專利名稱：二羥基丙酮激酶的原核表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達(dá)二羥基丙酮激酶蛋白 (DAK)的原核表達(dá)載體pET28a-DAK及其在DAK蛋白的原核表達(dá)和DAK蛋白抗體制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲醛是一種無色，有強(qiáng)烈刺激氣味的氣體，易溶于水、醇和醚，被廣泛用于工業(yè)生 產(chǎn)中，是膠粘劑工業(yè)應(yīng)用最廣泛的化學(xué)原材料。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高， 各種原料制成的建筑裝飾材料已走入各種室內(nèi)公共場所和家庭，使甲醛成為室內(nèi)空氣污染 公認(rèn)最具代表性的化學(xué)物質(zhì)。室內(nèi)空氣中游離甲醛濃度在中國規(guī)定的允許值是0.08(mg/ 立方米)，對新裝修住宅的調(diào)查結(jié)果表明室內(nèi)空氣中甲醛濃度是室外空氣的6. 65倍，為 0.492mg/m3，在門窗關(guān)閉時(shí)甲醛濃度超標(biāo)100倍。甲醛為較高毒性物質(zhì)，它反應(yīng)能力極強(qiáng)， 能與蛋白質(zhì)，核酸和脂類產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)，是一種非常活潑的化合物，因此對所有的 生物來說都有很高的毒性。長期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻煙癌、 結(jié)腸癌、腦瘤、月經(jīng)紊亂、細(xì)胞核的基因突變，DNA單鏈內(nèi)交連和DNA與蛋白質(zhì)交連及抑制 DNA損傷的修復(fù)、妊娠綜合癥、引起新生兒染色體異常、白血病，這就是所謂的裝修綜合病 (sick-house)0相對于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游離甲苯二異氰酸酯(TDI)、揮發(fā)性有機(jī)化合物 (V0C)等有害物質(zhì)來說，甲醛具有潛伏周期長(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、 危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三種一是使用環(huán)保材料；二是開窗 通風(fēng)；三是用植物或除污劑清除污染，使用除污劑有二次污染的可能。用室內(nèi)栽培植物清除 甲醛污染，是最自然、最環(huán)保的方式，科學(xué)研究證明確實(shí)有些植物能夠吸收分解甲醛，但吸 收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104 1301-1309)。甲基營養(yǎng)酵母具有利用一碳化合物甲醇的高效代謝機(jī)制，在甲醇的代謝途徑中， 甲醇首先被乙醇氧化酶氧化為甲醛，甲醛是甲醇代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵性的中間產(chǎn)物，它 處于甲醇同化和異化途徑的分支點(diǎn)上。二羥基丙酮合成酶(DAS)催化甲醛同化途徑中的 第一個(gè)反應(yīng)，DAS催化酵母菌中的甲醛和木酮糖5-P形成二羥基丙酮和甘油醛3-磷酸。甲 醇被乙醇氧化酶氧化成甲醛后，由它把甲醛固定到D-木酮糖5-磷酸分子上(Yurimoto等， 2005，The Chemical Record. 5 :367_375)。通過突變體和酶學(xué)特性分析證實(shí)了 DAS的生理 作用是甲醇同化作用的關(guān)鍵酶。目前已從甲基營養(yǎng)型酵母菌假絲酵母(Candida boidinii) 中克隆到編碼DAS的基因(DHAS1)，進(jìn)一步的調(diào)查結(jié)果證實(shí)DAS主要參與這種酵母菌細(xì) 胞中甲醛的同化作用而非異化作用或脫毒作用(Sakai等，1998，American Society for Microbiology. 180 :5885_5890)。二羥基丙酮對酵母細(xì)胞來說是有毒的化合物，在酵母菌中二羥基丙酮激酶(DAK) 參與二羥基丙酮的脫毒作用，它催化的反應(yīng)使二羥基丙酮磷酸化，形成無毒性的磷酸二羥 丙酮，可為酵母細(xì)胞所利用。該酶普遍存在于大多數(shù)的生物體中，結(jié)合遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法，已從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆到兩個(gè)編碼DAK的基因(YML070W/DAKl和YML053W/DAK2)，它們所編碼的蛋白質(zhì)是同型二聚體(Molin等，2003，The journal of biological chemistry. 278 1415-1423)。從巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中 克隆到的DAK基因編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)中(LUers等，Yeast. 1998，Jun 15，14(8) 759-71)。5-磷酸木酮糖和磷酸二羥丙酮及甘油醛3-磷酸都是開爾文循環(huán)的中間產(chǎn)物，本 申請人:的研究結(jié)果證明(見本申請人的另一申請專利提高植物吸收和耐受甲醛的方法及 其植物載體與應(yīng)用，申請?zhí)枮?00810058341. 9)在植物的葉綠體中過量表達(dá)來自酵母菌的 DAS和DAK，可以用在轉(zhuǎn)基因植物中利用DAS和DAK構(gòu)建一條甲醛同化途徑，提高植物同化 和吸收甲醛的能力。因此DAS和DAK的過量表達(dá)可用于提高觀賞植物代謝甲醛能力的分 子育種，把DAS和DAK整合到植物基因組后，DAS和DAK蛋白在植物中的表達(dá)量是轉(zhuǎn)基因是 否起作用的關(guān)鍵，其中DAK蛋白特異性抗體是檢測轉(zhuǎn)基因植物中DAK蛋白表達(dá)水平的有效 工具。