物DAK5和DAK3、
1.8u ldNTP (2. 5mM)，10 ii 1 的 5 X 反應(yīng) Buffer 禾口 0. 5 ii 1 的 Tag (2. 5U/ u 1) DNA 聚合酶(天 根生化科技)，加雙蒸水使反應(yīng)終體積為20 yl。在PCR儀上于94oC加熱3分鐘，然后按照 94oC、45秒，50oC、45秒，72oC、1分鐘45秒的程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，最后在72oC延長(zhǎng) 反應(yīng)10分鐘的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAK基因DNA片段。反應(yīng)完成后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電 泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基因植株均能擴(kuò)增出1. 8kb的DAK條帶(圖7B)和
2.lkb的DAS條帶(圖7C)，經(jīng)PCR確認(rèn)的轉(zhuǎn)基因植株用于RT-PCR分析。實(shí)施例6 :DAK和DAS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)為了考察在含有DAK和DAS基因的轉(zhuǎn)基因植株中DAK和DAS基因的轉(zhuǎn)錄情況， 從F2代轉(zhuǎn)基因植株葉片中抽取總RNA，反轉(zhuǎn)綠成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測(cè)DAK和 DAS基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水平。采用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取RNA， 取植物嫩葉約0. lg，加入1ml的TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離
10心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm)，轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入 0. 5ml異丙醇，混勻室溫放置10min，4°C離心lOmin(12000rpm)，棄上清，沉淀用75 %乙 醇1ml清洗，4°C離心5min(7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20iU焦碳酸 二 乙酉旨(DEPC)處理水溶解 RNA。使用 Reverse Transcriptase (Promega)進(jìn)行 cDNA 的 合成，取植物總 RNA 約 3 ii g-5 ii g，oligo(dT)2iil(5iiM)，用 DEPC 處理水補(bǔ)足至 12 yl， 混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于70°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應(yīng)混合物 9u 1 (5 X reaction buffer5 ii 1 (含 MgCl2)，10mM dNTP mix 1. 5 ii 1，RNA 酶抑制劑 1 ii 1， 1 u 1 ReverseTranscriptase，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，然后37°C保 溫60min，合成cDNA，72°C加熱lOmin滅活酶。以cDNA為模板，用DAS基因上下游特異性引 物(DAS5和DAS3)和DAK基因上下游特異性引物(DAK5和DAK3)作PCR，轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基因 植株均都能擴(kuò)增出2. lkb的DAS條帶(圖8A)和1. 8kb的DAK條帶(圖8B)，證明DAS和 DAK基因可以在轉(zhuǎn)基因擬南芥中成功地轉(zhuǎn)錄。經(jīng)RT-PCR確認(rèn)的轉(zhuǎn)基因植株用于甲醛吸收、 同化和抗性能力分析。實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)液體甲醛吸收速率的檢測(cè)甲醛可與Nash試劑(醋酸氨15 %，冰醋酸0. 3 %，乙酰丙酮0. 2 % )發(fā)生化學(xué) 反應(yīng)產(chǎn)生有顏色的物質(zhì)，該物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為410nm，因此可以制備甲醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)， 根據(jù)HCH0的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可計(jì)算出反應(yīng)液中甲醛的含量，利用該方法可以測(cè)定植物對(duì)甲醛 的吸收速率。取2. Og左右無(wú)菌培養(yǎng)的擬南芥幼苗放入培養(yǎng)瓶中，加入150ml甲醛(4mM)溶 液處理4、30、56、72、80小時(shí)后，取出500 u 1處理液，加水至1ml，再加入lml Nash試劑在 30°C保溫30分鐘后，測(cè)定0D41Q，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出處理液殘存甲醛濃度。結(jié)果如圖10所 示，在處理剛開(kāi)始時(shí)的4-56小時(shí)內(nèi)，野生型植物(WT)處理液中剩余甲醛的濃度與轉(zhuǎn)基因植 物(KSG6和KSG7)與差別不明顯。但是到72小時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物處理液中剩余甲醛濃度大 大低于野生型植株(圖10)，與野生型植物相比，轉(zhuǎn)DAS和DAK的植物吸收甲醛的速度提高 20% 30%，證明DAS和DAK同時(shí)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物能提高植物吸收甲醛的能力。實(shí)施例8 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株代謝和同化甲醛能力的檢測(cè)為了證明甲醛被植物吸收后能被代謝和同化成為植物細(xì)胞的組成成分，因此用放 射性甲醛(H14CHO)進(jìn)行示蹤試驗(yàn)。有放射活性的H14CHO被植物吸收后如果被轉(zhuǎn)化為各種 代謝途徑的中間產(chǎn)物將出現(xiàn)在植物葉片的可溶性成分中，使這部分的14c活性增強(qiáng)。通過(guò)各 種代謝途徑的中間產(chǎn)物最后還會(huì)有一部分H14CHO最終被同化為植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，如多糖 (淀粉，纖維素等)及蛋白質(zhì)即植物的不溶性成分，使這部分的14C活性增強(qiáng)。通過(guò)測(cè)定植 物經(jīng)H14CH0處理后可溶性和不溶性部分的14c活性即可獲得植物代謝和同化甲醛的能力。 選無(wú)菌栽培的擬南芥小苗，用無(wú)菌水洗去根部的瓊脂，稱(chēng)取o. 5g用pH值為6. 0的H14CH0 溶液(H14CH0 2u Ci, HCH0 2mM/L, KHC03 5mM/L, MES 0. 1% ) 30ml 浸泡，25°C持續(xù)光照振 蕩培養(yǎng)50h。處理結(jié)束后用冷卻蒸餾水洗去植物表面游離甲醛后在液氮中磨碎，再用10% Trichloricacid(TCA)抽提。抽提完畢離心得到可溶性部分(上清液)和不溶性部分(殘 渣)，不溶性部分連續(xù)使用5% TCA洗1次，50%乙醇洗2次，100%乙醇洗1次。最后用液 閃儀(Hidex 0y, Finland)測(cè)定甲醛處理液、上清液和殘?jiān)?4C同位素活性(圖11)。由 圖11的數(shù)據(jù)可知經(jīng)H14CH0處理50小時(shí)后，轉(zhuǎn)基因植物用TCA抽提到的可溶性部分和不溶 性成份的14C放射活性明顯大于野生型植物，而其處理液中14C同位素活性則明顯低于野生
