專(zhuān)利名稱：用于轉(zhuǎn)化柵藻和杜氏藻葉綠體基因組的系統(tǒng)的制作方法
用于轉(zhuǎn)化柵藻和杜氏藻 葉綠體基因組的系統(tǒng)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2009年9月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的號(hào)61/242，735的權(quán)益，出于所有目的通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。通過(guò)引用進(jìn)行的結(jié)合本申請(qǐng)中引用的所有公開(kāi)文件、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)、公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)路徑、以及其他參考文件都通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的公開(kāi)文件、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)、公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)路徑、或其他參考文件被具體地并且單獨(dú)地指明通過(guò)引用結(jié)合在此。
背景技術(shù)：
藻類(lèi)是單細(xì)胞生物，通過(guò)光合作用生產(chǎn)氧氣。一組微藻用于生物技術(shù)應(yīng)用是出于許多原因，包括它們的高生長(zhǎng)速率和對(duì)變化的環(huán)境條件的耐受性。微藻類(lèi)在針對(duì)商業(yè)上重要的產(chǎn)物的許多工業(yè)過(guò)程中的用途是已知的和/或已經(jīng)被提出。例如，微藻類(lèi)在生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、藥物、天然染料、魚(yú)類(lèi)和甲殼動(dòng)物的食物來(lái)源、農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的生物防治、污水處理中產(chǎn)生氧氣以及去除氮?dú)?、磷和毒性物質(zhì)，以及污染控制(如塑料的生物降解或二氧化碳的吸收)中具有用途。類(lèi)似于其他生物，微藻類(lèi)包含作為膜組分的脂質(zhì)和脂肪酸、儲(chǔ)存產(chǎn)物、代謝物以及能源。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些藻類(lèi)株、硅藻、以及藍(lán)細(xì)菌包含成比例地高水平的脂質(zhì)(超過(guò)30%)。具有高油或脂含量的微藻株在生產(chǎn)生物燃料的可持續(xù)性原料的尋找方面令人具有很大的興趣。一些野生型藻類(lèi)適合用于不同工業(yè)應(yīng)用中。然而，人們認(rèn)識(shí)到的是，通過(guò)修飾藻類(lèi)來(lái)提高對(duì)于上述應(yīng)用有用的具體特征，有關(guān)過(guò)程更可能地是商業(yè)上可行的。為此，可以開(kāi)發(fā)出比野生型株具有改善特征的藻類(lèi)株。通過(guò)傳統(tǒng)的篩選和突變以及選擇技術(shù)已經(jīng)進(jìn)行了這類(lèi)開(kāi)發(fā)。此外，已經(jīng)廣泛建議了針對(duì)藻類(lèi)的重組DNA技術(shù)。這類(lèi)方法可以增加商業(yè)上有價(jià)值的產(chǎn)品的生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)有效性。藻類(lèi)受到日益增加的注意的一個(gè)領(lǐng)域是燃料產(chǎn)物的生產(chǎn)。對(duì)燃料產(chǎn)物，如油、石油化學(xué)產(chǎn)品、以及用于生產(chǎn)石油化學(xué)產(chǎn)品的其他物質(zhì)的需求日益增加。多數(shù)現(xiàn)今的燃料產(chǎn)物是從化石燃料產(chǎn)生的，由于它們是由數(shù)百萬(wàn)年過(guò)程中逐層沉積物覆蓋的有機(jī)物質(zhì)的結(jié)果，它們被認(rèn)為是不可再生的能源。還存在著日益增長(zhǎng)的減輕對(duì)進(jìn)口原油的依賴性的期望。關(guān)于污染和環(huán)境危害的公眾意識(shí)也已經(jīng)增加。其結(jié)果是，對(duì)于生產(chǎn)燃料產(chǎn)物的替代方法已經(jīng)存在日益增加的興趣和需要。因此，對(duì)于開(kāi)發(fā)可再生的、可持續(xù)的、并對(duì)環(huán)境較少有害的燃料產(chǎn)物的替代方法存在急切的需要。替代生產(chǎn)燃料和燃料前體的一種潛在來(lái)源是基因修飾的生物，例如細(xì)菌和植物，包括藻類(lèi)。迄今為止，藻類(lèi)還沒(méi)有作為可商業(yè)化的平臺(tái)成功地開(kāi)發(fā)用于生物燃料生產(chǎn)(主要是由于針對(duì)生物燃料回收的藻類(lèi)的收獲和加工的高成本)。因此，存在著為降低這些成本的開(kāi)發(fā)宿主生物如藻類(lèi)(例如柵藻、衣藻、以及杜氏藻)和細(xì)菌的需要。基因修飾生物的一種方式是用編碼蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化生物，其中蛋白質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)致例如產(chǎn)物生產(chǎn)的增加,或?qū)е略撋锿ǔ２荒苤圃斓漠a(chǎn)物的生產(chǎn)。
發(fā)明概述
I. 一種分離的柵藻，包括已經(jīng)用一個(gè)外源核苷酸序列轉(zhuǎn)化的一個(gè)葉綠體基因組，其中該外源核苷酸序列包括編碼至少一種蛋白質(zhì)的一個(gè)核酸序列。2.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該蛋白質(zhì)涉及類(lèi)異戊二烯生物合成途徑。3.如權(quán)利要求2所述的分離的柵藻，其中該蛋白質(zhì)是一種合成酶。4.如權(quán)利要求3所述的分離的柵藻，其中該合成酶是一種法尼基二磷酸(FPP)合成酶。5.如權(quán)利要求4所述的分離的柵藻，其中該FPP合成酶是來(lái)自原雞。6.如權(quán)利要求3所述的分離的柵藻，其中該合成酶是一種殼梭孢菌素二烯合成酶(fusicoccadiene synthase)。7.如權(quán)利要求6所述的分離的柵藻,其中該殼梭孢菌素二烯合成酶是來(lái)自扁桃假單胞菌。8.如權(quán)利要求3所述的分離的柵藻，其中該合成酶是一種沒(méi)藥烯合成酶。9.如權(quán)利要求8所述的分離的柵藻，其中該沒(méi)藥烯合成酶是來(lái)自大冷杉。10.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該外源核苷酸序列是至少O. 5kb、至少l.Okb、至少2kb、至少3kb、至少5kb、至少8kb、至少llkb、或至少19kb。11.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該核酸序列編碼兩種蛋白質(zhì)、三種蛋白質(zhì)、或四種蛋白質(zhì)。12.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該外源核苷酸進(jìn)一步包括編碼一種選擇標(biāo)記的一個(gè)第二核酸序列。13.如權(quán)利要求12所述的分離的柵藻，其中該標(biāo)記是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、紅霉素酯酶、或胞嘧啶脫氨酶。14.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該柵藻是二形柵藻。15.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該柵藻是斜生柵藻。16.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該核酸序列編碼一種生物質(zhì)降解酶。17.如權(quán)利要求16所述的分離的柵藻，其中該生物質(zhì)降解酶是一種半乳聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶、糖酶、脂肪酶、還原酶、氧化酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或植酸酶。18.如權(quán)利要求16所述的分離的柵藻，其中該生物質(zhì)降解酶是一種木聚糖內(nèi)切酶、外切-β-葡聚糖酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、木聚糖內(nèi)切酶、或木質(zhì)酶。19.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該核酸序列編碼一種酯酶。20.如權(quán)利要求19所述的分離的柵藻，其中該酯酶是一種紅霉素酯酶。21.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該核酸序列編碼一種脫氨酶。22.如權(quán)利要求I所述的分離的柵藻，其中該核酸序列編碼一種甜菜堿醛脫氫酶。23.如權(quán)利要求I至22的任一項(xiàng)所述的分離的柵藻，其中該核酸序列被密碼子優(yōu)化用于在該柵藻的葉綠體基因組中表達(dá)。24. 一種分離的柵藻，包括用一種外源核苷酸序列轉(zhuǎn)化的一個(gè)葉綠體基因組，其中所轉(zhuǎn)化的柵藻具有的類(lèi)異戊二烯含量不同于與這種分離的柵藻相同種類(lèi)的一種未轉(zhuǎn)化的柵藻，并且其中該外源核苷酸序列包括編碼一種涉及類(lèi)異戊二烯生物合成的酶的一種核酸。25.如權(quán)利要求24所述的分離的柵藻，其中該核酸不編碼一種對(duì)映貝殼杉烯合成酶。26.如權(quán)利要求24所述的分離的柵藻，其中該核酸被密碼子優(yōu)化用于在該柵藻的葉綠體基因組中表達(dá)。27. 一種分離的柵藻，包括用一種外源核苷酸序列轉(zhuǎn)化的一個(gè)葉綠體基因組，其中與該分離的柵藻相同種類(lèi)的一種未轉(zhuǎn)化的柵藻相比，所轉(zhuǎn)化的柵藻具有基于脂肪酸的脂質(zhì)的積累增加和/或脂質(zhì)類(lèi)型的改變，并且其中該外源核苷酸包括編碼一種涉及脂肪酸合成的酶的一種核酸序列。28.如權(quán)利要求27所述的分離的柵藻，其中該核酸被密碼子優(yōu)化用于在該柵藻的葉綠體基因組中表達(dá)。29. 一種用載體轉(zhuǎn)化柵藻的葉綠體基因組的方法，其中該載體包括i) 一個(gè)柵藻葉綠體基因組的一個(gè)第一核苷酸序列；ii) 一個(gè)柵藻葉綠體基因組的一個(gè)第二核苷酸序列；iii) 一個(gè)第三核苷酸序列，該第三核苷酸序列包括一個(gè)外源核苷酸序列，其中該外源核苷酸序列包括編碼一種感興趣的蛋白質(zhì)的一種核酸，其中該第三核苷酸序列位于該第一與第二核苷酸序列之間，并且其中該載體被用來(lái)轉(zhuǎn)化柵藻的葉綠體基因組；以及iv) —種被配置成表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該第三核苷酸序列進(jìn)一步包括編碼一種感興趣的第二蛋白質(zhì)的一個(gè)第二核酸序列。