專利名稱：簡便易行的食用菌基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食用菌基因組DNA提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，食用菌的分子生物學(xué)研究也進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。食用菌基因組DNA的提取與分離、純化，對于在分子水平上研究食用菌的遺傳進(jìn)化、基 因組成、基因的重組與表達(dá)等遺傳工程是十分必要的。用簡便易行的提取方法獲得以食用 菌菌絲體和子實(shí)體為材料的基因組DNA，將能大大提高工作效率。食用菌的細(xì)胞壁及染色體上結(jié)合有復(fù)雜的多糖和豐富的蛋白質(zhì)，且其菌絲體通常 會(huì)產(chǎn)生色素，致使制備的基因組DNA中含有不同數(shù)量的多糖、蛋白質(zhì)、色素以及成分不明的 胞壁物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。目前已有多種從食用菌的菌絲體或子實(shí)體中提取DNA方法的報(bào)道，提取方法區(qū)別 在采取的破壁的方法不同。常用的破壁方法主要有液氮研磨法、石英砂或玻璃珠機(jī)械破壁 法、CTAB法和氯化芐法等。目前采用的最多的CTAB法，采用了液氮研磨，然后用CTAB溶液 在65°C處理，經(jīng)過酚仿抽提進(jìn)行純化。這種方法步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不易大量處理樣品。 其后發(fā)展出來的氯化芐法，與CTAB法相比，具有簡便易行的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在提取DNA質(zhì)量 不夠穩(wěn)定，對分散性不好的材料提取效果不好等不足。如何快速、高效的提取食用菌菌絲 體和子實(shí)體的基因組DNA成為近年來的研究熱點(diǎn)。孫立夫等(菌物學(xué)報(bào)，2009年28卷第2 期299-302)采用帶有無菌塑料鉆頭的小型手動(dòng)電鉆來研磨成功提取了蜜環(huán)菌總DNA，該方 法雖然避免了使用液氮，但仍然有費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)；趙春喜等(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008年36卷第 28期12122-12200)嘗試采用改進(jìn)的TRIS飽和酚一步法從各種食用菌子實(shí)體中提取高質(zhì) 量DNA的簡捷方法，獲得的食用菌DNA質(zhì)量較好，能夠滿足PCR等后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)，但 此方法中仍然采用了利用研缽研磨方法，不易大量樣品的處理；楊同文等(生物技術(shù)，2009 年19卷第1期32-34)探索出一種簡捷、高效CTAB結(jié)合DNA凝膠試劑盒的方法，省去了苯 酚_氯仿的抽提，免去了 DNA的晾干和再溶解等步驟將CTAB的裂解功能與膠回收試劑盒的 純化功能有機(jī)結(jié)合，優(yōu)化組合操作步驟，成功提取了平菇、香菇、金針菇子實(shí)體DNA，但該方 法成本較高。綜上所述，目前提取食用菌基因組DNA的方法普遍存在著操作繁瑣、提取時(shí)間長、 成本較高等不足之處。另外，以食用菌子實(shí)體為材料的核酸提取報(bào)道很少，限制了現(xiàn)有栽培品種的快速 鑒定及野生食用菌資源分子水平上的多樣性的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便易行的食用菌基因組DNA提取方法， 用該方法提取食用菌的基因組DNA時(shí)間短、操作簡單、成本低、提取效率高、提取的DNA質(zhì)量穩(wěn)定。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種簡便易行的提取食用菌基因組DNA的方法，其特 征在于包括以下步驟(1)取材取菌絲體或子實(shí)體于離心管中；(2)加入少量石英砂，用研磨杵對菌絲體或子實(shí)體進(jìn)行研磨至糊狀；(3)依次加入STES緩沖液，TE緩沖液，酚-氯仿液于離心管中， 渦旋振蕩l-3min ；(4)離心10，000-13，000r/min 離心 5_7min ；(5)取離心后的上層水相至另一離心管中，加入預(yù)冷無水乙醇或異丙醇，顛倒混 勻，-20 0C _4°C 放置沉淀 15-30min ；(6)離心10，000-13，000r/min 離心 10_13min ；(7)棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，風(fēng)干；(8)加入ddH20和RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，_20°C保存。