目前雖然有些研究用經(jīng)典方法直接從裂殖酵母(John et al. , Journal ofGeneral Microbiology，1986，132 :2611-2614)、大腸桿菌(Bachler et al.，The EMBO Journal, 2005，24 :283-293)、克蕾伯氏菌(Johnson et al.，Journal of Bacteriology, 1984,160 55-60)中純化到DAK蛋白并研究這些微生物中DAK的生理生化特性。另外用類似的方法從 法氏檸檬桿菌(Citrobacter freundii)中也純化到DAK蛋白并用于研究其晶體結(jié)構(gòu)。但 是至今仍然沒有研究純化畢赤酵母的DAK并制備其特異性的抗體。由于天然的酵母菌中 DAK的表達(dá)量不高，所以用經(jīng)典的方法純化DAK蛋白純化操作過程很復(fù)雜，通常用這類方法 純化DAK蛋白需要大規(guī)模培養(yǎng)酵母菌，過幾種性質(zhì)不同的柱子，并用專業(yè)的儀器控制洗脫 條件，蛋白純化的成本很高，因此這類方法不方便重復(fù)使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種DAK的原核表達(dá)載體(pET28a_DAK)，該載體含有T7啟動 子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)和DAK基因及一個(gè)組氨酸標(biāo)簽，利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿 菌(BL21)，可實(shí)現(xiàn)DAK蛋白的高水平表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)大部分為可溶性蛋白，用親和 層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出高純度的重組DAK蛋白質(zhì)，用于DAK抗體的 制備或生化特性分析。DAK重組蛋白表達(dá)量很高，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，純化DAK蛋 白的操作相當(dāng)簡單，成本也很低，極易重復(fù)使用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案一種原核表達(dá)載體，在該原核表達(dá)載體中含有煙草DAK基因。所述原核表達(dá)載體的起始載體為pET_28a ；所述DAK基因上游添加有T7的啟動子 和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS ；上述載體中的二羥丙酮激酶基因DAK來源于巴斯德畢赤酵母， 在GenBank中的登錄號為AF019198。在上述載體中，DAK基因的上游有T7啟動子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，T7啟動 子的下游有操作子序列，可被IPTG誘導(dǎo)。為了使DAK基因表達(dá)的重組蛋白DAK能用親和層 析純化，緊靠DAK基因的起始密碼子上游還有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽序列。本發(fā)明的原核表達(dá)載體由下述方法構(gòu)建而得(1)從GenBank中查找煙草DAK的全長基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對引物
DAK5 :5，-CATGGCTAGTAAACATTGGGATTAC-3，DAK3 :5，-CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG-3，5’端引物添加一個(gè)C堿基，并由此形成NcoI酶切位點(diǎn)；3’端引物末端加XhoI酶 切位點(diǎn)；以巴斯德畢赤酵母基因組為模板通過PCR擴(kuò)增，得到DAK的全長DNA序列；(2)回收并純化DAK全長基因片段，并將其連接到pMDlS-Τ載體上，采用堿裂解法 提取質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD-DAK ；(3)構(gòu)建原核載體pET28a-DAK，用NcoI和XhoI雙酶切pMD-DAK和pET28a，并回收 純化DAK基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測和酶 切檢測，獲得原核表達(dá)載體pET28a-DAK。本發(fā)明的原核表達(dá)載體在制備重組DAK蛋白中的應(yīng)用，在制備DAK特異性抗體中 的應(yīng)用。將上述載體熱刺激法導(dǎo)入大腸桿菌蛋白表達(dá)專用受體菌株BL21中，獲得轉(zhuǎn)化子 菌落，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)可高水平表達(dá)DAK重組蛋白。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用IPTG于28°C誘導(dǎo)6小時(shí)后可使DAK重組蛋白達(dá)到很高 的表達(dá)量，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)50 %為可溶性蛋白，50 %形成包涵體蛋白，各占大腸桿菌總蛋 白50%，用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出高純度的重組DAK蛋白質(zhì)， 可用于DAK抗體的制備或生化特性分析，為DAK特異性抗體的制備提供了一條新途徑。


