專利名稱：Thbs-1的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉THBS-I的新用途。
背景技術(shù)：
前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是北美國家男性中最常見的惡性腫瘤之一，據(jù) 2009年美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，新確診為前列腺癌的患者占該年新確診為惡性腫瘤患者的25% [1]，占男性腫瘤的第一位；死亡人數(shù)占總男性惡性腫瘤死亡人數(shù)的9%，僅次于肺癌(33%)。在我國，隨著人口結(jié)構(gòu)逐步老齡化和生活環(huán)境的改變，前列腺癌的發(fā)病率正在逐年增高，處于快速發(fā)展階段。分泌蛋白質(zhì)組是指能分泌到細(xì)胞外的全部蛋白質(zhì)總和，其廣義的含義為通過多種方式、能夠“釋放”到細(xì)胞外的全部蛋白質(zhì)。腫瘤細(xì)胞分泌蛋白中的一部分可以釋放入血， 成為潛在的血清標(biāo)志物。質(zhì)譜技術(shù)為腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)龐大的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。直接對惡性細(xì)胞的分泌蛋白進(jìn)行分析，對鑒定血清中的惡性腫瘤標(biāo)記物來說是一個(gè)更高效的方法。前列腺是一個(gè)雄激素依賴性器官，雄激素撤除治療對于前列腺癌早期有效，但是患者往往會在這樣的治療后約兩年時(shí)間發(fā)展為雄激素非依賴性，雄激素撤除治療便失去了作用，腫瘤往往會獲得更強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。LNCaP (雄激素依賴性AR陽性)是具有代表性的前列腺癌細(xì)胞系，C4-2細(xì)胞(雄激素非依賴性和AR陽性)是由LNCaP演變而來的細(xì)胞系。將LNCaP接種于裸鼠皮下8周并將裸鼠去勢，4周后取出腫瘤接種于裸鼠皮下，再次將裸鼠去勢。這樣就得到了 C4-2細(xì)胞，它們與LNCaP細(xì)胞遺傳背景相同，但卻獲得了雄激素非依賴的生長能力，并具有更強(qiáng)的成瘤性。LNCaP和C4-2細(xì)胞很好地模擬了臨床上患者的病情發(fā)展過程，是國際上承認(rèn)的前列腺癌研究細(xì)胞模型。PC3是前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型，雄激素受體陰性；C4-2B，該細(xì)胞系也是由LNCaP演變而來，為骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系，同樣也具有雄激素非依賴的性質(zhì)；DU145是前列腺癌腦轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系，雄激素受體陰性。凝血敏感蛋白l(thrombospondin-l，THBS-1)是α血小板顆粒的主要成分，可以與細(xì)胞表面CD36結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成。THBS-I的氨基酸序列如SEQID NO 1所示。前列腺特異性抗原(PSA)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供凝血敏感蛋白1的新用途、抗凝血敏感蛋白1的抗體的新用途及檢測凝血敏感蛋白1的試劑盒的新用途。本發(fā)明所提供的抗凝血敏感蛋白1的抗體的新用途是抗凝血敏感蛋白1的單克隆抗體和/或抗凝血敏感蛋白1的多克隆抗體在制備用于輔助診斷癌癥的試劑盒中的應(yīng)用。上述抗體均是從商業(yè)途徑得到的抗體，或經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)得到的抗體，具體可購自R&D公司。
本發(fā)明所提供的檢測凝血敏感蛋白1的試劑盒的新用途是檢測凝血敏感蛋白1的試劑盒在制備用于輔助診斷癌癥的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的凝血敏感蛋白1的新用途的新用途是凝血敏感蛋白1在設(shè)計(jì)和/ 或制備用于輔助診斷癌癥的試劑盒中的應(yīng)用。上述任一所述應(yīng)用中，所述抗凝血敏感蛋白1的單克隆抗體為抗凝血敏感蛋白1 鼠單克隆抗體。上述任一所述應(yīng)用中，所述癌癥為前列腺癌、膀胱癌或腎透明細(xì)胞癌。上述任一所述應(yīng)用中，所述前列腺癌為前列腺特異性抗原(PSA)陰性的前列腺癌。上述任一所述應(yīng)用中，所述PSA陰性為血清中PSA濃度小于等于lOng/ml。上述任一所述應(yīng)用中，檢測凝血敏感蛋白1的試劑盒具體可購自R&D公司，產(chǎn)品目錄號為DTSP-10。上述任一所述應(yīng)用中，所述凝血敏感蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；前列腺特異性抗原(PSA)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。實(shí)驗(yàn)證明，用THBS-I的單抗或檢測THBS-I的試劑盒檢測THBS-I濃度值，進(jìn)而診斷前列腺癌，對前列腺癌的陽性診斷率為100%，更突出的是，該方法能將PSA陰性(血清 PSA水平小于lOng/ml)的前列腺癌患者診斷為陽性，說明該方法的精確度明顯高于現(xiàn)有的 PSA診斷方法。


