專利名稱：水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP及其重組植物超表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，特別涉及水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP，還涉 及該突變基因的重組植物超表達載體。
背景技術(shù)：
葉綠體是植物細胞和真核藻類的重要細胞器，是植物進行光合作用的場所。高等 植物的葉綠體具有由許多片層組成的片層系統(tǒng)，每個片層由周圍閉合的兩層膜組成，呈扁 囊狀，稱為類囊體。小類囊體垛疊在一起形成基粒，光合色素主要集中在基粒之中，光系統(tǒng) II多存在于基粒類囊體的垛疊區(qū)，光合作用過程中光能向化學能的轉(zhuǎn)化是在類囊體膜上進 行的。類囊體囊腔是類囊體膜包裹著的狹小區(qū)域，囊腔內(nèi)充滿溶液，大約含有80-200個蛋 白。囊腔內(nèi)最為豐富的蛋白復合體有光系統(tǒng)II的外在蛋白PsbO、PsbP和PsbQ，以及質(zhì)體 藍素，此外還包括親免疫因子、分子伴侶、蛋白質(zhì)水解相關(guān)蛋白和大量公開蛋白如TL29。類 囊體囊腔蛋白雖然未直接參與到光電子傳輸，但對光合作用、類囊體的結(jié)構(gòu)及發(fā)生起著重 要作用。例如，Dgel是一粘附在類囊體膜囊腔側(cè)的蛋白酶，其通過降解光系統(tǒng)II反應(yīng)中心 蛋白Dl參與光抑制的修復。TLP40(thylakoid lumen PPIase)是一定位于類囊體腔的親 免素，其在光合作用中發(fā)揮著雙重功能影響類囊體膜蛋白的去磷酸化和可能在質(zhì)體發(fā)育 早期起到關(guān)鍵作用。TLP18. 3(thylakoid lumenprotein of 18. 3kDa)與光系統(tǒng)II中心蛋 白Dl的降解和合成有關(guān)，直接或間接地參與到光系統(tǒng)II三聚體在類囊體處的組裝。類囊 體囊腔蛋白主要功能還包括協(xié)助類囊體蛋白的折疊和水解以及保護其免受氧脅迫等。水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白基因OsTLP的核苷酸序列已有文獻報道，但其相關(guān)功 能迄今為止尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種與葉綠素含量提高相關(guān)的水稻葉綠體 類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP ；目的之二在于提供所述突變基因OsTLP重組植物超表達 載體，從而為植物光合作用研究以及高產(chǎn)育種研究提供有力的工具。為達到上述目的，首先，本發(fā)明提供了一種水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因 OsTLP，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。發(fā)明人在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)了一個水稻高葉綠素含量突變體(李賢勇等.一 個水稻高葉綠素含量基因的發(fā)現(xiàn).西南農(nóng)業(yè)學報，2002，15 (4) :122-123 ；李賢勇等.一個 水稻高葉綠素基因的生物學特性研究.西南農(nóng)業(yè)學報，2004，17 (3) 292-294 ；Wang FH et al. Heredity, physiology and mapping of a chlorophyll contentgene ofrice(Oryza sativa L). Journal ofPlant Physiology, 2008,165(3) :324_330)。本發(fā)明以該突變體為 材料，在前期基因定位的基礎(chǔ)上，克隆了水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP。測序 結(jié)果顯示該突變基因OsTLP全長cDNA為774bp，由3個外顯子組成，編碼257個氨基酸。與野生型珍汕97B相比，該突變基因OsTLP在第1個外顯子上有G-T轉(zhuǎn)換，并導致第71位 的脯氨酸(P)改變?yōu)樘K氨酸(T)。其次，本發(fā)明提供了含有所述水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP的重組 植物超表達載體。進一步，所述重組植物超表達載體是在改良pCAMBIA1301載體的多克隆位點中 插入水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP而獲得；所述改良pCAMBIA1301載體由 PCAMBIA1301載體與pCHFl載體改造而來，即采用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III將 pCHFl載體中包括CaMV35S啟動子及多克隆位點Sac I,KpnI,Smal I.BamH I.Sal I禾Π Pst I的片段切下，再連接至同樣經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切的pCAMBIA1301載體上。本發(fā)明將突變基因OsTLP重組植物超表達載體采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，通過 GUS染色及PCR擴增驗證了陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株，與對照植株(轉(zhuǎn)空載體植株及未轉(zhuǎn)化植 株)相比，轉(zhuǎn)基因煙草葉片顏色變綠。