31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該啟動(dòng)子是一種PsbD或tufA啟動(dòng)子。32.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該柵藻是二形柵藻。33.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該柵藻是斜生柵藻。34.如權(quán)利要求29所述的方法,其中該第一核苷酸序列在長(zhǎng)度上是至少500bp、至少lOOObp、或至少1，500bp，并且該第一核苷酸序列與該柵藻的基因組的一個(gè)第一部分是同源的，并且該第二核苷酸序列在長(zhǎng)度上是至少500bp、至少lOOObp、或至少1，500bp,并且該第二核苷酸序列與該柵藻基因組的一個(gè)第二部分是同源的。35.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該第三核苷酸序列在大小上是至少O. 5kb、至少I(mǎi). Okb、至少2kb、至少3kb、至少5kb、至少8kb、至少llkb、或至少19kb。36.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該核酸被密碼子優(yōu)化用于在該柵藻的葉綠體基因組中表達(dá)。37. —種轉(zhuǎn)化的柵藻葉綠體基因組，它是通過(guò)權(quán)利要求29所述的方法轉(zhuǎn)化的。38. 一種用至少一種外源核苷酸序列來(lái)轉(zhuǎn)化柵藻的葉綠體基因組的方法，該方法包括i)獲得該外源核苷酸序列，其中該外源核苷酸序列包括編碼一種蛋白質(zhì)的一個(gè)核酸序列；ii)使該外源核苷酸序列結(jié)合到一種粒子上；并且iii)通過(guò)粒子轟擊將該外源核苷酸序列射入該柵藻中，其中該葉綠體基因組是用該外源核苷酸序列來(lái)轉(zhuǎn)化的。39.如權(quán)利要求38所述的方法,其中該外源核苷酸序列在大小上是至少O. 5kb、至少I(mǎi). Okb、至少2kb、至少3kb、至少5kb、至少8kb、至少llkb、或至少19kb。40.如權(quán)利要求38所述的方法,其中該核酸被密碼子優(yōu)化用于在該柵藻的葉綠體基因組中表達(dá)。41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該粒子是一種金粒子或一種鎢粒子。42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中該金粒子在直徑上是大約550nm至大約lOOOnm。43.如權(quán)利要求38所述的方法,其中該粒子轟擊是通過(guò)一種生物射彈裝置來(lái)進(jìn)行的。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該生物射彈裝置具有大約300psi至大約500psi的氦壓力。45.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該生物射彈裝置具有至少300psi、至少350psi、至少400psi、至少425psi、至少450psi、至少500psi、或至少500psi的氦壓力。46.如權(quán)利要求38所述的方法，其中結(jié)合到該粒子上的外源核苷酸序列是在距該柵藻大約2至大約4cm的距離處射擊的。47.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該生物射彈裝置是一種Helicos基因槍或一種Accell基因槍。48.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該核酸編碼一種涉及類(lèi)異戊二烯生物合成的蛋白質(zhì)。49.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該核酸編碼涉及脂肪酸生物合成的一種蛋白質(zhì)。50.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該柵藻是二形柵藻。51.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該柵藻是斜生柵藻。52. 一種轉(zhuǎn)化的柵藻的葉綠體基因組，它是通過(guò)權(quán)利要求38所述的方法轉(zhuǎn)化的。53. 一種用于獲得綠藻的葉綠體基因組的一個(gè)區(qū)域的方法，其中該區(qū)域在轉(zhuǎn)化該綠藻中是有用的，該方法包括1)獲得該綠藻的基因組DNA ;2)獲得一種簡(jiǎn)并正向引物，其 中該正向引物是針對(duì)該綠藻的一個(gè)PsbB基因；3)獲得一種簡(jiǎn)并反向引物，其中該反向引物是針對(duì)該綠藻的一個(gè)PsbH基因；并且4)使用步驟2)和步驟3)的這些引物來(lái)擴(kuò)增該綠藻的葉綠體基因組的區(qū)域，其中獲得了該擴(kuò)增區(qū)的核苷酸序列。54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該擴(kuò)增區(qū)是通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增的。55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該測(cè)序的區(qū)域被克隆到一種載體中。56.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該簡(jiǎn)并正向引物是引物4099 (SEQID NO :129)或正向引物4100 (SEQ ID NO :130)，并且其中簡(jiǎn)并反向引物是引物4101 (SEQ IDNO 131)或反向引物4102(SEQ ID NO 132) 0 57.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該正向引物是引物4099 (SEQ ID NO :129)并且該反向引物是引物4102 (SEQ ID NO :132)。58.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該擴(kuò)增區(qū)的序列的至少一部分是已知的。59.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該葉綠體基因組的擴(kuò)增區(qū)來(lái)自菜茵衣藻、普通小球藻、斜生柵藻、或紫紅紫菜。60.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該擴(kuò)增區(qū)的序列是未知的。61.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該葉綠體基因組的擴(kuò)增區(qū)是來(lái)自杜氏鹽藻(D. tertiolecta)并且包括SEQ ID NO :133的核酸序列；來(lái)自未知種類(lèi)的杜氏藻，包括SEQ ID NO :134的核酸序列；來(lái)自N. abudans并且包括SEQ ID NO :135的核酸序列；來(lái)自普通小球藻并且包括SEQ ID NO 136的核酸序列；或來(lái)自四鞭片藻并且包括SEQ ID NO :137的核酸序列。62.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該葉綠體基因組的擴(kuò)增區(qū)包括編碼基因簇PsbB-psbT-psbN-psbH的一個(gè)核苷酸序列。63.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該葉綠體基因組的擴(kuò)增區(qū)包括編碼基因簇psbB-psbT的一個(gè)核苷酸序列。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中將編碼一種基因的一個(gè)核酸插入編碼PsbB和psbT的核苷酸序列之間。65.如權(quán)利要求53所述的方法,其中該葉綠體基因組的擴(kuò)增區(qū)包括編碼基因簇psbT-psbN的一個(gè)核苷酸序列。66.如權(quán)利要求65所述的方法,其中將編碼一種基因的一個(gè)核酸插入編碼psbT和psbN的核苷酸序列之間。67.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該葉綠體基因組的擴(kuò)增區(qū)包括編碼基因簇psbN-psbH的一個(gè)核苷酸序列。68.如權(quán)利要求67所述的方法,其中將編碼一種基因的一個(gè)核酸插入編碼psbN和psbH的核苷酸序列之間。69.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該葉綠體基因組的擴(kuò)增區(qū)包括編碼基因簇psbH-psbK的一個(gè)核苷酸序列。70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中將編碼一種基因的一個(gè)核酸插入編碼psbH和psbK的核苷酸序列之間。71.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該葉綠體基因組的擴(kuò)增區(qū)包括編碼psbK的3’區(qū)的一個(gè)核苷酸序列。72.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該序列是一個(gè)核酸序列。73.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該序列是一個(gè)氨基酸序列。74. 一種綠藻的葉綠體基因組的區(qū)域，是通過(guò)以下方法獲得的1)獲得該綠藻的基因組DNA ;2)獲得一種簡(jiǎn)并正向引物，其中該正向引物是針對(duì)該綠藻的一個(gè)psbB基因；3)獲得一種簡(jiǎn)并反向引物，其中該反向引物是針對(duì)該綠藻的一個(gè)psbH基因；并且4)使用步驟2)和步驟3)的這些引物來(lái)擴(kuò)增該綠藻的葉綠體基因組的這個(gè)區(qū)域，其中該擴(kuò)增區(qū)被測(cè)序并且包括一個(gè)核苷酸序列，并且其中該核苷酸序列被修飾以包括編碼至少一種蛋白質(zhì)的一個(gè)核酸序列。75. 一種在轉(zhuǎn)化斜生柵藻的葉綠體基因組中有用的載體，該載體包括來(lái)自斜生柵藻的葉綠體基因組的一個(gè)5. 2kb區(qū)域(柵藻葉綠體序列NCBI參考序列NC_008101，057，611-062850bp)，其中該區(qū)域包括SEQ ID NO :125的核酸序列，或包括一個(gè)與SEQ IDNO : 125的核酸序列的至少一個(gè)500bp序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少99%的同源性的核苷酸序列。76. —種分離的核苷酸序列，包括SEQ ID NO :125的核酸，或包括一個(gè)與SEQ IDNO : 125的核酸序列的至少一個(gè)500bp序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少99%的同源性的核酸序列，其中該分離的核苷酸序列可以用于轉(zhuǎn)化一種柵藻的葉綠、體基因組。77.如權(quán)利要求76所述的分離的核苷酸序列，其中SEQ ID NO :125的核酸序列被修飾成包括編碼一種蛋白質(zhì)的一個(gè)第二核酸。78. 一種宿主細(xì)胞，包括SEQ ID NO :125的核酸序列，或包括一個(gè)與SEQ ID NO:125的核酸序列的至少一個(gè)500bp序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的同源性的核酸序列。79.如權(quán)利要求78所述的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是來(lái)自一種柵藻的宿主細(xì)胞。80.如權(quán)利要求78所述的宿主細(xì)胞，其中SEQ ID NO :125的核酸序列被修飾成包括編碼一種蛋白質(zhì)的一個(gè)第二核酸序列。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明通過(guò)以下說(shuō)明書(shū)、隨附的權(quán)利要求以及附圖本披露的這些和其他特征、方面、以及優(yōu)點(diǎn)將被更好地理解，其中圖I顯示了用于將DCMUlr工程化到二形柵藻中的突變的psbA片段和3’ UTR載體的圖形表示。 圖2顯示了來(lái)自psbA 264A DCMUr轉(zhuǎn)化體(3和4)以及二形柵藻野生型(WT)DNA的擴(kuò)增和消化。U =未切割的DNA以及C =切割的DNA(用Xbal消化)。圖3顯示了一個(gè)psbA S264轉(zhuǎn)化體，它是DCMUlr以及阿特拉津\圖4顯不了 p04_38的一個(gè)圖形表不。圖5顯不了 p04_21的一個(gè)圖形表不。圖6顯示了來(lái)自二形柵藻CAMlr轉(zhuǎn)化體DNA的PCR擴(kuò)增。圖7顯示了用來(lái)轉(zhuǎn)化二形柵藻的載體P04-31的圖形表示。圖8顯示了 BDll克隆的多重篩選。圖9顯示了表達(dá)BDll的SE0070的蛋白質(zhì)印跡(親本2和4的亞克隆)。