圖1為THBS-I濃度的對數(shù)與血清雙夾心ELISA檢測獲得的校正后450nm光吸收 (0D450Correct)的對數(shù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為THBS-I在前列腺癌患者和其他男性泌尿系腫瘤患者血清中的表達(dá)明顯高于正常老年人。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、試劑盒的組成一、試劑盒組成試劑盒(Human Thrombospondin-I定量試劑盒)購自R&D公司，產(chǎn)品目錄號為 DTSP-10，具體組成如下1、Thrombospondin-IMicorplate :^1^7 Thrombospondin-I H13 11 #白勺 96孔聚苯丙烯微板(8孔X 12條)；2、Thrombospondin-IConjugate :21ml 偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的抗 Thrombospondin-I 多克隆抗體；3> Thrombospondin-IStandard =IOOOng Thrombospondin-I 重組蛋白凍干粉；4、Assay Diluent RD1-56 :17ml 緩沖蛋白溶液；5、Calibrator Diluent RD5-33Concentrate :2 管(21ml/ 管)緩沖蛋白堿；
6、Wash Buffer Concentrate :21ml/管25 X緩沖表面活性劑濃縮溶液(含防腐劑)；7、Color Reagent A :12. 5ml 穩(wěn)態(tài)過氧化氫溶液；8、Color Reagent B :12. 5ml穩(wěn)態(tài)色原質(zhì)(四甲基聯(lián)苯胺)；9、Stop Solution :6ml 2mol/L 硫酸水溶液；10、Plate Covers 微板密封條 4 條。實(shí)施例2、試劑盒診斷前列腺癌一、用試劑盒進(jìn)行檢測的方法(一 )工作液的制備和標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的稀釋W(xué)ash Buffer 工作液20ml Wash Buffer Concentrate，加入去離子水定容至 500ml。Calibrator Diluent RD5-33 工 # if :20ml Calibrator Diluent RD5-33Concentrate與20ml去離子水充分混勻。 Thrombospondin-I 豐示 M ηππ # # ^ IOOOng Thrombospondin-I M S S ^ ^ 粉加入Iml去離子水，輕輕攪動，然后靜置15分鐘以上使其充分溶解，即得IOOOng/ mlThrombospondin-1 t示 M ηππ C # 1。 ffi Calibrator Diluent RD5-33 工 # if M Thrombospondin-I標(biāo)準(zhǔn)品貯存液進(jìn)行7次二倍稀釋，獲得了濃度分別為500，250，125， 62. 5，31. 3,3. 1,15. 6和7. 8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。用不加標(biāo)準(zhǔn)品的Calibrator DiluentRD5-33工作液作為空白對照(Ong/ml)；用于上樣血清樣品10 μ 1血清加入990 μ 1 Calibrator Diluent RD5-33工作液， 充分混勻。( 二)操作步驟2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備(1)取出兩條Thrombospondin-lMicorplate，余下重新用錫箔密封好；(2)每孔加入 100 μ 1 Assay Diluent RD1-56 ；(3)每孔分別加入 50 μ 1 Thrombospondin-I 濃度為 500，250，125，62. 5，31. 3， 3. 1，15. 6和7. 8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及空白對照，每個(gè)濃度做兩個(gè)重復(fù)。