圖1、巴斯德酵母菌基因組DNA的檢測，M λ DNA/HindIII DNA marker ； 1-6 假絲 酵母基因組；圖2、DAK基因的TA克隆策略；圖3、DAK基因TA克隆質(zhì)粒的檢測，(A)重組質(zhì)粒pMD18_DAK的電泳檢測。1 正對 照(分子量為4. 5kb的質(zhì)粒DNA) ；2-5 重組質(zhì)粒pMD18_DAK。(B)重組質(zhì)粒pMD18_DAK的 酶切檢測。M =DNA marker III ； 1-2 用 EcoRI 酶切的 pMD18_DAK。(C)重組質(zhì)粒 pMD18_DAK 的 PCR檢驗(yàn)。M:DNA marker III ；1-2 以 pMD18_DAK 為模版用 DAK5 和 DAK3 引物擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物；圖4、DAK基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建策略；圖5、DAK基因原核表達(dá)載體的檢測，(A)重組質(zhì)粒pET28a_DAK的電泳檢測。1 正 對照(分子量為7. Okb的質(zhì)粒DNA) ； 2-4 重組質(zhì)粒pET28a-DAK。(B)重組質(zhì)粒pET28a_DAK 的酶切檢測。M =DNA marker III ；1 沒有酶切的質(zhì)粒pET28a_DAK ；2-4 用EcoRV酶切的 pET28a-DAK。(C)重組質(zhì)粒 pET28a_DAK 的 PCR 檢驗(yàn)。M =DNAmarker III ;1 正對照(以 PMD18-DAK為模版用DAK5和DAK3引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物)；2-5 重組質(zhì)粒pET28a_DAK的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；圖6、DAK重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化；圖7、可溶性和不溶性DAK重組蛋白的分布；圖8、DAK重組蛋白的純化。
具體實(shí)施例方式
試劑與儀器試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、植物遺傳轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)基因植物 鑒定和檢測所需的各種試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制 齊IJ、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自博大泰克生物 技術(shù)有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑購自invitrogen公司。其余試劑均為國產(chǎn) 分析純。儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無特別說明 均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)基因組DNA的制備與檢測本發(fā)明所用的巴斯德畢赤酵母(Candida boidinii)購自中國工業(yè)微生物菌種保 藏中心，巴斯德畢赤酵母菌基因組DNA的制備采用CTAB法，。取1. 5mL菌液于4°C 4000rpm 離心 2min，棄盡上清液，收集菌體。加 400 μ 1 2 X CTAB (Tris-HCl pH 7. 5100mM,EDTA 20mM, NaCl 1. 4M, CTAB 2% )勻漿，65°C保溫20min，加500 μ 1氯仿混勻后于室溫下13000rpm離 心IOmin0轉(zhuǎn)移上清，加50 μ 1的10% CTAB,加650 μ 1異丙醇置于室溫1小時(shí)，4°C 12000rpm 離心25min.，沉淀用500 μ 1 75%酒精洗一次.，真空干燥，加20 μ 1含有RNase的TE溶解， 37°C保溫一小時(shí)。取2μ 1基因組DNA用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果(圖1)說明 提取到的基因組DNA質(zhì)量符合要求。實(shí)施例2 =DAK基因的擴(kuò)增與TA克隆DAK基因的擴(kuò)增及TA克隆的策略如圖2所示，首先從GenBank中查找DAK的全長 基因序列(DAK基因的GenBank登錄號為AF019198)，并設(shè)計(jì)一對引物，序列如下DAK5 CATGGCTAGTAAACATTGGGATTACDAK3 CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG5’端引物DAK5末端加一個(gè)C，由此形成NcoI酶切位點(diǎn)；3，端引物DAK3末端加 XhoI酶切位點(diǎn)。在PCR反應(yīng)混合液中加入10 μ g的巴斯德畢赤酵母基因組DNA作為模板，同時(shí)加 入 50 μ g 的特異性引物 DAK5 和 DAK3、1. 8 μ IdNTP (2. 5mM)，5 μ 1 的 Long Taq 反應(yīng) Buffer 和0. 3 μ 1的long Taq (2. 5U/ μ 1)聚合酶(購自天根生化科技)，加雙蒸水使反應(yīng)終體積為 20 μ 1。在PCR儀上于94°C加熱3分鐘，然后按照94°C、45秒，55 °C >45秒，72°C、1分鐘45 秒的程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，最后在72°C延長反應(yīng)10分鐘的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增得 到DAK基因。反應(yīng)完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥詹⒓兓疍AK全長 基因DNA，然后用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒亞克隆到pMD18_T (大連寶生物公司) 載體上，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒的說明書進(jìn)行，反應(yīng)過夜后用反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) DH5a (購自天根生化科技公司)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測 其大小(圖3A)，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測。