圖10顯示了在來(lái)自包含木聚糖內(nèi)切酶基因(親本2和4)的二形柵藻轉(zhuǎn)化體的澄清溶解產(chǎn)物中的木聚糖內(nèi)切酶活性。圖11顯示了 p04-28的一個(gè)圖形表示。圖12顯示了在用FPP合成酶工程化的數(shù)個(gè)二形柵藻系中的同質(zhì)性(homoplasmicity)的驗(yàn)證。圖13顯示了在7個(gè)轉(zhuǎn)化體中具有法尼基二磷酸(FPP)合成酶蛋白表達(dá)的抗flag蛋白質(zhì)印跡。圖14A顯示了針對(duì)野生型陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化的二形柵藻)、工程化株(用FPP合成酶(禽類(lèi))轉(zhuǎn)化的二形柵藻)、以及FPP陽(yáng)性對(duì)照的總離子色譜圖(TIC)的疊加。Y軸是豐度。X軸是時(shí)間。圖14B顯示了 FPP陽(yáng)性對(duì)照的TIC。FPP的保留時(shí)間是11. 441分鐘。Y軸是豐度。X軸是時(shí)間。圖14C顯示了在11. 441分鐘時(shí)FPP陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)譜圖。Y軸是豐度。X軸是m/z (質(zhì)荷比)。圖14D顯示了與IPP和DMAPP —起孵育的工程化株(用FPP合成酶(禽類(lèi))轉(zhuǎn)化的二形柵藻)的TIC。該產(chǎn)物(FPP)的保留時(shí)間是11. 441分鐘。Y軸是豐度。X軸是時(shí)間。圖14E顯示了在11. 441分鐘時(shí)工程化株(用FPP合酶(禽類(lèi))轉(zhuǎn)化的二形柵藻)的質(zhì)譜圖。Y軸是豐度。X軸是m/z(質(zhì)荷比)。
圖14F顯示了與IPP和DMAPP —起孵育的未轉(zhuǎn)化的野生型二形柵藻株的TIC。Y軸是豐度。X軸是時(shí)間。圖14G顯示了在11.441分鐘時(shí)未轉(zhuǎn)化的野生型二形柵藻株的質(zhì)譜圖。Y軸是豐度。X軸是m/z(質(zhì)荷比)。圖15A顯示了針對(duì)與IPP和DMAPP孵育的野生型陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化的二形柵藻)、與IPP和DMAPP —起孵育的工程化株(用IS09 (FPP合成酶)轉(zhuǎn)化的二形柵藻)、以及FPP陽(yáng)性對(duì)照的總離子色譜圖(TIC)的疊加。所有三個(gè)酶反應(yīng)都與紫穗槐二烯合成酶一起孵育從而在偶聯(lián)酶測(cè)定中形成紫穗槐-4，11-二烯。Y軸是豐度。X軸是時(shí)間。圖15B顯示了與紫穗槐二烯合成酶一起孵育的FPP陽(yáng)性對(duì)照的TIC。紫穗槐二烯的保留時(shí)間是9. 917分鐘。Y軸是豐度。X軸是時(shí)間。圖15C顯示了在9. 917分鐘時(shí)紫穗槐二烯陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)譜圖。Y軸是豐度。X軸 是m/z(質(zhì)荷比)。圖15D顯示了工程化株(用IS09 (FPP合成酶)轉(zhuǎn)化的，與IPP和DMAPP以及紫穗槐二烯合酶一起孵育的二形柵藻)的TIC。該反應(yīng)產(chǎn)物(紫穗槐二烯)的保留時(shí)間是9. 917分鐘。Y軸是豐度。X軸是時(shí)間。圖15E顯示了當(dāng)與IPP、DMAPP、以及紫穗槐二烯合成酶一起孵育時(shí)由工程化株(用IS09(FPP合成酶)轉(zhuǎn)化的二形柵藻)產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。該產(chǎn)物(紫穗槐二烯)的保留時(shí)間是9. 917分鐘。Y軸是豐度。X軸是m/z(質(zhì)荷比)。圖15F顯示了與IPP和DMAPP以及紫穗槐二烯合成酶一起孵育的未轉(zhuǎn)化的野生型二形柵藻株的TIC。Y軸是豐度。X軸是時(shí)間。圖15G顯示了酶反應(yīng)的質(zhì)譜圖(在9. 917分鐘時(shí))，其中未轉(zhuǎn)化的野生型二形柵藻株與IPP、DMAPP、以及紫穗槐二烯合成酶一起孵育。Y軸是豐度。X軸是m/z(質(zhì)荷比)。圖16顯不了 p04_196的一個(gè)圖形表不。圖17A和17B顯示了用IS_88(17A)轉(zhuǎn)化的二形柵藻和野生型二形柵藻(17B)SM監(jiān)測(cè)的GC/MS色譜圖的比較。使用離子m/z = 229、135、以及122對(duì)色譜圖進(jìn)行監(jiān)測(cè)(對(duì)于殼梭孢菌素二烯是特征的)。在(17A)中的峰的保留時(shí)間(7. 617min)與純化的殼梭孢素二烯的保留時(shí)間匹配。圖18A和18B顯示了針對(duì)二形柵藻-IS88(A)和野生型二形柵藻(B)在殼梭孢素二烯峰的保留時(shí)間(t = 7. 617min)時(shí)的質(zhì)譜圖。二形柵藻-IS88的質(zhì)譜圖與殼梭孢素二烯已知譜圖良好匹配。野生型的質(zhì)譜圖僅顯示本底離子。圖18C顯示純化的殼梭孢素二烯的質(zhì)譜圖。圖19顯示了 p04-118的一個(gè)圖形表示。圖20顯示了用編碼植酸酶(FD6)的基因工程化的二形柵藻的抗-flag蛋白質(zhì)印跡。圖21顯不了 p04_162的一個(gè)圖形表不。圖22顯示了 EreB基因(SEQ ID NO 25)是從由數(shù)種潛在轉(zhuǎn)化體衍生的DNA但不是從由野生型二形柵藻衍生的DNA來(lái)擴(kuò)增的。對(duì)照W =無(wú)DNA ；+ =質(zhì)粒DNA ;并且D和O是二形柵藻DNA。圖23顯不了 p04_161的一個(gè)圖形表不。
圖24顯示了 codA平板。圖25顯不了 p04_267的一個(gè)圖形表不。圖26顯示了用FPP合成酶(Is09)和沒(méi)藥烯合成酶(Isll)基因工程化的二形柵藻抗-flag蛋白質(zhì)印跡,顯示了兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)。圖27顯不了 p04_116的一個(gè)圖形表不。圖28顯示了木聚糖內(nèi)切酶作為一種單肽(不是與CAT的融合物)產(chǎn)生于工程化的二形柵藻細(xì)胞中。圖29顯示了在工程化的二形柵藻中的木聚糖內(nèi)切酶活性(操縱子1_1、2_1、2_2、2_3)。+是用psbD驅(qū)動(dòng)木聚糖酶的工程化的二形柵藻，并且“wt”是野生型。圖30A和圖30B顯示了木聚糖內(nèi)切酶和CAT被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)單個(gè)轉(zhuǎn)錄本。圖30A顯示了引物設(shè)計(jì)并且圖30B是一個(gè)瓊脂糖凝膠，顯示了來(lái)自相應(yīng)于木聚糖內(nèi)切酶-CAT轉(zhuǎn)錄本的5個(gè)轉(zhuǎn)化體中的4個(gè)的cDNA的擴(kuò)增。圖31顯示了用不同RBS序列轉(zhuǎn)化的DNA的一個(gè)圖形表示。在兩種情況下，使用來(lái)自二形柵藻的PsbD啟動(dòng)子和psbA3’ UTR來(lái)調(diào)節(jié)CAT-RBS-BD11的表達(dá)。BDll編碼來(lái)自里氏木霉的木聚糖內(nèi)切酶基因。這些盒被亞克隆到載體P04-166中的同源區(qū)A與同源區(qū)B之間。圖32A顯示了來(lái)自TAP平板的p04_231的木聚糖酶活性。圖32B顯示了來(lái)自TAP平板的P04-232的木聚糖酶活性。檢測(cè)在用連接CAT和木聚糖內(nèi)切酶(p04-231)的RBSl工程化的細(xì)胞中的木聚糖內(nèi)切酶活性，但是沒(méi)有用RBS2 (p04-232)。圖33顯不了 p04_142的一個(gè)圖形表不。圖34顯示了在克隆52 (在psbT和psbN之間的區(qū)域中包含CAT盒的工程化的二形柵藻系)中的同質(zhì)性的驗(yàn)證。圖35顯示在完全相同的D2 (psbD)啟動(dòng)子區(qū)段處從重組獲得的轉(zhuǎn)化的DNA(A)和環(huán)出產(chǎn)物(B)的圖形表示。圖36顯示在二形柵藻的多重PCR中未能擴(kuò)增CAT片段。圖37顯示了 p04-291和p04_294的一個(gè)圖形表示。BADl和BAD4對(duì)應(yīng)地是來(lái)自菠
菜和甜菜的甜菜堿醛脫氫酶基因。圖38顯示了抗HA蛋白質(zhì)印跡，顯示了在二形柵藻中來(lái)自菠菜(291克隆，1、2、3、BADI)或來(lái)自甜菜(294 4-l、5-l、6-l、7-l、BAD4)的甜菜堿醛脫氫酶的表達(dá)。圖39顯不了 p45_5和p45_6的一個(gè)圖形表不。圖40在泳道4、5、6中顯示了來(lái)自杜氏鹽藻轉(zhuǎn)化體的EreB擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠。圖41顯不了 p45_12的一個(gè)圖形表不。圖42顯示了來(lái)自杜氏鹽藻轉(zhuǎn)化體12-3的EreB擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠。圖43顯示了通過(guò)抗flag蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)在杜氏鹽藻轉(zhuǎn)化體12_3中的木聚糖酶蛋白(BDll)。
圖44顯示了檢測(cè)在杜氏鹽藻轉(zhuǎn)化體12-3中的木聚糖酶活性。陽(yáng)性對(duì)照是用木聚糖內(nèi)切酶工程化的二形柵藻。圖45顯不了無(wú)病毒載體pUC(2, 436bp)。圖46 顯示了 載體 p04-35 (4，304bp)。
