專利名稱：hsa-miR-150的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與胃癌分化相關(guān)的hsa-miR-150的用途。
背景技術(shù)：
胃癌是世界上高發(fā)的惡性腫瘤之一，在1990-1992年的中國惡性腫瘤死亡抽樣 調(diào)查顯示，胃癌的死亡率接近25. 2/10萬人(男性32. 8/10萬人，女性17. 0/10萬人)，占 1990-1992年死亡的腫瘤病人的23. 2%，居各類惡性腫瘤之首。雖然近年來胃癌的死亡率 有明顯下降，但是依然很高，多數(shù)胃癌患者是發(fā)現(xiàn)了臨床癥狀如腹部不適、隱痛、泛酸、曖氣 或消瘦、黑便等癥狀后進(jìn)行胃鏡和活檢確診，一經(jīng)確診，多為晚期，錯過了治療的最佳時期。胃癌的篩查手段包括影像學(xué)檢查、胃鏡加活檢、血清學(xué)檢測如胃蛋白酶元、CEA、 CA系列抗原等。目前最有效的手段就是胃鏡加活檢，胃鏡檢查和病理學(xué)診斷均基于形態(tài)學(xué) 的判斷，對于操作人員的經(jīng)驗技術(shù)有較高的要求，這種非客觀、非標(biāo)準(zhǔn)化的檢測存在較大的 誤診/漏診率，而且對有不典型增生、胃癌進(jìn)展期惡性程度變化等組織學(xué)特征進(jìn)行的區(qū)分， 目前尚難以有明確的界限。小RNA(microRNA或miRNA)于1993年首次在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)，隨后在2001年正 式命名為microRNA，是一類約18_25nt的內(nèi)源性非編碼RNA (noncoding RNA)，miRNA結(jié)合 mRNA的非編碼區(qū)的3’端，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，緊密結(jié)合會降解靶標(biāo)mRNA，結(jié)合 不夠緊密則阻止mRNA的翻譯從而抑制靶基因表達(dá)。miRNA對增殖、分化、凋亡以及內(nèi)環(huán)境的 穩(wěn)態(tài)均有重要意義，miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性。miRNA在許多腫瘤中均有差異表達(dá)，許多腫瘤有其特異性的miRNA表達(dá)譜。 hsa-miR-150在成熟B細(xì)胞和T細(xì)胞特異性表達(dá)，c-Myb是hsa-miR-150的保守性靶標(biāo)， hsa-miR-150調(diào)控c-Myb的表達(dá)且在一定范圍內(nèi)有劑量依賴效應(yīng)，與c_Myb的表達(dá)水平負(fù)相 關(guān)，兩者之間的交互反應(yīng)不僅對B細(xì)胞成熟分化、而且對胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生均有重要意 義。hsa-miR-150在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病中高表達(dá)。目前尚無關(guān)于hsa-miR-150與胃癌分化相關(guān)的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決缺乏客觀準(zhǔn)確地診斷腫瘤惡性程度的方法的技術(shù)問題，提供一種與 胃癌分化相關(guān)的hsa-miR-150的用途，可作為輔助診斷腫瘤惡性程度的標(biāo)志物。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種hsa-miR-150的用途，用于制備輔助診斷腫瘤 惡性程度的產(chǎn)品。優(yōu)選的，所述輔助診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn)品包括用實時定量PCR、或miRNA芯片 診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn)品。所述用實時定量PCR診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn)品至少包括特異性擴(kuò)增hsa-miR-150的引物。所述用miRNA芯片診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn)品包括與hsa-miR-150特異性結(jié)合的 探針。在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述 探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可 以。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于輔助診斷腫瘤惡性程度的試劑盒，所述 試劑盒包含特異性針對hsa-miR-150的引物或探針。利用本發(fā)明的試劑盒，可以檢測腫瘤病人hsa-miR-150的表達(dá)情況，如果 hsa-miR-150的表達(dá)量顯著升高，表明腫瘤分化低，惡性高，治療效果差，如果hsa-miR-150 的表達(dá)量正常，表明腫瘤分化好，惡性低，治療效果佳。分化在腫瘤病理學(xué)中常指腫瘤細(xì)胞 與其起源程序的成熟細(xì)胞(相應(yīng)的正常細(xì)胞)的相似程度。在形態(tài)、功能、代謝、行為等方 面，腫瘤細(xì)胞越相似于相應(yīng)的正常細(xì)胞，則為高分化，否則就是低分化，腫瘤細(xì)胞的分化程 度是腫瘤良惡性鑒別中的主要依據(jù)。一般地，分化高的腫瘤具有良性行為，分化低的腫瘤多 有惡性表現(xiàn)。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種hsa-miR-150的用途，用于制備誘導(dǎo)腫瘤分 化的藥物。優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)腫瘤分化的藥物包括抗hsa-miR-150的反義寡核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種hsa-miR-150的用途，用于篩選誘導(dǎo)腫瘤分 化的藥物。