上述第(1)步取材，菌絲體取氣生菌絲；子實(shí)體取菌蓋部位，將取好的材料置于 1. 5mL離心管中。上述第(3)步中，所述STES 緩沖液為 200mmol/L Tris-HCl, 250mmol/LNaCl, 25mmol/L EDTA 禾口 2% SDS ；渦旋振蕩 2min。所述Tris-HCl 的 pH 值為 8. 5。第(3)步中，依次加入200 μ L STES緩沖液、IOOyL TE緩沖液、300 μ L酚-氯仿 液于離心管中，其中酚-氯仿液中酚與氯仿的比例為1 1。上述第(5)步中，加入冰預(yù)冷無水乙醇或異丙醇的體積為上層水相體積的2倍，放 置沉淀的溫度為-20°C。上述第(7)步中，用70%乙醇洗滌沉淀兩次。所述食用菌為黑平王、美味牛肝菌、香菇、金針菇等各種食用菌。本發(fā)明以食用菌子實(shí)體或菌絲體為材料快速提取基因組DNA的方法，此方法有如 下優(yōu)點(diǎn)(1)所需用于提取總DNA的材料的量少、容易獲得，既可以是斜面或平皿培養(yǎng)基上 的菌絲，也可以是子實(shí)體，省去了菌絲的活化及培養(yǎng)時(shí)間，也為現(xiàn)有栽培品種的快速鑒定及 野生食用菌資源分子水平上的多樣性的研究提供了新思路，為食用菌的分子生物學(xué)研究提 供一種高效可行的分子技術(shù)途徑。(2)避免了使用液氮研磨，降低了成本。(3)只需在離心管中用研磨杵研磨結(jié)合石英砂漩渦振蕩研磨即可，在提取大量樣 品的基因組時(shí)占優(yōu)勢，省時(shí)省力，可以在1小時(shí)內(nèi)完成DNA提取。(4)提取的基因組DNA完整、效率高，糖和蛋白含量低，可直接用于PCR反應(yīng)，足以 滿足PCR擴(kuò)增。(5)相對其他方法而言，所用的設(shè)備和藥品相對較少，經(jīng)濟(jì)節(jié)約。


圖1為本發(fā)明方法提取的黑平王的基因組的電泳圖，其中，M :lkb ρIusDNA marker ；1 以黑平王子實(shí)體為材料提取的基因組DNA ；2 以黑平王菌絲體為材料提取的基 因組DNA。
圖2為ITS片段的擴(kuò)增檢測黑平王基因組DNA為模板的質(zhì)量電泳圖，其中，M :lkb plus DNA marker ；1 以黑平王子實(shí)體為材料提取的基因組DNA為模板進(jìn)行ITS-PCR的產(chǎn) 物；2 以黑平王菌絲體為材料提取的基因組DNA為模板進(jìn)行ITS-PCR的產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限 制，僅僅作示例說明。提取平菇的基因組DNA的方法如下一、材料平菇(Pleurotus ostreatus，黑平王)為北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研 究所食用菌研究室保存菌種。
二、試劑STES 緩沖液200mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 5)，250mmol/L NaCl, 25mmol/LEDTA, 2% SDS ；酚氯仿(1 1) ；RNaseA ；無水乙醇；70% 乙醇；10mg/mLRNaseA。三、提取基因組DNA提取基因組DNA的具體步驟如下(1)取材取菌絲體或子實(shí)體于1. 5mL的離心管中。取菌絲體材料刮取斜面或平 皿培養(yǎng)基上的少量菌絲，盡量多取氣生菌絲；取子實(shí)體材料直接取少量子實(shí)體，盡量取菌 蓋部位。(2)加入少量石英砂，用研磨杵對菌絲體或子實(shí)體進(jìn)行研磨至糊狀。(3)依次加入200 μ L STES緩沖液，100 μ L TE緩沖液，300 μ L酚:氯仿(1 1) 于離心管中，渦旋振蕩l-3min。(4) 12，000r/min 離心 5min。(5)取上層水相至另一離心管中，加入無水乙醇，顛倒混勻，-20°C放置15min。(6) 12，000r/min 離心 lOmin。(7)棄上清，以70%乙醇洗滌沉淀兩次，風(fēng)干。(8)加入20 μ L的ddH20和1 μ L的RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，_20°C保存。四、對上述提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行電泳檢測1、瓊脂糖凝膠電泳檢測取提取的菌絲體和子實(shí)體的基因組DNA樣品各3 μ L進(jìn)行0. 