圖47 顯示了載體 pSS_007(6, 132bp)。圖48 顯示了載體 pSS_013(7, 970bp)。圖49 顯示了載體 pSS_023(10. 322kb)。圖50顯示了基因載體I (5，774bp)。圖51顯示了基因載體2(10. 198kb)。圖52顯示基因載體3(7，Illbp)。圖53 顯示了載體 pRS414(4, 784bp)。圖54 顯示了載體 pBeloBACll (7，507bp)。
圖55 顯示了載體 pLWOOl (10. 049kb)。圖56 顯示了載體 pLW092(13. 737kb)。圖57 顯示了載體 pBeloBAC-TRP(10. 524kb)。圖58 顯示了載體 pLW100(18. 847kb)。圖59 顯示了 載體 p04-198。圖60 顯示了載體 pSS-035 (6，49 lbp)。圖61 顯示了載體 pSS-023CC93CC94(15. 083kb)。圖62 顯示了載體 pSS-023CC93CC97(15. 077kb)。圖63 顯示了載體 pLW100CC90CC91CC92(26. 319kb)。圖64顯示了載體pLWlOO四基因組裝(34. 509kb)。圖65 顯示了用 NdeI、PacI、PstI、Seal、SnaBI、以及 SpeI 進(jìn)行的 pSS-023 限制酶切作圖。圖66 顯示了用 EcoRV、NotI、PmlI、PvuUP SnaBI 進(jìn)行的 pLWOOl 限制酶切作圖。圖67A-E 顯示了用 PacI (c)、PstI (e)、Seal (b)、和 XhoI (d)、以及未切割(a)進(jìn)行PLW092限制酶切作圖。圖 68 顯示了用 EcoRV、NdeI、NotI、PacI、PstI、Seal 以及 XhoI 進(jìn)行的 pLfflOO 限制酶切作圖。圖69 顯示了用 EcoRI、EcoRV、KpnI、NotI、PvuIUP Seal 進(jìn)行的 pSS-035 限制酶切作圖。圖70顯示了包括用NdeI消化的四個(gè)雙基因重疊群的質(zhì)粒DNA。圖71顯示了包括用NdeI消化的兩個(gè)三基因重疊群的質(zhì)粒DNA。圖72顯示了包括用NdeI消化的四個(gè)四基因重疊群的質(zhì)粒DNA。圖73顯示了來(lái)自二形柵藻的保守型psbB-psbT-psbH-psbN基因簇的PCR擴(kuò)增。圖74顯不了來(lái)自杜氏藻屬未知種類(lèi)的一個(gè)株的保守型psbB-psbT-psbH-psbN基因簇的PCR擴(kuò)增。圖75顯不了來(lái)自N. abudans的保守型psbB-psbT-psbH-psbN基因族的PCR擴(kuò)增。圖76 顯示了載體 p04-128。圖77 顯示了載體 p04-129。圖78 顯示了載體 p04-130。圖79 顯示了載體 p04-131。圖80 顯示了載體 p04_142。
圖81 顯示了載體 p04_143。
圖82 顯示了載體 p04_144。圖83 顯示了載體 p04_145。圖84顯示了針對(duì)來(lái)自二形柵藻的克隆的同質(zhì)性PCR篩選，該二形柵藻在psbT與psbN(p04-142)之間或者在psbN與psbH(p04-143)之間具有一個(gè)抗性盒。圖85顯示了針對(duì)來(lái)自二形柵藻的克隆進(jìn)行同質(zhì)性PCR篩選，該二形柵藻在psbH和psbK(p04-144)之間亦或psbK的3’(p04_145)具有一個(gè)抗性盒。圖86是來(lái)自四種不同藻類(lèi)種類(lèi)的psbB基因的核苷酸比對(duì)。圖87是來(lái)自四種不同藻類(lèi)種類(lèi)的psbH區(qū)域的核苷酸比對(duì)。圖88是四種不同藻類(lèi)種類(lèi)的從psbB基因至psbH基因的基因組區(qū)域的比對(duì)。圖89 是載體 p04-151。圖90A-D顯示了限制酶作圖結(jié)果。圖91 顯示了載體 pLW106。圖92A和B描繪了 4種克隆，這些克隆針對(duì)BDll和IS99兩者進(jìn)行PCR陽(yáng)性篩選。圖93A-C描繪了 4種克隆，這些克隆針對(duì)CC90、CC91、和CC92進(jìn)行PCR陽(yáng)性篩選。圖94A和B描繪了 2種克隆，這些克隆針對(duì)IS61、IS62、IS57以及IS116進(jìn)行PCR陽(yáng)性篩選。詳細(xì)說(shuō)明提供以下詳細(xì)說(shuō)明以幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)踐本披露。即使這樣，本詳細(xì)說(shuō)明不應(yīng)當(dāng)解釋為不適當(dāng)?shù)叵拗票九?，因?yàn)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員可以在在此討論的實(shí)施方案中做出多種修改和變化，而不偏離本披露的精神或范圍。如在本說(shuō)明書(shū)以及隨附的權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式“一個(gè)/ 一種”(“a”)、“一個(gè)/ 一種”(“an”)、以及“該”包括復(fù)數(shù)指代。內(nèi)源的如在此所述的一種內(nèi)源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白質(zhì)是根據(jù)與宿主生物的關(guān)系而定義的。一種內(nèi)源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白質(zhì)是天然發(fā)生在宿主生物中的那些。外源的如在此所述的一種外源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白質(zhì)是根據(jù)與宿主生物的關(guān)系而定義的。一種外源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白質(zhì)是并非天然發(fā)生在宿主生物中或處于宿主生物中的不同位置的那些。可以用于在此披露的實(shí)施方案中的基因、核酸、蛋白質(zhì)、以及多肽的實(shí)例包括但不限于SEQ ID NO : I 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO :2 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO 3 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO :4 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO 5 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO :6 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO 7 是一個(gè) PCR 引物。
SEQ ID NO :8 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO :9 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO : 10 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO : 11 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO : 12 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO : 13 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO : 14 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO 15 是一個(gè) PCR 引物(#4682)。 SEQ ID NO : 16 是一個(gè) PCR 弓 I 物(#4982)。SEQ ID NO : 17 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO : 18 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO : 19 是一個(gè) PCR 引物。SEQ ID NO 20是通過(guò)TEV蛋白酶位點(diǎn)連接到MAT表位標(biāo)簽上的一個(gè)人工FLAG表位標(biāo)簽的核苷酸序列。SEQ ID NO :21是針對(duì)在萊茵衣藻中的葉綠體表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼來(lái)自里氏木霉木聚糖內(nèi)切酶的基因。SEQ ID NO 22是連接到FLAG表位標(biāo)簽上的人工TEV蛋白酶位點(diǎn)的核苷酸序列。SEQ ID NO :23是針對(duì)在萊茵衣藻中的葉綠體表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼來(lái)自原雞的FPP合成酶的基因。SEQ ID NO :24是人工鏈霉親和素表位標(biāo)簽的核苷酸序列。SEQ ID NO :25是根據(jù)萊茵衣藻葉綠體中最頻繁的密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼來(lái)自扁桃假單胞菌的殼梭孢菌素二烯合成酶的基因。SEQ ID NO :26是針對(duì)在萊茵衣藻中的葉綠體表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼來(lái)自大腸桿菌的植酸酶的基因。SEQ ID NO 27是通過(guò)TEV蛋白酶位點(diǎn)連接到MAT表位標(biāo)簽上的一個(gè)人工FLAG表位標(biāo)簽的核苷酸序列。SEQ ID NO :28是來(lái)自大腸桿菌的修飾的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，其中位置64處的核苷酸從A變成G，位置436、437、和438處的核苷酸從TCA變成AGC，并且位置516處的核苷酸從C變成T。SEQ ID NO :29是來(lái)自大腸桿菌的修飾的紅霉素酯酶基因，其中位置153處的核苷酸從C變成T，位置195處的核苷酸從T變成C，位置198處的核苷酸從A變成C，位置603處的核苷酸從T變成A，位置1194處的核苷酸從C變成T，以及位置1203處的核苷酸從T變成A。 SEQ ID NO :30是來(lái)自二形柵藻基因組DNA的片段，它編碼包含psbA基因3’端的一部分和某個(gè)非翻譯區(qū)的一個(gè)區(qū)域，其中對(duì)于S264A突變而言該片段的核苷酸1913從T突變成G，并且核苷酸1928至1930從CGT突變成AGA，從而產(chǎn)生一個(gè)沉默的XbaI限制酶切位點(diǎn)。SEQ ID NO :31是針對(duì)在萊茵衣藻葉綠體中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼來(lái)自大腸桿菌的胞嘧啶脫氨酶的基因。