上述腫瘤包括胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、口腔鱗 狀細(xì)胞癌、或白血病腫瘤，優(yōu)選為胃癌。上述hsa-miR-150 為 SEQ ID NO 1 所示的 miRNA 序列。本發(fā)明與胃癌分化相關(guān)的hsa-miR-150，可作為輔助診斷腫瘤惡性程度的標(biāo)志物， 也可作為預(yù)測腫瘤病人生存率的標(biāo)志物，同時還可作為胃癌或其他腫瘤的藥物治療靶標(biāo)， 為設(shè)計和篩選誘導(dǎo)腫瘤分化的藥物提供新的靶點。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實施例1胃癌組織樣本中提取的總RNA的2100峰圖；圖2是本發(fā)明實施例1的hsa-miR-150在胃癌和癌旁組織中差異表達(dá)的miRNA芯 片結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實施例2的hsa-miR-150在胃癌和癌旁組織中差異表達(dá)的實時定量 PCR曲線圖；圖4是本發(fā)明實施例2的hsa-miR-150在胃癌和癌旁組織中差異表達(dá)的芯片與定 量PCR結(jié)果比較圖。
具體實施例方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。實施例1 miRNA芯片實驗檢測胃癌組織中差異表達(dá)的miRNA1.臨床樣品的準(zhǔn)備胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，留取26對胃癌及其癌旁正常組織，-80°C凍存，液氮運(yùn)輸。臨 床病理信息顯示，該26個胃癌組織中，包含低分化、中分化及中低分化的胃癌組織。胃癌的 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照全國胃癌病理協(xié)作組擬定的胃粘膜活檢病理診斷的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。2.總RNA的提取、質(zhì)量檢測和純化(1)冰凍切片26對胃癌及其癌旁正常組織經(jīng)過HE染色檢查后，8 u m連續(xù)切5 6片，經(jīng)重新病 檢確定細(xì)胞質(zhì)量后-80°C保存于1. 5ml離心管中。(2)總RNA的提取利用mirVana miRNA提取試劑盒(Ambion)抽提總RNA，具體步驟詳見mirVana miRNA提取試劑盒說明。(3)總RNA的質(zhì)量檢測用Agilent 2100 bioanalyzer分析提取的RNA，得2100峰圖(見圖1)，清晰的峰 形和最低的背景熒光顯示完整、未降解的RNA。3. miRNA 芯片實驗(1)實驗過程miRNA芯片采用Agilent Human miRNA 1. 0芯片，該芯片可同時檢測470個人類和 64個病毒miRNA的表達(dá)。總RNA利用miRNA標(biāo)記試劑和雜交試劑盒(Agilent Technologies)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo) 記后的miRNA在55°C，20RPM進(jìn)行芯片雜交(Agilent Technologies, G4470A)，掃描之前分 別用GE清洗緩沖液1和GE清洗緩沖液2室溫各洗5min，然后用Agilent芯片掃描儀掃描 芯片。將掃描得到的圖像利用圖像分析采集軟件8. 1 (Feature Extraction Software 8.1， AgilentTechnologies)分析得到原始數(shù)據(jù)。(2)數(shù)據(jù)預(yù)處理和差異篩選miRNA芯片所得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過均一化、背景質(zhì)量檢測得到miRNA表達(dá)值，利用 MeV 4. 5的SAM模塊結(jié)合臨床資料的轉(zhuǎn)移分型進(jìn)行分析。(3)結(jié)果應(yīng)用SAM軟件篩選在26對胃癌和癌旁組織中差異表達(dá)的miRNA(FDR = 0)，找到了 hsa-miR-150(圖 2)，其序列為 UCUCCCAACCCUUGUACCA⑶G(SEQ ID NO :1)。在圖 2 中，MD 表 示中分化，M-PD表示中低分化，PD表示低分化，上方是樣本編號，下面是表達(dá)圖譜，紅色表 示miRNA上調(diào)(相對于癌旁)，綠色表示下調(diào)，黑色表示未變化。實施例2實時定量PCR檢測hsa-miR-150表達(dá)的改變(1)內(nèi)參設(shè)定及引物設(shè)計、合成內(nèi)參選用U6-2，miRNA的定量PCR引物由特異性引物和通用引物構(gòu)成，其 中通用引物由qiagen miScript SYBR Green PCR試劑盒自帶；特異性引物序列為 TCTCCCAACCCTTGTACCAG(SEQ ID NO 2)，由本公司自己合成。