用Plate Covers 密封各個(gè)孔，常溫在微型搖床(轉(zhuǎn)速為500rpm)孵育兩小時(shí)；(4)徹底棄去每孔中的樣品，將每孔加滿Wash Buffer工作液(約400 μ 1)，常溫在ELISA專用洗板機(jī)上洗3分鐘，徹底棄除Wash Buffer工作液，重復(fù)該清洗4次，最后一次結(jié)束后，將Ilirombospondin-IMicorplate倒扣在清潔的紙巾上。(5)每孑L力口入 200 μ 1 Thrombospondin-lConjugate，用 Plate Covers 密封各個(gè)孔，常溫在微型搖床(轉(zhuǎn)速為500rpm)孵育兩小時(shí)；(6)徹底棄去每孑L中的 Thrombospondin—lConjugate，將每孑L力口滿 Wash Buffer X 作液(約400 μ 1)，常溫在ELISA專用洗板機(jī)上洗3分鐘，徹底棄除Wash Buffer工作液，重復(fù)該清洗4次，最后一次結(jié)束后，將Thrombospondin-lMicorplate倒扣在清潔的紙巾上。(7) Color Reagent A與Color Reagent B等體積混合，混合后15分鐘內(nèi)必須使用；(8)每孔加入200 μ 1 (7)混合液，常溫避光孵育30分鐘；
(9)每孔加入50μ1 Stop Solution，顏色應(yīng)由藍(lán)色變?yōu)辄S色，如果顏色不均一，輕拍微板使其內(nèi)容物充分混合；(10)30 分鐘內(nèi)用微板讀數(shù)器(Microplate Reader,Model 680,Biorad)讀取各個(gè)孔的450nm和570nm光吸收讀數(shù)，后者減去前者得到每孔的0D450*讀數(shù)，計(jì)算每個(gè)濃度兩個(gè)重復(fù)0D450*讀數(shù)的平均值，該值減去空白對照孔兩個(gè)重復(fù)0D450*讀數(shù)的平均值即為每 f Thrombospondin-I 農(nóng)貞)(寸0D450Correct 1 . Thrombospondin-I 農(nóng)it禾口)(寸jS 的0D450Correct分別取對數(shù)，應(yīng)用Microsoft Office Excel 2003軟件繪制散點(diǎn)圖，并擬合線形關(guān)系，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(舉例如表1，圖1)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)式為y = 0. 6664X-1.325。 R2 = 0. 9762。表 IThrombospondin-I 雙夾心 ELISA 檢測
權(quán)利要求
1.抗凝血敏感蛋白1的單克隆抗體和/或抗凝血敏感蛋白1的多克隆抗體在制備用于輔助診斷癌癥的試劑盒中的應(yīng)用。
2.檢測凝血敏感蛋白1的試劑盒在制備用于輔助診斷癌癥的試劑盒中的應(yīng)用。
3.凝血敏感蛋白1在設(shè)計(jì)和/或制備用于輔助診斷癌癥的試劑盒中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述癌癥為前列腺癌、膀胱癌或腎透明細(xì)胞癌； 所述抗凝血敏感蛋白1的單克隆抗體為抗凝血敏感蛋白1鼠單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述前列腺癌為前列腺特異性抗原陰性的前列腺癌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述前列腺特異性抗原陰性為血清中前列腺特異性抗原濃度小于等于lOng/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述凝血敏感蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述前列腺特異性抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了THBS-1的新用途。該新用途為凝血敏感蛋白1在設(shè)計(jì)和/或制備用于診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，用THBS-1的單抗或檢測THBS-1的試劑盒檢測THBS-1濃度值，進(jìn)而診斷前列腺癌，對前列腺癌的陽性診斷率為100％，更突出的是，該方法能將PSA陰性(血清PSA水平小于10ng/ml)的前列腺癌患者診斷為陽性，說明該方法的精確度明顯高于現(xiàn)有的PSA診斷方法。
文檔編號G01N33/577GK102346188SQ20101024444
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者周建光, 錢曉龍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所