SEQ ID NO :32是根據(jù)萊茵衣藻葉綠體中tRNA的使用進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼來(lái)自菠菜的甜菜堿醛脫氫酶的基因。SEQ ID NO 33是通過(guò)TEV蛋白酶位點(diǎn)連接到6xHIS標(biāo)簽上的人工3xHA標(biāo)簽的核苷酸序列。SEQ ID NO :34是針對(duì)在萊茵衣藻葉綠體中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼甜菜的甜菜堿醛脫氫酶的基因。SEQ ID NO :35是針對(duì)在萊茵衣藻葉綠體中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼來(lái)自大冷杉的E- α -沒(méi)藥烯合成酶的基因。SEQ ID NO 36是一種修飾的核苷酸序列，該序列是在5’和3’端上具有額外核苷酸的SEQ ID NO 37的反向互補(bǔ)物；核苷酸1_43是在3’端上的額外核苷酸，并且核苷酸532-541是在5’端上的額外核苷酸。 SEQ ID NO :37是來(lái)自二形柵藻psbA基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO :38是一種修飾的核苷酸序列，該序列是具有在5’端上的額外核苷酸和一個(gè)核苷酸插入的SEQ ID NO :39的反向互補(bǔ)物；核苷酸535-716是額外的5’序列，并且核苷酸176-188是該插入。SEQ ID NO :39是針對(duì)二形柵藻psbB基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO :40是針對(duì)二形柵藻psbD基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的一個(gè)序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO 41是一種修飾的核苷酸序列，該序列是在5’端上具有額外序列的SEQID NO 42的反向互補(bǔ)物；核苷酸537-464是5’端上的額外序列，核苷酸308從C變成T，核苷酸310從C變成T，并且核苷酸259從A變成G。SEQ ID NO :42是針對(duì)二形柵藻tufA基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO 43是一種修飾的核苷酸序列，該序列是在5’端上具有額外序列的SEQID NO :44的反向物；核苷酸550-557是5’端上的額外序列。SEQ ID NO :44是針對(duì)二形柵藻rpoA的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列。SEQ ID NO :45是針對(duì)二形柵藻中的cemA基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID N0:46是一種修飾的核苷酸序列，該序列是在核苷酸233-266處具有插入物的SEQ ID NO 47的反向互補(bǔ)物。SEQ ID NO :47是針對(duì)在二形柵藻中的ftsH基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO 48是在5’端上具有額外序列的SEQ ID NO 49的一種修飾的核苷酸序列，核苷酸1-19是額外序列，核苷酸404已經(jīng)從A變成T。SEQ ID NO :49是針對(duì)在二形柵藻中的rbcL基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO 50是在5’端上截短了 24個(gè)核苷酸的SEQ ID NO 51的修飾的核苷酸序列；在位置2處的核苷酸從G變成C，位置5從A變成G，在位置199和200處插入兩個(gè)T，并且在位置472處它從A變成G。SEQ ID NO :51是針對(duì)來(lái)自二形柵藻的chlB基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。 SEQ ID NO :52是SEQ ID NO :53的一種修飾的核苷酸序列，其中核苷酸1_3是額外序列，在位置442處的核苷酸是一個(gè)G插入，并且位置482處的R是較差測(cè)序的結(jié)果。SEQ ID NO :53是針對(duì)二形柵藻中的petA基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO :54是一種修飾的核苷酸序列，該序列是SEQ ID NO :55的反向互補(bǔ)物；其中核苷酸3、8、18、21、49、57、和82是插入物，核苷酸484-503是5’端上的額外核苷酸，核苷酸26從C變成T，并且核苷酸30從A變成C。SEQ ID NO :55是針對(duì)來(lái)自二形柵藻的petB基因的內(nèi)源啟動(dòng)子的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO 56是在5’端上截短了 3個(gè)核苷酸的SEQ ID NO 57的修飾的核苷酸序列。SEQ ID NO :57是針對(duì)來(lái)自二形柵藻的rbcL基因的內(nèi)源終止子區(qū)的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO :58是針對(duì)來(lái)自二形柵藻的psbA基因的內(nèi)源終止子區(qū)的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO :59是針對(duì)來(lái)自二形柵藻的psaB基因的內(nèi)源終止子區(qū)的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO 60是一個(gè)核酸接頭序列(RBSl)。SEQ ID NO 61是一個(gè)核酸接頭序列(RBS2)。SEQ ID NO :62是針對(duì)來(lái)自杜氏鹽藻的psbD基因的內(nèi)源啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO :63是針對(duì)來(lái)自杜氏鹽藻的tufA基因的內(nèi)源啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO :64是針對(duì)來(lái)自杜氏鹽藻的rbcL基因的內(nèi)源終止子區(qū)的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。。SEQ ID NO :65是針對(duì)來(lái)自未知種類(lèi)杜氏藻分離物的psbA基因的內(nèi)源終止子區(qū)的核苷酸序列，它被克隆到整合載體中。SEQ ID NO :66 是 PCR 引物 I。SEQ ID NO :67 是 PCR 引物 2。SEQ ID NO :68 是 PCR 引物 3。SEQ ID NO :69 是 PCR 引物 4。SEQ ID NO :70 是 PCR 引物 5。SEQ ID NO :71 是 PCR 引物 6。SEQ ID NO : 72 是 PCR 引物 7。SEQ ID NO :73 是 PCR 引物 8。
SEQID NO :74 是 PCR 引物 9。SEQID NO :75 是 PCR 引物 10。SEQID NO :76 是 PCR 引物 11。SEQID NO :77 是 PCR 引物 12。SEQID NO :78 是 PCR 引物 13。SEQID NO : 79 是 PCR 引物 14。SEQID NO :80 是 PCR 引物 15。SEQID NO :81 是 PCR 引物 16。SEQID NO :82 是 PCR 引物 17。SEQID NO :83 是 PCR 引物 18。SEQID NO :84 是 PCR 引物 19。SEQID NO :85 是 PCR 引物 20。SEQID NO :86 是 PCR 引物 21。SEQID NO :87 是 PCR 引物 22。SEQID NO :88 是 PCR 引物 23。SEQID NO :89 是 PCR 引物 24。SEQID NO :90 是 PCR 引物 25。SEQID NO :91 是 PCR 引物 26。SEQID NO :92 是 PCR 引物 27。SEQID NO :93 是 PCR 引物 28。SEQID NO :94 是 PCR 引物 29。SEQID NO :95 是 PCR 引物 30。SEQID NO :96 是 PCR 引物 31。SEQID NO :97 是 PCR 引物 32。SEQID NO :98 是 PCR 引物 33。SEQID NO :99 是 PCR 引物 34。SEQID NO : 100 是 PCR 引物 35。SEQID NO : 101 是 PCR 引物 36。SEQID NO : 102 是 PCR 引物 37。SEQID NO :103包括編碼URA3的核酸序列。SEQID NO :104包括編碼ADE2的核酸序列。SEQID NO :105包括編碼URA3-ADE2的核酸序列。 SEQID NO :106是具有工程化限制酶切位點(diǎn)的核酸接頭序列。SEQID NO 107 包括編碼 TRP1-ARS1-CEN4 (來(lái)自 pYAC4)的核酸序列。SEQID NO :108包括編碼LEU2的核酸序列。SEQID NO :109包括編碼CC-93的核酸序列。SEQID NO :110包括編碼CC-94的核酸序列。SEQID NO :111包括插入到pSS-023中的重疊群序列(CC93-CC94)。SEQID NO :112包括插入到pSS-023中的重疊群序列(CC93-CC97)。
SEQID NO :113包括編碼CC-97的核酸序列。SEQID NO :114 包括插入到 pLWlOO 中的重疊群序列(CC90-CC91-CC92)。SEQID NO :115包括編碼CC-90的核酸序列。SEQID NO :116包括編碼CC-91的核酸序列。SEQID NO :117包括編碼CC-92的核酸序列。SEQID NO :118包括編碼HIS3的核酸序列。SEQID NO :119包括編碼LYS2的核酸序列。SEQID NO :120 包括插入到 pLWlOO 中的重疊群序列(IS57-IS116-IS62-IS61)。SEQID NO :121包括編碼IS57的核酸序列。SEQID NO :122包括編碼ISl 16的核酸序列。SEQID NO : 123包括對(duì)IS62進(jìn)行編碼的核酸序列。SEQID NO :124包括編碼IS61的核酸序列。SEQID NO :125是來(lái)自斜生柵藻的一個(gè)5，240堿基對(duì)序列。SEQID NO :126 是 A3 同源區(qū)。SEQID NO :127 是 B3 同源區(qū)。SEQID NO :128 包括編碼 rblcL-CAT-psbE 的序列。SEQID NO : 129 是一個(gè)簡(jiǎn)并 PCR 引物。SEQID NO : 130 是一個(gè)簡(jiǎn)并 PCR 引物。SEQID NO : 131 是一個(gè)簡(jiǎn)并 PCR 引物。SEQID NO : 132 是一個(gè)簡(jiǎn)并 PCR 引物。SEQID NO :133是編碼來(lái)自杜氏鹽藻的psbB、psbT、psbN、以及psbH基因的區(qū)域的基因組序列。SEQID NO : 134是編碼來(lái)自未知種類(lèi)杜氏藻的psbB、psbT、psbN、以及psbH基因的區(qū)域的基因組序列。SEQID NO 135 是編碼來(lái)自 N. abudans 的 psbB、psbT、psbN、和 psbH 基因的區(qū)域的部分基因組序列；N’的一段距離(stretch)表示序列中的空位。SEQID NO : 136是編碼來(lái)自普通小球藻分離物的psbB、psbT、psbN、以及psbH基因的區(qū)域的基因組序列。SEQID NO : 137是編碼來(lái)自四鞭片藻的psbB、psbT、psbN、以及psbH基因的區(qū)域的基因組序列。SEQID NO :138 是 PCR 引物(#4682)。SEQID NO :139 是 PCR 引物(#4982)。SEQID NO : 140 是 PCR 引物 4684。SEQID NO : 141 是 PCR 引物 4685。SEQID NO : 142 是 PCR 引物 4686。、