用EcoRI酶切重組質(zhì) 粒，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒PMD-DAK有二條帶，其中一 條分子量大為4. 3kb的載體帶，另一條分子量較小的為0. 23kb DAK DNA片段(圖3B)。選 取酶切檢測正確的重組質(zhì)粒PMD18-DAK做進(jìn)一步的PCR檢測，用DAK基因上下游特異性引物DAK5和DAK3作PCR，亞克隆成功的重組質(zhì)粒均能擴(kuò)增出1. 8kb左右的DAK基因DNA片 段(圖3C)，測序分析證明重組質(zhì)粒載體中插入的DAK全長基因序列正確。再次確認(rèn)是連 接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒 PMD18-DAK。實(shí)施例3 原核表達(dá)載體pET28a_DAK的構(gòu)建pET28a-DAK 的構(gòu)建策略如圖 4 所示，用 Nco I (Fermentas)和 Xho I (Fermentas) 切開純化的原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a(購自Novagen公司)和pMD18_DAK，通過瓊脂糖 凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收pET28a被切割后產(chǎn)生的載體片 斷pET28a(5.4kb)及pMD18_DAK被切割產(chǎn)生的DAK基因的DNA片斷(1.8kb)，然后用寶生 物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pET28a載體片段和DAK基因的DNA片斷產(chǎn)生原核表達(dá) 載體pET28a-DAK。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5 α， 購自天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50yg/ml)的平板上， 于37°C過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖5A)，用 EcoRV(Fermentas)進(jìn)行酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生兩條帶，分 子量小的一條為2. 36kb，另一條為4. 75kb (圖5B)。選出連接成功的質(zhì)粒載體pET28a_DAK， 用DAK基因上下游特異性引物進(jìn)行PCR檢測，亞克隆成功的重組質(zhì)粒均能擴(kuò)增出1. Skb左 右的DAK基因DNA片段(圖5C)，再次確認(rèn)是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α， 挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pET28a-DAK。實(shí)施例4 重組DAK蛋白的表達(dá)與表達(dá)條件的優(yōu)化用原核表達(dá)載體pET28a_DAK轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞(DH5 α，天根生化 科技)。挑取單菌落加入2mL LB (含有Km 50mg/L)中，37°C過夜培養(yǎng)(OD600值約為1. 5)。 加0. 5和1. OmM的IPTG于28°C誘導(dǎo)0_8小時(shí)后，離心收集菌體，去掉上清液，加入0. Iml SDS-PAGE上樣緩沖液(Sample loading buffer)，于95°C加熱10分鐘煮沸菌體。冰浴冷卻 后于4°C離心(12000rpm)10分鐘，取上清作SDS-PAGE。根據(jù)文獻(xiàn)資料和軟件分析預(yù)測目的 蛋白大小為70kDa左右，采用12%分離膠。SDS-PAGE電泳參看《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三 版)》。SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖6)表明用IPTG于28°C誘導(dǎo)的時(shí)間越長，DAK蛋白表達(dá)量越 高，用LOmM的IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)后DAK蛋白表達(dá)量最高。表達(dá)的重組蛋白質(zhì)50%為可溶性 蛋白(圖7)，50%形成包涵體蛋白(圖7)，各占大腸桿菌總蛋白50% (圖7)。實(shí)施例5 重組DAK蛋白的純化用原核表達(dá)載體pET28a_DAK轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落入 IOOOmL LB (含有 Kan 50mg/L)中，37°C培養(yǎng)至 0D600 值約為 0. 6。加 1. Ommol/LIPTG 誘導(dǎo)后 6小時(shí)，離心收集菌體，用wash buffer洗2次，加入30ml蛋白抽提緩沖液(磷酸鈉緩沖液 (pH7. 4) 20mmol/L)，懸浮菌體。于冰浴中超聲波破碎細(xì)菌細(xì)胞(工作3秒，間歇9秒，功率 30W，全程30分鐘)。于4°C離心(6000g)30分鐘，轉(zhuǎn)移上清，過0.45um濾膜。用親和層析 柱分離純化可溶性DAK重組蛋白。參看His-Trap HP說明書，首先用5柱體積純水洗柱，用 5柱平衡緩沖液(磷酸鈉緩沖液(pH7. 4)20mmOl/L，5mM咪唑)平衡柱子，然后上蛋白樣品， 用5柱體積濃 度為30、100、200、400、500mM的咪唑緩沖液(磷酸鈉鹽緩沖液20mmol/L，NaCl 0. 5mmol/L,咪唑30-500mmol/L)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，每管2mL。最后用分別用5柱 體積純水和5柱體積20%乙醇洗柱。測定及各洗脫液中蛋白的濃度，用50ug跑SDS-PAGE檢測蛋白的純度(圖8)，圖8的數(shù)據(jù)說明DAK重組蛋白在400mM的咪唑緩沖液中被洗脫下來，蛋白質(zhì)的純度達(dá)90%，加70%硫酸銨沉淀洗脫液中的蛋白質(zhì)，用IXPBS溶解并透析后 可用于DAK抗體的制備或生化特性分析。