8%的瓊脂糖凝膠電 泳20min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察提取DNA的質(zhì)量并照相記錄。結(jié)果如圖1所示，所 提取的DNA樣品大小均在20kb左右，條帶明亮清晰，說明通過本發(fā)明方法能較完整地從食 用菌的菌絲體和子實(shí)體中分離獲得完整基因組DNA。整個(gè)提取時(shí)間短，簡便易行。2、用ITS-PCR擴(kuò)增檢測所提取的DNA質(zhì)量選 取 ITSl (5，- tccgtaggtgaacctgcgg-3，)和 ITS4(5，-tcctccgcttattgatatgc-3')為引物，以所提基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 950C 5min(預(yù)變性)；30 個(gè)循環(huán)(95°C 30s, 58°C lmin，72°C 30s) ；72°C IOmin ；降至 4°C 結(jié) 束。反應(yīng)體系為50yL。然后進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果如圖2所示，所得產(chǎn)物片段大小700bp左 右，提取的DNA完整，糖和蛋白含量低，與預(yù)期結(jié)果相一致，表明該方法提取獲得的食用菌DNA能夠滿足基于PCR等分子生物學(xué)試驗(yàn)。本發(fā)明方法也為其他材料DNA的快速提取提供新思路。
權(quán)利要求
一種簡便易行的提取食用菌基因組DNA的方法，其特征在于包括以下步驟(1)取材取菌絲體或子實(shí)體于離心管中；(2)加入少量石英砂，用研磨杵對菌絲體或子實(shí)體進(jìn)行研磨至糊狀；(3)依次加入STES緩沖液，TE緩沖液，酚-氯仿液于離心管中，渦旋振蕩1-3min；(4)離心10,000-13,000r/min離心5-7min；(5)取離心后的上層水相至另一離心管中，加入預(yù)冷無水乙醇或異丙醇，顛倒混勻，-20℃-4℃放置沉淀15-30min；(6)離心10,000-13,000r/min離心10-13min；(7)棄上清，用70％乙醇洗滌沉淀，風(fēng)干；(8)加入ddH2O和RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，-20℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(1)步取材，菌絲體取氣生菌絲；子實(shí) 體取菌蓋部位，將取好的材料置于1. 5mL離心管中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(3)步中，所述STES緩沖液為200mmol/ L Tris-HCl,250mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA 和 2% SDS ；渦旋振蕩 2min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述Tris-HCl的pH值為8.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(3)步中，依次加入200yl STES緩沖 液、100 u 1 TE緩沖液、300 i! L酚-氯仿液于離心管中，其中酚-氯仿液中酚與氯仿的比例 為 1 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(5)步中，加入冰預(yù)冷無水乙醇或異丙 醇的體積為上層水相體積的2倍，放置沉淀的溫度為-20°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(7)步中，用70%乙醇洗滌沉淀兩次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述食用菌為黑平王、美味牛肝菌、香菇、 金針菇。
全文摘要
本發(fā)明提供一種簡便易行的食用菌基因組DNA提取方法，該方法包括取材；研磨；加緩沖液振蕩后離心；放置沉淀；離心；洗滌沉淀，風(fēng)干；溶解沉淀，保存等步驟。用本發(fā)明方法提取食用菌的基因組DNA時(shí)間短、操作簡單、成本低、提取效率高。
文檔編號C12N15/10GK101831421SQ20101016283
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者劉宇, 孟莉莉, 王蘭青, 王守現(xiàn), 耿小麗, 許峰, 趙爽, 魏民 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院