SEQID NO : 143 是 PCR 引物 4687。SEQID NO : 144 是 PCR 引物 4688。SEQID NO : 145 是 PCR 弓丨物 4689。SEQID NO :146包括編碼BDll的核苷酸序列。
SEQ ID NO :147包括編碼IS99的核苷酸序列。SEQ ID NO :148包括編碼CAT的核苷酸序列。SEQ ID NO :149 至 SEQ ID NO :170 是 PCR 引物。
本披露涉及轉(zhuǎn)化不同藻類(lèi)種類(lèi)，例如來(lái)自柵藻屬和來(lái)自杜氏藻屬的藻類(lèi)的方法，用于進(jìn)行這類(lèi)轉(zhuǎn)化的載體和核酸構(gòu)建體，以及使用在此披露的載體和方法生產(chǎn)的重組柵藻和杜氏藻生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的柵藻是二形柵藻。柵藻是綠藻的成員，是綠藻的不同集合。柵藻是由單細(xì)胞或2、4、8或16個(gè)線性排列的細(xì)胞的扁平菌落集落(coenobialcolony)組成的一個(gè)屬。這些細(xì)胞包含具有淀粉核和單核的單個(gè)質(zhì)體。柵藻是淡水和半咸水浮游生物的普通棲居者，并且不時(shí)地形成密集群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的生物來(lái)自杜氏藻屬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該杜氏藻是杜氏鹽藻。—個(gè)實(shí)施方案，本披露提供了用于轉(zhuǎn)化柵藻例如二形柵藻或斜生柵藻的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本披露提供了用于轉(zhuǎn)化杜氏藻例如杜氏鹽藻的載體?？梢詫⒈磉_(dá)盒構(gòu)建到適當(dāng)載體中。在某些情況下，該盒被設(shè)計(jì)成在宿主細(xì)胞中表達(dá)一種或多種蛋白質(zhì)編碼序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)構(gòu)建這類(lèi)載體。在典型的表達(dá)盒中，啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件位于其表達(dá)是所希望的編碼序列的5'或上游側(cè)上。在其他盒中，編碼序列側(cè)翼可以是當(dāng)插入到靶基因組中(例如核或質(zhì)體)允許進(jìn)行表達(dá)的序列。例如，編碼涉及合成感興趣化合物(例如類(lèi)異戊二烯)的酶的核酸，從而該酶的表達(dá)被天然發(fā)生的調(diào)節(jié)元件控制。可以使用在適當(dāng)條件下提供表達(dá)從而使mRNA或蛋白產(chǎn)物表達(dá)到足以生產(chǎn)有用數(shù)量的希望化合物水平的任何調(diào)節(jié)元件。可以將一個(gè)或多個(gè)額外蛋白編碼序列可操作地融合到啟動(dòng)子下游或3'上?？梢允褂冕槍?duì)單一的蛋白質(zhì)的編碼序列、以及針對(duì)兩種或更多種蛋白質(zhì)的融合的編碼序列。編碼序列還可以包含另外的元件，這些另外的元件允許表達(dá)的蛋白質(zhì)靶向到細(xì)胞表面上以及錨定到細(xì)胞表面上或者分泌到環(huán)境中。選擇標(biāo)記還用于設(shè)計(jì)載體以便有效地選擇被該載體轉(zhuǎn)化的藻類(lèi)?？梢詫⑦x擇標(biāo)記和人們希望引入的另一種序列兩者引入融合到單個(gè)啟動(dòng)子上并且在它的下游?？商娲?，可以引入兩種蛋白質(zhì)編碼序列，每一個(gè)都在啟動(dòng)子控制下。一種構(gòu)建柵藻或杜氏藻的基因操作株(genetically manipulated strain)的方法涉及用編碼感興趣的基因的核酸的轉(zhuǎn)化，典型地是能夠?qū)⑶绑w轉(zhuǎn)化成燃料產(chǎn)物或燃料產(chǎn)物前體(例如類(lèi)異戊二烯或脂肪酸)的酶、生物質(zhì)降解酶、或用于改善飼料特征的酶。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化可以將核酸引入到宿主藻細(xì)胞的任何質(zhì)體(例如，葉綠體)中。在其他實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化可以將核酸引入到宿主細(xì)胞的核基因組中。仍然在其他實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化將核酸引入到核基因組以及質(zhì)體兩者中。在一些情況下，編碼感興趣的蛋白質(zhì)(例如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或酶)的核酸針對(duì)預(yù)期插入位點(diǎn)而被密碼子偏倚(例如針對(duì)插入細(xì)胞核中而被核密碼子偏倚，針對(duì)插入葉綠體中而被葉綠體密碼子偏倚)。為了構(gòu)建載體，在適當(dāng)啟動(dòng)子控制下表達(dá)的基因的上游DNA序列可以被限制性作圖，并且對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)重要的區(qū)域被表征。確定了基因起始密碼子的確切位置并且，使用這個(gè)信息和限制性圖譜，可以設(shè)計(jì)一種載體，用于通過(guò)去除負(fù)責(zé)編碼基因的蛋白質(zhì)的區(qū)域但是留下發(fā)現(xiàn)包含負(fù)責(zé)控制基因的表達(dá)的遺傳物質(zhì)的上游區(qū)域來(lái)表達(dá)內(nèi)源或外源蛋白。典型地將合成寡核苷酸插入到該蛋白質(zhì)序列曾經(jīng)所處的位置中，使得可以使用在該合成寡核苷酸中的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)(即多克隆位點(diǎn))將任何另外的基因克隆到其中。然后插入在該位點(diǎn)處的不相關(guān)基因(或編碼序列)可以被控制在現(xiàn)存起始密碼子以及上游調(diào)節(jié)區(qū)之下，該上游調(diào)節(jié)區(qū)將驅(qū)動(dòng)由該基因編碼的外源(即不是正常存在的)蛋白質(zhì)的表達(dá)。一旦該外源蛋白質(zhì)的基因進(jìn)入克隆載體中，可以使用數(shù)種方法中的任何一種將它引入到宿主生物中，這些方法中的一些對(duì)于宿主生物可以是特定的。關(guān)于這些方法的變化充分描述于一般文獻(xiàn)中。術(shù)語(yǔ)“外源”在此是在比較意義上使用的，是指所提及的核苷酸序列(或多肽)是來(lái)自與參考來(lái)源不同的一個(gè)來(lái)源并且與該參考序列不同，或連接到它通常不與之結(jié)合的一個(gè)第二核苷酸序列上(或多肽)上，或被修飾使得它處于通常不與參考物質(zhì)結(jié)合的一種形式。例如，相對(duì)于葉綠體的核苷酸序列，編碼一種酶的多核苷酸是外源的，其中該多核苷酸在通常情況下未發(fā)現(xiàn)于葉綠體中(例如，編碼葉綠體序列或核序列的突變的多核苷酸)。作為另一個(gè)實(shí)例，相對(duì)于宿主生物，編碼一種酶的多核苷酸是外源的，其中該多核苷酸包含一種可操作地連接的序列(例如，啟動(dòng)子、同源重組位點(diǎn)、選擇標(biāo)記、和/或終止序列)，這些序列通常未發(fā)現(xiàn)于參考生物中。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式分離和/或合成編碼酶以及在本披露中有用的 其他蛋白質(zhì)的多核苷酸，包括但不限于克隆、亞克隆、以及PCR。在此所述的載體可以編碼在甲羥戊酸途徑中起作用的一種或多種多肽，例如像硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、以及甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶。在其他實(shí)施方案中，該多肽是在非甲羥戊酸途徑中的酶類(lèi)，如DOXP合成酶、DOXP還原酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶、4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4，-環(huán)二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶、HMB-PP還原酶、或DOXP還原異構(gòu)酶。一個(gè)實(shí)施方案是針對(duì)包含編碼能夠調(diào)節(jié)殼梭孢菌素二烯生物合成途徑的酶的核酸的載體。這種載體可以進(jìn)一步包括用于在藻類(lèi)中表達(dá)核酸的啟動(dòng)子。包括在這類(lèi)載體中的一種或多種核酸可以含有針對(duì)在選擇的宿主生物中表達(dá)而被優(yōu)化的密碼子偏倚的基因形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的殼梭孢菌素二烯是殼梭孢菌素_2，10 (14)-二烯。本披露的另一個(gè)方面是針對(duì)包含編碼一種酶的核酸的載體，當(dāng)將該載體整合到一種生物例如光合藻類(lèi)的基因組中時(shí)其產(chǎn)生殼梭孢菌素二烯，其中在無(wú)該載體的情況下該生物不產(chǎn)生殼梭孢菌素二烯并且其中在該生物中殼梭孢菌素二烯是沒(méi)有代謝活性的。在此進(jìn)一步提供了生產(chǎn)燃料產(chǎn)物的方法，包括a)轉(zhuǎn)化柵藻或杜氏藻，其中該轉(zhuǎn)化導(dǎo)致殼梭孢菌素二烯的產(chǎn)生或產(chǎn)生增加；b)從該生物中收集殼梭孢菌素二烯；以及c)使用該殼梭孢菌素二烯來(lái)生產(chǎn)燃料產(chǎn)物。本披露還考慮了通過(guò)用編碼一種或多種不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如藻類(lèi)細(xì)胞)和/或包含宿主細(xì)胞的生物來(lái)制造有助于脂肪酸、脂質(zhì)或油類(lèi)的分泌的多肽的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，還用有助于脂肪酸類(lèi)、脂質(zhì)、或油類(lèi)的產(chǎn)生的一種或多種酶來(lái)轉(zhuǎn)化這些宿主細(xì)胞或生物，這些酶是合成代謝酶類(lèi)。有助于合成脂肪酸的合成代謝酶類(lèi)的一些實(shí)例包括但不限于乙酰輔酶A羧化酶、酮還原酶、硫酯酶、丙二酰轉(zhuǎn)移酶、脫水酶、脂酰輔酶A連接酶、酮脂酰合成酶、烯酰還原酶、以及脫飽和酶。在一些實(shí)施方案中，這些酶是分解代謝或生物降解酶類(lèi)。在一些實(shí)施方案中，生產(chǎn)了一種單酶?？梢杂镁幋a一種或多種酶的多個(gè)基因轉(zhuǎn)化一些宿主細(xì)胞。例如，單個(gè)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以含有編碼多種酶的外源核酸，這些酶構(gòu)成整個(gè)合成途徑。一個(gè)途徑實(shí)例可能包括編碼乙酰輔酶A羧化酶、丙二酰轉(zhuǎn)移酶、酮脂酰合成酶、以及硫酯酶的基因。用整個(gè)路徑轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和/或從這些細(xì)胞中提取的酶，可以合成脂肪酸合成途徑的完整脂肪酸或中間體。