權(quán)利要求
一種原核表達(dá)載體，含有巴斯德畢赤酵母的DAK基因。
2.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體，其特征在于所述原核表達(dá)載體的起始載體為 pET-28a。
3.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體，其特征在于所述DAK基因上游添加有T7的啟動 子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操縱子序列，緊靠DAK 基因的起始密碼子上游還有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽序列。
4.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體，其特征在于上述載體中的二羥丙酮激酶基因 DAK來源于畢赤酵母，其GenBank登錄號為AF019198。
5.一種原核表達(dá)載體，由下述方法構(gòu)建而得(1)從GenBank中查找巴斯德畢赤酵母DAK的全長基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對引物DAK5 :5’ -CATGGCTAGTAAACATTGGGATTAC-3’ DAK3 :5’ -CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG-3’5’端引物添加一個(gè)C堿基，并由此形成Ncol酶切位點(diǎn)；3’端引物末端加Xhol酶切位 點(diǎn)；以畢赤酵母基因組為模板通過PCR擴(kuò)增，得到DAK的全長DNA序列；(2)回收并純化DAK全長基因片段，并將其連接到pMDIS-T載體上，采用堿裂解法提取 質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD-DAK ；(3)構(gòu)建原核載體pET28a-DAK，用Ncol和Xhol雙酶切pMD_DAK和pET28a，并回收純 化的DAK基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測和酶切檢 測，獲得原核表達(dá)載體pET28a-DAK。
6.權(quán)利要求1-5的原核表達(dá)載體在制備重組DAK蛋白中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1-5的原核表達(dá)載體在制備DAK特異性抗體中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-5的原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括下列步驟(1)從GenBank中查找巴斯德畢赤酵母DAK的全長基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對引物DAK5 :5’ -CATGGCTAGTAAACATTGGGATTAC-3’ DAK3 :5’ -CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG-3’5’端引物添加一個(gè)C堿基，并由此形成Ncol酶切位點(diǎn)；3’端引物末端加Xhol酶切位 點(diǎn)；以畢赤酵母基因組為模板通過PCR擴(kuò)增，得到DAK的全長DNA序列；(2)回收并純化DAK全長基因片段，并將其連接到pMDIS-T載體上，采用堿裂解法提取 質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD-DAK ；(3)構(gòu)建原核載體pET28a-DAK，用Ncol和Xhol雙酶切pMD-DAK和pET28a，并回收純化 DAK基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測和酶切檢測，獲 得原核表達(dá)載體pET28a-DAK。
全文摘要
本發(fā)明提供一種巴斯德畢赤酵母DAK的原核表達(dá)載體(pET28a-DAK)，該載體含有T7啟動子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)和DAK基因及一個(gè)組氨酸標(biāo)簽，從巴斯德畢赤酵母中克隆出DAK基因，用T7啟動子控制它在大腸桿菌中的表達(dá)，利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)實(shí)現(xiàn)DAK蛋白的高水平表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白質(zhì)大部分為可溶性蛋白，占大腸桿菌可溶性總蛋白50％，用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出高純度的重組DAK蛋白質(zhì)，用于DAK抗體的制備或生化特性分析。DAK重組蛋白表達(dá)量很高，不需要大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，純化DAK蛋白的操作相當(dāng)簡單，成本也很低，極易重復(fù)使用。
文檔編號C07K16/40GK101845452SQ20101011733
公開日2010年9月29日 申請日期2010年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日
發(fā)明者孫振, 張婧, 肖素勤, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學(xué)