(2) RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成RNA的提取、質(zhì)量檢測和純化步驟同實施例1所述。逆轉(zhuǎn)錄采用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen)，在PCR管中加入5XRT緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶混合液、模板RNA、無Rnase酶水，輕輕混勻，置于冰上。逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)程序為37°C 60分鐘；再95°C 5分鐘。產(chǎn)物_20°C保存。(3)實時定量PCR反應(yīng)采用ABI 7300 定量 PCR 儀，試劑采用 miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen)，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 10稀釋。實時定量PCR反應(yīng)體系2X SYBR Green混合液 10ul，10XmiScript 通用引物 2ul，10X 成熟 miRNA 的引物(miScript Primer Assay)，無 Rnase酶水，稀釋cDNA。反應(yīng)程序為95°C 15分鐘，1個循環(huán)；再94°C 15秒，55°C 30秒， 70 °C 34秒，進(jìn)行40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，得定量PCR的曲線圖(見圖3)，分析該圖可得本發(fā)明的hsa-miR-150在 胃癌和癌旁正常樣本差異表達(dá)，在圖3中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為儀器自帶軟件產(chǎn)生的 DeltaRn值(熒光量的log值)。hsa-miR-150在12對胃癌樣本中表達(dá)情況的芯片與定量 PCR結(jié)果比較見圖4，在圖4中，橫坐標(biāo)為樣本號；MD表示中分化，M-PD表示中低分化，PD表 示低分化；縱坐標(biāo)為Log Ratio值，即癌(T)和癌旁(N)比值取Log值；qPCR內(nèi)參miRNA為 U6。由圖4可知，miRNA芯片實驗和實時定量PCR實驗的結(jié)果都表明hsa-miR-150在低分 化的胃癌樣本中表達(dá)明顯升高，而在中分化及中低分化的胃癌樣本中表達(dá)正常。因此，可通 過實時定量PCR或miRNA芯片診斷胃癌的惡性程度設(shè)計hsa-miR-150的PCR引物或探針， 檢測胃癌組織中hsa-miR-150的表達(dá)量，如果hsa-miR-150的表達(dá)量顯著升高，則說明胃癌 的分化程度低，惡性程度高，治療效果差，如果hsa-miR-150的表達(dá)量正常，則說明胃癌分 化正常，惡性低，治療效果好。由于有研究表明hsa-miR-150在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病 中也高表達(dá)，因此，也可通過實時定量PCR或miRNA芯片，檢測腫瘤組織中hsa-miR-150的 表達(dá)量，從而輔助診斷腫瘤的惡性程度。實施例3誘導(dǎo)腫瘤分化藥物的篩選以SEQ ID NO 1所示序列的hsa-miR-150作為靶點，設(shè)計和篩選誘導(dǎo)腫瘤分化的
藥物。具體方法如下。用候選物質(zhì)處理表達(dá)hsa-miR-150的體系，然后檢測該體系中hsa-miR-150的表 達(dá)水平。若候選物質(zhì)可降低hsa-miR-150的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是能誘導(dǎo)腫瘤分化的 潛在藥物。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種hsa-miR-150的用途，其特征在于，用于制備輔助診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述輔助診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn)品包括 用實時定量PCR、或miRNA芯片診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷腫瘤惡性程度的 產(chǎn)品至少包括特異性擴(kuò)增hsa-miR-150的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述用miRNA芯片診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn) 品包括與hsa-miR-150特異性結(jié)合的探針。
5.一種用于輔助診斷腫瘤惡性程度的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性針 對hsa-miR-150的引物或探針。
6.一種hsa-miR-150的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)腫瘤分化的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤分化的藥物包括抗 hsa-miR-150的反義寡核苷酸。
8.一種hsa-miR-150的用途，其特征在于，用于篩選誘導(dǎo)腫瘤分化的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、6、或8所述的用途，其特征在于，所述hsa-miR-150為SEQID NO 1所示的miRNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、6、或8所述的用途，其特征在于，所述腫瘤包括胃癌、肝癌、胰腺 癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、或白血病腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開一種hsa-miR-150的用途，用于制備輔助診斷腫瘤惡性程度的產(chǎn)品。本發(fā)明還公開了hsa-miR-150在制備或篩選誘導(dǎo)腫瘤分化的藥物中的用途。本發(fā)明與胃癌分化相關(guān)的hsa-miR-150，可作為輔助診斷腫瘤惡性程度的標(biāo)志物，也可作為預(yù)測腫瘤病人生存率的標(biāo)志物，同時還可作為胃癌或其他腫瘤的藥物治療靶標(biāo)。
文檔編號C12Q1/68GK101798599SQ20101013902
公開日2010年8月11日 申請日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者張慶華, 張雯, 楊燕青, 陽圣 申請人:上海生物芯片有限公司