這些構(gòu)建體可以包括同一基因的多個(gè)拷貝、編碼來(lái)自不同生物的相同酶的多基因、和/或在一個(gè)或多個(gè)編碼序列中具有一個(gè)或多個(gè)突變的多基因。在一些情況下，宿主細(xì)胞可以自然產(chǎn)生感興趣的脂肪酸、脂質(zhì)、甘油三酯、或油。因此，用編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以允許從細(xì)胞中分泌或增加分泌感興趣的分子。在其他情況下，用編碼對(duì)于產(chǎn)生感興趣分子必需的一種或多種酶的多肽來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。由這些修飾的細(xì)胞產(chǎn)生的酶導(dǎo)致可以從細(xì)胞和/或周?chē)h(huán)境(例如，生物反應(yīng)器，生長(zhǎng)培養(yǎng)基)中收集的脂肪酸、脂質(zhì)、甘油三酯、或油類(lèi)的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，在通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞中分泌產(chǎn)物之后進(jìn)行脂肪酸、脂質(zhì)、甘油三酯、或油類(lèi)的收集。脂肪酸類(lèi)、脂質(zhì)或油類(lèi)的合成還可以通過(guò)工程化細(xì)胞以表達(dá)輔助分子或調(diào)節(jié)分子來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，該輔助分子是一種酶，該酶產(chǎn)生一種被脂肪酸合成酶利用的底物。在一些實(shí)施方案中，該輔助或調(diào)節(jié)分子有助于生物質(zhì)的生長(zhǎng)或滋養(yǎng)。 本披露一個(gè)另外的方面提供了一種載體，該載體包括編碼生物質(zhì)降解酶的核酸以及配置成在非維管光合生物例如柵藻并且更具體地二形柵藻或杜氏藻中表達(dá)核酸的一個(gè)啟動(dòng)子。本披露的載體可以包含編碼一種以上的生物質(zhì)降解酶的核酸，并且在其他情況下，可以包括編碼共價(jià)連接生物質(zhì)降解酶的多肽的核酸。生物質(zhì)降解酶類(lèi)可以包括纖維素分解酶類(lèi)、半纖維素分解酶類(lèi)以及木質(zhì)素分解酶類(lèi)。更具體地，這些生物質(zhì)降解酶類(lèi)可以是外切-@ -葡聚糖酶、內(nèi)切-@ -葡聚糖酶、& -葡糖苷酶、木聚糖內(nèi)切酶、或木質(zhì)酶。編碼生物質(zhì)降解酶類(lèi)的核酸可以是從真菌或細(xì)菌來(lái)源獲得的，例如編碼綠色木霉中的外切-￠-葡聚糖酶、里氏木霉中的外切-P -葡聚糖酶、棘孢曲霉中的外切-P -葡聚糖酶、里氏木霉中的內(nèi)切-葡聚糖酶、黑曲霉中的內(nèi)切-￠-葡聚糖酶、里氏木霉中的3 -葡糖苷酶、黑曲霉中的￠-葡糖苷酶、以及黑曲霉中的木聚糖內(nèi)切酶的那些核酸。編碼生物質(zhì)降解酶類(lèi)的其他核酸對(duì)于這些生物可以是內(nèi)源的。還提供了一種包括多種載體和一種啟動(dòng)子的組合物，這些載體各自編碼一種不同的生物質(zhì)降解酶，該啟動(dòng)子用于在葉綠體中表達(dá)所述生物質(zhì)降解酶類(lèi)。這些組合物可以含有編碼特定酶的特定載體的多個(gè)拷貝。在一些情況下，這些載體可以包含編碼纖維素分解酶類(lèi)、半纖維素分解酶類(lèi)和/或木質(zhì)素分解酶類(lèi)的核酸。更具體地，多個(gè)載體可以包含能夠表達(dá)內(nèi)切-P -葡聚糖酶、內(nèi)切-葡聚糖酶、& -葡糖苷酶、木聚糖內(nèi)切酶、和/或木質(zhì)酶的載體。該實(shí)施方案的一些載體能夠插入到葉綠體基因組中并且這樣的插入可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)化葉綠體的光合作用能力的破壞。將其他載體插入到葉綠體基因組中不破壞轉(zhuǎn)化葉綠體的光合作用能力。一些載體提供了隔離在轉(zhuǎn)化葉綠體中的生物質(zhì)降解酶類(lèi)的表達(dá)。另一種載體編碼了多種不同的生物質(zhì)降解酶類(lèi)以及用于在非維管光合生物中表達(dá)生物質(zhì)降解酶類(lèi)的啟動(dòng)子。該生物質(zhì)降解酶類(lèi)可以是一種或多種纖維素分解酶類(lèi)、半纖維素分解酶類(lèi)以及木質(zhì)素分解酶類(lèi)。在一些載體中，多種不同的生物質(zhì)降解酶類(lèi)是外切-￠-葡聚糖酶、內(nèi)切-葡聚糖酶、3 -葡糖苷酶、木質(zhì)酶以及木聚糖內(nèi)切酶。在一些實(shí)施方案中，多種酶類(lèi)是可操作地連接的。在其他實(shí)施方案中，多種酶類(lèi)被表達(dá)為一種功能性蛋白質(zhì)復(fù)合體。將一些載體插入到宿主細(xì)胞基因組中不破壞該生物的光合能力。編碼多種不同酶類(lèi)的載體可以導(dǎo)致隔離在轉(zhuǎn)化生物的葉綠體中的酶類(lèi)的產(chǎn)生。本披露還提供了一種藻類(lèi)細(xì)胞，并且具體地是用編碼多種不同酶類(lèi)的載體來(lái)轉(zhuǎn)化的柵藻或杜氏藻。對(duì)于ー些實(shí)施方案而言，可以使生物在缺乏光照和/或存在有機(jī)碳源下生長(zhǎng)。
仍然在另ー個(gè)方面提供了產(chǎn)生ー種或多種生物質(zhì)降解酶的柵藻或杜氏藻的基因修飾的葉綠體。這些酶類(lèi)可以是纖維素分解酶類(lèi)、半纖維素分解酶類(lèi)或木質(zhì)素分解酶類(lèi)，并且更具體地可以是外切-β -葡聚糖酶、內(nèi)切-β -葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、木聚糖內(nèi)切酶、木質(zhì)酶和/或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，該ー種或多種酶可以隔離在葉綠體中。本披露還提供了包含本披露的基因修飾葉綠體的光合生物。仍然在另ー個(gè)方面提供了ー種用于制備生物質(zhì)降解酶的方法。該方法包括以下步驟(I)轉(zhuǎn)化光合的、非維管生物并且具體地是柵藻或杜氏藻，以產(chǎn)生所述生物質(zhì)降解酶或使其產(chǎn)生增加，以及(2)從所述轉(zhuǎn)化生物中收集該生物質(zhì)降解酶。可以用包含多種不同的編碼不同生物質(zhì)降解酶類(lèi)的載體的組合物來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。還可以用編碼多種不同的生物質(zhì)降解酶類(lèi)的載體來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這些酶類(lèi)的任何ー種或全部能夠可操作地彼此連接。在ー些情況下，轉(zhuǎn)化了一種葉綠體。該方法可以具有ー個(gè)或多個(gè)另外的步驟，包括(a)收獲轉(zhuǎn)化的生物；(b)將轉(zhuǎn)化的生物干燥；(C)從細(xì)胞培養(yǎng)基中收獲酶類(lèi)；(d)機(jī)械破碎轉(zhuǎn)化的生物；或(e)化學(xué)破碎轉(zhuǎn)化的生物。該方法還可以包括通過(guò)高效液相色譜進(jìn)ー步純化酶。本披露的又另ー種方法允許制備ー種生物燃料。這種方法的一個(gè)步驟包括用從光合非維管生物獲得的ー種或多種生物質(zhì)降解酶來(lái)處理生物質(zhì)持續(xù)足夠的時(shí)間量，以降解所述生物質(zhì)的至少一部分。所產(chǎn)生的生物燃料可以是こ醇。這種方法的酶類(lèi)可以包含從中獲得它們的至少痕量的所述光合非維管生物。另外地，在本方法一些實(shí)施方案中有用的酶類(lèi)包括纖維素分解酶、半纖維素分解酶以及木質(zhì)素分解酶。在本方法ー些方面中有用的具體酶類(lèi)包括外切-葡聚糖酶、內(nèi)切-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖內(nèi)切酶、和/或木質(zhì)酶。可以用本披露的這種方法來(lái)處理多種類(lèi)型的生物質(zhì)，包括農(nóng)業(yè)廢物、造紙廠廢物、玉米秸桿、小麥秸桿、大豆秸桿、柳枝稷、浮萍、白楊樹(shù)、木屑、鋸屑、濕酒糟、干酒糟、人類(lèi)廢物、報(bào)紙、再循環(huán)紙產(chǎn)物、或人類(lèi)垃圾。還可以從高纖維素含量的生物(例如柳枝稷或浮萍)中獲得生物質(zhì)。可以從生物中釋放本方法中使用的一種或多種酶并且這種釋放可以涉及化學(xué)或機(jī)械破碎該生物的細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，ー種或多種酶是從生物中選擇的并且然后從培養(yǎng)基中收集的。處理生物質(zhì)可以涉及ー種發(fā)酵過(guò)程，該過(guò)程可以使用與產(chǎn)生該一種或多種酶的生物不同的ー種微生物。在一些實(shí)例中，可以將非維管光合生物加入糖化罐中。本實(shí)施方案還可以包括收集生物燃料的步驟?？梢酝ㄟ^(guò)蒸餾進(jìn)行收集。在一些實(shí)例中，將該生物燃料與另ー種燃料混合。ー種另外的方法提供為通過(guò)轉(zhuǎn)化葉綠體來(lái)制造至少ー種生物質(zhì)降解酶，從而制造了ー種生物質(zhì)降解酶。該生物質(zhì)降解酶可以是ー種纖維素分解酶、半纖維素分解酶、或木質(zhì)素分解酶，并且更具體地可以是外切-葡聚糖酶、內(nèi)切-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖內(nèi)切酶、或木質(zhì)酶。在一些情況下，該生物質(zhì)降解酶被隔離在轉(zhuǎn)化的葉綠體中。該方法可以進(jìn)一歩包括通過(guò)化學(xué)或機(jī)械手段破碎轉(zhuǎn)化的葉綠體來(lái)釋放ー種或多種生物質(zhì)降解酶。在一些情況下，將通過(guò)轉(zhuǎn)化葉綠體來(lái)產(chǎn)生多種酶。這些生物質(zhì)降解酶可以真菌或細(xì)菌起源的，例如外切-β -葡聚糖酶、內(nèi)切-β -葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、木聚糖內(nèi)切酶、木質(zhì)酶、或它們的組合。