11型植物，這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物代謝和同化甲醛的能力明顯強(qiáng)于野生型植物。實(shí)施例9 轉(zhuǎn)DAS和DAK基因擬南芥對(duì)甲醛的抗性檢測(cè)為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植物對(duì)氣體甲醛的抗性，將轉(zhuǎn)基因植物幼苗移入有MS培養(yǎng)基的 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，約2個(gè)月后在培養(yǎng)瓶中放置一個(gè)開(kāi)口 500 yl的離心管，并在離心管中加入 一定量(13iU)37%的甲醛溶液。25°C持續(xù)光照培養(yǎng)48天后，觀(guān)察轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)狀況 (圖12)。結(jié)果說(shuō)明同時(shí)轉(zhuǎn)入DAS和DAK的植物比野生型植物的長(zhǎng)勢(shì)好，葉片白化現(xiàn)象較輕， 證明轉(zhuǎn)DAS和DAK基因的植物對(duì)氣體甲醛抗性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植物吸收甲醛的速度提高20% 30%，在用14C標(biāo)記的甲 醛做示蹤試驗(yàn)時(shí)轉(zhuǎn)基因植物也顯示出較野生型強(qiáng)的甲醛代謝能力。在含有外源高濃度的氣 體甲醛環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)狀態(tài)好于野生型，葉片白化現(xiàn)象較輕，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因 植物對(duì)甲醛的抗性強(qiáng)于野生型植物。
權(quán)利要求
植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS，為含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶Rubisco 3C小亞基基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrbcS及其轉(zhuǎn)移肽序列*T、甲基營(yíng)養(yǎng)酵母菌假絲酵母的二羥基丙酮合成酶DAS基因和巴斯德畢赤酵母的二羥基丙酮激酶DAK基因的植物表達(dá)載體。
2.如權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中的DAS基因的GenBank登錄號(hào)為AF086822， DAK基因的GenBank登錄號(hào)為AF019198。
3.如權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其起始載體為pK7m34GW2-8m21GW3。
4.如權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrbcS和葉綠體定位序 列是從番茄的基因組中分離出來(lái)的rbcS-3C的啟動(dòng)子及其葉綠體基質(zhì)定位序列，是一個(gè)由 HindHI切割產(chǎn)生的1. 7kb的DNA片斷。
5.植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS，由下述方法構(gòu)建而成(1)入門(mén)載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的構(gòu)建用 SphI 和 Xhol 切開(kāi) pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 和 pENTR*-PrbcS-*T_DAK，回 收 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 被切割后產(chǎn)生的載體 pEN-L4*-PrbcS-*T_L3* 片斷及 pENTR*-PrbcS-*T-DAK被切割產(chǎn)生的DAK基因的DNA片段，用連接酶把載體片段和DAK基因 的DNA片段連接起來(lái)獲得入門(mén)載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* ；(2)植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的構(gòu)建通過(guò) Gateway 的 LR 反應(yīng)，把入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS_*T_DAK 片段和pENTR*-PrbcS-*T-DAS中的PrbcS_*T_DAS片段同時(shí)亞克隆到Gateway的目的載體 pK7m34GW2-8m21GW3 中，獲得植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DASo
6.植物表達(dá)載體pK2-35S-PrbCS-*T-hps/phi的構(gòu)建方法，包括下述步驟(1)入門(mén)載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的構(gòu)建用 SphI 和 Xhol 切開(kāi) pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 和 pENTR*-PrbcS-*T_DAK，回 收 pEN-L4*-PrbcS-*T—GFP-L3* 被切割后產(chǎn)生的載體 pEN-L4*-PrbcS-*T_L3* 片斷及 pENTR*-PrbcS-*T-DAK被切割產(chǎn)生的DA基因的DNA片段，用連接酶把載體片段和DAK基因 的DNA片段連接起來(lái)獲得入門(mén)載體pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* ；(2)植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的構(gòu)建通過(guò) Gateway 的 LR 反應(yīng)，把入門(mén)載體 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS_*T_DAK 片段和pENTR*-PrbcS-*T-DAS中的PrbcS_*T_DAS片段同時(shí)亞克隆到Gateway的目的載體 pK7m34GW2-8m21GW3 中，獲得植物表達(dá)載體 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DASo
7.植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS在提高轉(zhuǎn)基因植物吸收 和耐受外源甲醛能力的遺傳工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種提高植物同化和吸收甲醛能力的植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS及其構(gòu)建方法和在提高植物吸收和耐受外源甲醛能力中的應(yīng)用。提高植物同化和吸收甲醛代謝能力的植物表達(dá)載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS，為含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)3C小亞基基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)及其轉(zhuǎn)移肽序列(*T)、甲基營(yíng)養(yǎng)酵母菌假絲酵母(Candida boidinii)的二羥基丙酮合成酶(DAS)基因和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的二羥基丙酮激酶(DAK)基因(雙基因)的植物表達(dá)載體，用該載體做一次轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可以完成DAS和DAK兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)化操作。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101838666SQ20101011131
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月22日
發(fā)明者孫振, 宋中邦, 李昆志, 李莉, 梁峰, 潘正波, 肖素勤, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)