掃描電鏡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā) 生了變化。從而推測本發(fā)明的突變基因OsTLP是通過改變植物葉綠體類囊體的結(jié)構(gòu)而提高 了植物葉綠素的含量。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個和葉綠素含量提高相關(guān)的水稻突變基 因OsTLP，并構(gòu)建了其重組植物超表達載體，為植物光合作用研究以及高產(chǎn)育種研究提供了 有力的工具。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中圖1為基因OsTLP的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，M泳道為DL1，200DNA Marker, 1泳道為基因OsTLP (高葉綠素突變體)的RT-PCR產(chǎn)物，2泳道為基因OsTLP (野生 型)的RT-PCR產(chǎn)物；圖2為重組載體pMD19T_0sTLP的酶切鑒定，M泳道為DNA Marker II，1泳道為EcoR I酶切pMD19T-0sTLP (高葉綠素突變體)，3泳道為EcoR I/Hind III酶切pMD19T_0sTLP (高 葉綠素突變體)，4泳道為EcoR I酶切pMD19T-0sTLP(野生型)，5泳道為EcoR I/Hind III 酶切pMD19T-0sTLP (野生型)；圖3為基因OsTLP編碼蛋白的氨基酸同源性對比結(jié)果，箭頭所指處為基因OsTLP 的突變位點；圖4為突變基因OsTLP重組植物超表達載體改良pCAMBIAl301-OsTLP的構(gòu)建示 意圖；圖5為突變基因OsTLP重組植物超表達載體改良pCAMBIAl301-OsTLP的酶切鑒 定，M 泳道為 DNA Marker, 1 2 泳道為 BamH I/Pst I 酶切改良 pCAMBIAl301-OsTLP，3 泳 道為 BamH I/Pst I 酶切 pMD19T_0sTLP，4 泳道為 BamH I/Pst I 酶切改良 pCAMBIA1301 ；圖6為轉(zhuǎn)基因煙草的⑶S染色檢測，A為轉(zhuǎn)改良pCAMBIA1301空載體的煙草葉片， B為轉(zhuǎn)改良pCAMBIA1301-0sTLP的煙草葉片，C為非轉(zhuǎn)基因煙草葉片；圖7為轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定，M泳道為DNA marker，1 4泳道為轉(zhuǎn)改良 pCAMBIAl301-OsTLP的煙草，5泳道為改良pCAMBIAl301-OsTLP質(zhì)粒DNA的陽性對照，6泳道為轉(zhuǎn)pCAMBIA1301空載體的煙草，7泳道為非轉(zhuǎn)基因煙草，8泳道為無菌水代替DNA的陰性 對照；圖8為轉(zhuǎn)基因煙草的照片，A為轉(zhuǎn)pCAMBIA1301空載體的煙草，B為轉(zhuǎn)改良 pCAMBIAl301-OsTLP 的煙草；圖9為轉(zhuǎn)基因煙草葉片的照片，A為轉(zhuǎn)pCAMBIA1301空載體的煙草葉片，B為轉(zhuǎn)改 良pCAMBIAl301-OsTLP的煙草葉片；圖10為轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體類囊體的電鏡觀察，A為轉(zhuǎn)pCAMBIA1301空載體的煙草 葉片，B為轉(zhuǎn)改良pCAMBIAl301-OsTLP的煙草葉片。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實施例中使用的材料野生型水稻材料珍汕97B(Wt.)和高葉綠素突變體 (Mut.)由重慶市農(nóng)業(yè)科學研究院提供；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA 聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、PMD19-T載體、Trizo 1試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、 質(zhì)粒提取試劑盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DLl, 200DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；DNA Marker II購自天根生化科技(北京)有限公司；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)和卡拉 霉素(Kanamycin，Kan)為Sigma公司產(chǎn)品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術(shù)有 限公司完成；其它化學試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；大腸桿菌JM109、農(nóng)桿菌 GV3101由本實驗室保存。一、突變基因OsTLP的克隆與測序根據(jù)GenBank已登錄的水稻日本晴基因OsTLP序列，利用Primer5. 0和01igo6. 0 軟件設(shè)計特異引物上游引物 OsTLP F :5，-gtacgtttgtaatgacgtcatc-3，(SEQ IDNo. 2)；下 游引物 OsTLP R :5，-gaatttggacgagttgtacttg-3，(SEQ ID No. 3)。分別取水稻野生型和高葉綠素突變體光照培養(yǎng)兩周的幼葉2g，迅速放入液氮中研 磨成粉末，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA。所得水稻野生型和高葉綠素突變體總RNA 的電泳結(jié)果顯示主帶清晰完整，28S和18S的條帶亮度比約為2 1，說明RNA的濃度和純 度符合實驗要求，可以用于合成雙鏈cDNA。分別以所得水稻野生型和高葉綠素突變體總RNA為模板，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書，使用Oligo(dT)引物進行逆轉(zhuǎn)錄獲得水稻野生型和高葉綠素突變體cDNA ；再以逆轉(zhuǎn) 錄合成的cDNA為模板，采用特異引物OsTLP F/0sTLP R及高保真DNA聚合酶PFU進行PCR 擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4分鐘；然后94°C變性30秒，50°C復性30秒，72°C延伸 2分鐘，共32個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。將RT-PCR產(chǎn)物進行1. 0% (g/mL)瓊脂糖 凝膠電泳檢測，再按照DNA凝膠回收試劑盒說明書進行切膠回收純化；純化的DNA片段與 PMD19-T載體在T4DNA連接酶的作用下于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感 受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定片段大小后測 序，得重組載體pMD19T-0sTLP。基因OsTLP的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定如圖1所示，可見OsTLP (野生型)和OsTLP (高葉綠素突變體)的RT-PCR產(chǎn)物均在約850bp處呈單一特異性條帶，與 GenBank報道的基因OsTLP大小相符。重組載體pMD19T_0sTLP的酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，可見pMD19T_0sTLP (野生型)和pMD19T-0sTLP (高葉綠素突變體)用EcoR I/Hind III雙酶切均可得到約900bp的 目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，證實目的片段已連入PMD19-T載體。測序結(jié)果顯示，水稻野生型和高葉綠素突變體的OsTLP全長cDNA均為774bp，由3 個外顯子組成，編碼257個氨基酸。其中，高葉綠素突變體的OsTLP全長cDNA序列如SEQ ID No.l所示。與野生型相比，高葉綠素突變體的基因OsTLP在第1個外顯子上發(fā)生了 1個 堿基突變，即第211位的G突變?yōu)門，該突變導致了編碼蛋白第71位氨基酸的差異，野生型 為脯氨酸(Pro)，高葉綠素突變體為蘇氨酸(Thr)。利用DNA Man軟件對水稻OsTLP、擬南芥 AtTLP及蓖麻RcTLP編碼蛋白的氨基酸序列進行比對，結(jié)果如圖3所示，水稻OsTLP與擬南 芥AtTLP、蓖麻RcTLP編碼蛋白的同源性高達50%以上。二、突變基因OsTLP重組植物超表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化改良pCAMBIA1301載體由pCAMBIA1301與pCHFl改造而來，即采用限制性內(nèi)切 酶EcoR I和Hind III將pCHFl載體中包括CaMV35S啟動子及多克隆位點Sac I、Kpn I、 Smal I、BamH I、Sal I和Pst I的片段切下，再連接至同樣經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切 的pCAMBIA1301載體上。改良pCAMBIA1301載體可以直接將要表達的目標基因片段通過多 克隆位點插入在CaMV35S啟動子的后面進行表達，簡便易行，適用于所有基因重組植物超 表達載體的構(gòu)建。將含有突變基因OsTLP的重組載體PMD19T_0sTLP用BamH I/Pst I雙酶切，回 收突變基因OsTLP片段，再與同樣經(jīng)BamH I/Pst I雙酶切的改良pCAMBIA1301載體在 T4DNA連接酶的作用下于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，用 含有卡拉霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，即得突變基因OsTLP重組 植物超表達載體改良pCAMBIA1301-0sTLP，其構(gòu)建過程如圖4所示。采用凍融法將改良 pCAMBIA1301-0sTLP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，所得陽性土壤農(nóng)桿菌株于_80°C保存?zhèn)溆?。改良pCAMBIAl301-OsTLP的酶切鑒定結(jié)果如圖5所示，目的片段突變基因OsTLP 已經(jīng)連入改良PCAMBIA1301載體中。三、煙草的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定將煙草在MS培養(yǎng)基上無菌培養(yǎng)3周后，取無菌煙草苗的幼嫩、健壯葉片，切去邊 緣，切除主脈，切成Icm2左右的小塊，浸入上述陽性土壤農(nóng)桿菌株的MS懸液中共培養(yǎng)。轉(zhuǎn) 化植株的再生和培養(yǎng)按照文獻方法進行(Horsch RB et al. Asimple and general method for transferring genes into plants. Science. 1985,277 -.1229 1231)。轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色檢測取煙草轉(zhuǎn)基因植株的各組織(包括葉、莖、根)，用無 菌水沖洗3 4次，置盛有X-Gluc溶液的小離心管中(保證外植體全部浸入溶液中)，37°C 溫育過夜，取出組織材料，用體積分數(shù)為95%的乙醇脫色后，在顯微鏡下觀察是否有藍色斑 點出現(xiàn)(以非轉(zhuǎn)基因煙草為陰性對照)。結(jié)果如圖6所示，改良pCAMBIA1301空載體及改良 pCAMBIAl301-OsTLP已成功轉(zhuǎn)入煙草中。轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測取煙草轉(zhuǎn)基因苗幼嫩葉片為材料，用改良CTAB法小量提 取煙草基因組DNA，再以所得DNA為模板，非轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA和無菌水為陰性對照，改良pCAMBIA1301-0sTLP質(zhì)粒DNA為陽性對照，以O(shè)sTLP基因特異引物(OsTLP F/0sTLP R)進行轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4分鐘；然后94°C變性30秒，50°C 復性30秒，72°C延伸2分鐘，共32個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。結(jié)果如圖7所示，改良 PCAMBIA1301空載體及改良pCAMBIA1301_0sTLP已成功轉(zhuǎn)入煙草中。轉(zhuǎn)基因煙草及轉(zhuǎn)基因煙草葉片的照片分別如圖8和圖9所示，從外觀來看，與轉(zhuǎn) PCAMBIA1301空載體的煙草葉片相比，轉(zhuǎn)改良pCAMBIA1301_0sTLP的煙草葉片變綠。從葉綠 素含量測定來看，轉(zhuǎn)改良pCAMBIA1301-0sTLP的煙草葉片的葉綠素含量提高了 20%左右， 初步推測突變基因OsTLP與葉綠素含量提高有關(guān)。轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體類囊體的電鏡觀察將煙草轉(zhuǎn)基因苗幼嫩葉片同一部位用刀片 切成Imm2左右的小塊，用體積分數(shù)為25%的戊二醛固定液(用濃度為0. lmol/L、pH為7. 2 的磷酸緩沖液配制，0 4°C保存)進行前固定4小時，用濃度為0. lmol/L、pH為7. 2的磷 酸緩沖液清洗3次后，再用質(zhì)量體積分數(shù)為的四氧化鋨固定液(用濃度為0. Imol/L.pH 為7. 2的磷酸緩沖液配制)進行后固定2 3小時，用濃度為0. lmol/L、pH為7. 2的磷酸 緩沖液清洗3次后，依次用體積分數(shù)為40 %、50 %、70 %、90 %、100 %、100 %、100 %的丙酮 逐級脫水，每次15分鐘，再用體積比依次為1 3、1 1、3 1的環(huán)氧樹脂-丙酮混合物 進行滲透，最后用100%環(huán)氧樹脂于30°C包埋5小時，再升溫至60°C聚合36 48小時。包 埋塊經(jīng)LKB超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，在JEM100CX型透射電鏡下觀 察并拍照。結(jié)果如圖10所示，與轉(zhuǎn)pCAMBIA1301空載體的煙草葉綠體類囊體相比，轉(zhuǎn)改良 pCAMBIA1301-0sTLP的煙草葉綠體類囊體垛疊層明顯密集，且垛疊層增厚。因此，推測突變 基因OsTLP是通過改變植物葉綠體類囊體的垛疊程度提高了植物的葉綠素含量。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可 以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP，其特征在于具有如SEQID No.1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP的重組植物超表達 載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組植物超表達載體，其特征在于所述重組植物超表達載 體是在改良PCAMBIA1301載體的多克隆位點中插入水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因 OsTLP而獲得；所述改良pCAMBIA1301載體由pCAMBIA1301載體與pCHFl載體改造而來，即 采用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III將pCHFl載體中包括CaMV35S啟動子及多克隆位點 Sac I,Kpn I,Smal I.BamH I.Sal I禾Π Pst I的片段切下，再連接至同樣經(jīng)EcoR I禾Π Hind III雙酶切的pCAMBIA1301載體上。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻葉綠體類囊體囊腔蛋白突變基因OsTLP，具有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，其可能通過改變植物葉綠體類囊體結(jié)構(gòu)而提高植物葉綠素含量；還公開了含有該突變基因的重組植物超表達載體，為植物光合作用研究以及高產(chǎn)育種研究提供了有力的工具。
文檔編號C12N15/29GK101838656SQ20101017705
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者岳彩黎, 王貴學, 秦峰, 胡鋒, 黃俊麗 申請人:重慶大學