可以用編碼ー種或多種酶的多個(gè)基因轉(zhuǎn)化ー些宿主細(xì)胞。例如，單個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以含有編碼整個(gè)生物降解途徑的外源核酸。ー個(gè)途徑的實(shí)例可以包括編碼外切-β -葡聚糖酶(作用于纖維素末端鏈上)、內(nèi)切-β -葡聚糖酶(作用于纖維素鏈內(nèi)部部分上)、β -葡糖苷酶(通過(guò)/降解纖維ニ糖避免反應(yīng)抑制劑)、以及木聚糖內(nèi)切酶(作用于半纖維素交聯(lián)上)的基因。用整個(gè)途徑轉(zhuǎn)化的這些細(xì)胞和/或從它們中提取的酶可以降解生物質(zhì)的某些組分。構(gòu)建體可以包括同一基因的多個(gè)拷貝、和/或編碼來(lái)自不同生物的相同酶的多基因、和/或具有在編碼序列的ー個(gè)或多個(gè)部分中的突變的多基因?？商娲?地，可以通過(guò)用該途徑的単獨(dú)的酶轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并且然后結(jié)合產(chǎn)生這些單獨(dú)的酶的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生生物質(zhì)降解途徑。這種方法允許通過(guò)改變多個(gè)轉(zhuǎn)化菌株的相對(duì)比率來(lái)結(jié)合這些酶從而更特定地匹配感興趣的生物質(zhì)。例如，可以將兩倍的表達(dá)ー個(gè)途徑的第一酶的細(xì)胞添加到混合物中，其中該反應(yīng)途徑的第一步驟是限制步驟。在用編碼酶的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化之后，使宿主細(xì)胞和/或生物生長(zhǎng)?？梢詮倪@些生物/細(xì)胞中收集生物質(zhì)降解酶。收集可以是通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何手段，包括但不限于濃縮細(xì)胞、機(jī)械或化學(xué)破碎細(xì)胞、以及從細(xì)胞培養(yǎng)物中和/或細(xì)胞溶解產(chǎn)物中純化這些酶?？梢允辜?xì)胞和/或生物生長(zhǎng)并且然后通過(guò)任何手段來(lái)收集ー種或多種酶。提取酶的ー種方法是通過(guò)收集該宿主細(xì)胞或ー個(gè)宿主細(xì)胞群并且然后將該ー個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞干燥。然后通過(guò)破碎細(xì)胞以暴露出酶，從干燥的ー個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞中收獲該一種或多種酶。然后使用壓碎細(xì)胞的全部產(chǎn)物來(lái)降解生物質(zhì)。從完整細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)的許多方法是本領(lǐng)域熟知的，并且也被考慮在此(例如，引入外源核酸構(gòu)建體，其中酶編碼序列可操作地連接到編碼分泌信號(hào)的序列上-從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離分泌的酶)。還可以通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)包含編碼生物質(zhì)產(chǎn)生-調(diào)節(jié)分子的核酸的載體來(lái)實(shí)現(xiàn)提取和使用生物質(zhì)降解酶。在這個(gè)實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞產(chǎn)生生物質(zhì)，并且還產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶。然后該生物質(zhì)降解酶可以降解由該宿主細(xì)胞產(chǎn)生的生物質(zhì)。在一些情況下，用于產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶的載體可以不是持續(xù)活性的。這些載體可以包括一種或多種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及ー種或多種生物質(zhì)降解酶類(lèi)。這些啟動(dòng)子激活了生物質(zhì)降解酶類(lèi)的產(chǎn)生，例如在生物質(zhì)已經(jīng)生長(zhǎng)到足夠密度或達(dá)到一定的成熟度之后。還可以通過(guò)將重組核酸分子引入到葉綠體中來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，其中該重組核酸分子包括ー個(gè)第一多核苷酸，該多核苷酸編碼至少一種多肽(即，1、2、3、4、或更多種)。在一些實(shí)施方案中，多肽可操作地連接到ー個(gè)第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或隨后的多肽上。例如，可以直接地或者間接地連接生物降解途徑中的數(shù)種酶，這樣使得通過(guò)該途徑中的一種酶產(chǎn)生的產(chǎn)物一旦產(chǎn)生，就緊密接近該途徑中的下ー個(gè)酶。另ー個(gè)方面提供了在此披露的已經(jīng)被基因修飾或改性的(例如通過(guò)在此披露的方法)用作原料的宿主生物或細(xì)胞(例如柵藻或杜氏藻)。在此披露的基因修飾藻類(lèi)的組合物可以直接地用作原料或可以添加到原料中用來(lái)產(chǎn)生修飾的或改進(jìn)的原料。例如，組合物可以包含原料和轉(zhuǎn)基因的藻類(lèi)。藻類(lèi)的基因修飾可以包括將藻類(lèi)工程化以表達(dá)一種或多種酶。在ー些方面，該酶可以是生物質(zhì)降解酶并且在ー些方面該酶可以是ー種生物合成酶?；蛐揎椀脑孱?lèi)還可以表達(dá)兩種類(lèi)型的酶(例如，生物質(zhì)降解酶和生物合成酶)。所表達(dá)的酶可以是在藻類(lèi)中天然表達(dá)的或在藻類(lèi)中非天然表達(dá)的ー種。在ー些方面，所產(chǎn)生的酶不是該藻類(lèi)中天然表達(dá)的。例如，ー種酶(例如生物質(zhì)降解酶)可以是ー種外源酶。在另ー個(gè)實(shí)例中，組合物可以包括ー種原料和ー種基因修飾的藻類(lèi)，其中該藻類(lèi)被修飾以増加天然發(fā)生酶(例如生物質(zhì)降解酶)的表達(dá)。在ー些方面，ー種酶可以從基因修飾的藻類(lèi)中分泌或作為獨(dú)立成分添加到原料中。生物質(zhì)降解酶類(lèi)可以通過(guò)將原料的復(fù)雜組分(例如不消化的組分)分解成可以被動(dòng)物吸收和使用的組分來(lái)改善現(xiàn)有原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。生物質(zhì)降解酶可以在藻類(lèi)中表達(dá)和保留或從藻類(lèi)中分泌或排出(即離體產(chǎn)生的)。對(duì)于藻類(lèi)的內(nèi)在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而言，提供生物質(zhì)降解酶類(lèi)的基因修飾的藻類(lèi)還可以被動(dòng)物利用。例如，組合物可以包含ー種原料、ー種基因修飾的藻類(lèi)、以及對(duì)于該基因修飾的藻類(lèi)而言是離體的ー種生物質(zhì)降解酶。在另一個(gè)實(shí)例中，ー種基因修飾的轉(zhuǎn)基因藻類(lèi)被修飾，以增加天然發(fā)生的生物質(zhì)降解酶的表達(dá)。藻類(lèi)中的某些外源生物合成酶類(lèi)的表達(dá)可以允許富含營(yíng)養(yǎng)物的脂質(zhì)、脂肪酸類(lèi)以及碳水化合物類(lèi)的生物合成?？梢詫⒈磉_(dá)這類(lèi)富含營(yíng)養(yǎng)物的組分的基因修飾的藻類(lèi)添加到現(xiàn)有的原料中，以補(bǔ)充該原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在ー些方面，這類(lèi)基因修飾的藻類(lèi)可以包括多達(dá)100%的原料。藻類(lèi)可以通過(guò)基因修飾來(lái)產(chǎn)生ー種或多種脂肪酸、脂質(zhì)或碳?xì)浠衔锘蚴蛊洚a(chǎn)生增加。在一個(gè)實(shí)例中，基因修飾的藻類(lèi)包括編碼類(lèi)異戊ニ烯生物合成途徑中的ー種酶的外源核酸。在ー些方面，與相同種類(lèi)的未修飾的藻類(lèi)相比較，基因修飾的藻類(lèi)可以具有較高含量、或改變含量、或不同含量的例如脂肪酸、脂質(zhì)或碳?xì)浠衔?例如類(lèi)異戊ニ烯)。例如，修飾的藻類(lèi)可以產(chǎn)生更多所希望的類(lèi)異戊ニ烯，和/或產(chǎn)生該藻類(lèi)通常不產(chǎn)生的類(lèi)異戊ニ烯，和/或產(chǎn)生通常產(chǎn)生但是以與未修飾的藻類(lèi)中產(chǎn)生的不同量的類(lèi)異戊ニ烯。因此，一方面，組合物可以包括ー種原料和ー種基因修飾的藻類(lèi)，其中相對(duì)于相同種類(lèi)的未修飾的藻類(lèi)，該藻類(lèi)具有較高的脂質(zhì)、脂肪酸、或類(lèi)異戊ニ烯含量。生物合成酶類(lèi)還可以是在甲羥戊酸途徑中發(fā)現(xiàn)的那些。例如，該酶可以是法尼基焦磷酸合成酶、物牛兒基櫳牛兒基磷酸合成酶、角鯊烯合成酶、硫酯酶、或脂肪酰CoA脫飽和酶。一種改進(jìn)的原料可以完全地或部分地由ー種基因修飾的藻類(lèi)組成。在ー些方面，可以將基因修飾的藻類(lèi)添加到組合物中來(lái)產(chǎn)生改進(jìn)的原料。直到添加基因修飾的藻類(lèi)之后，該組合物才可以被認(rèn)為是適合于被動(dòng)物消費(fèi)的原料。在ー些方面，可以將基因修飾的藻類(lèi)添加到現(xiàn)有原料中來(lái)產(chǎn)生改進(jìn)的原料。在ー些方面，可以將基因修飾的藻類(lèi)以至少比率I 20(藻類(lèi)重量/原料重量)添加到現(xiàn)有原料中。在ー些方面，改進(jìn)的原料可以包括高達(dá)10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^ 100%的基因修飾的藻類(lèi)。在ー些方面，可以將有活力的基因修飾的藻類(lèi)以小于原料5% (w/w)的濃度添加到原料中(例如，作為種子培養(yǎng))，其中基因修飾的藻類(lèi)繁殖到變成高達(dá)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%的原料(w/w)。原料或改進(jìn)的原料還可以包括另外的營(yíng)養(yǎng)物、成分或補(bǔ)充物(例如維生素)。包含基因修飾的藻類(lèi)的改進(jìn)原料還可以包含動(dòng)物飼料的任何常規(guī)成分，包括但不限于任何蔬菜、任何植物的果實(shí)、種子、根、花、葉、莖、桿、或植物 產(chǎn)物。包括基因修飾的藻類(lèi)的改進(jìn)原料還可以包括任何動(dòng)物部分或產(chǎn)物(例如，肉、骨、乳、排泄物、皮膚)。包括基因修飾的NVPO的改進(jìn)原料還可以包括制造過(guò)程的任何產(chǎn)物或副產(chǎn)物(例如鋸屑或啤酒廠廢物)。如在此披露的原料或改進(jìn)原料成分的另外的非限制性實(shí)例包括苜蓿、大麥、血粉、草、豆類(lèi)、青貯飼料、甜菜、骨粉、啤酒糟、啤酒酵母、金雀花草(tooomgrass)、胡蘿卜、牛糞、三葉苜蓿、咖啡、玉米、玉米蛋白粉、酒糟、禽脂、葡萄、玉米糝渣、啤酒花葉、廢啤酒花、糖蜜、燕麥、藻類(lèi)、花生、馬鈴薯、家禽廢物、家禽糞便、菜籽柏、黒麥、紅花、高梁、大豆、黃豆、向日葵粉、提摩西草、或小黒麥。因此，一方面一種組合物可以包括ー種原料和ー種基因修飾的NVPO，其中該原料包括苜蓿、大麥、血粉、草、豆類(lèi)、青貯飼料、甜菜、骨粉、啤酒糟、啤酒酵母、金雀花草、胡蘿卜、牛糞、三葉苜蓿、咖啡、玉米、玉米蛋白粉、酒糟、禽月旨、葡萄、玉米糝渣、啤酒花葉、廢啤酒花、糖蜜、燕麥、藻類(lèi)、花生、馬鈴薯、家禽廢物、家禽糞便、菜籽柏、黒麥、紅花、高梁、大豆、黃豆、向日葵粉、提摩西草、或小黒麥中的ー種或多種。在ー些方面，基因修飾的藻類(lèi)可以用于ー個(gè)目的(例如生產(chǎn)重組產(chǎn)物或生物燃料中)并且它的剰余部分可以用于改進(jìn)的原料。因此ー種改進(jìn)的原料可以包括基因修飾的藻類(lèi)的一部分。例如，動(dòng)物飼料成分的組合物可以包括整個(gè)和/或脫脂藻類(lèi)(例如，在去除脂肪酸、脂質(zhì)或碳?xì)浠衔镏螅缭诩和樘崛≈?或整個(gè)和脫脂藻類(lèi)的混合物，它提供了飼料酶和藻類(lèi)的內(nèi)在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值兩者。在另ー個(gè)實(shí)例中，基因修飾的藻類(lèi)可以被洗滌、脫水、離心、過(guò)濾、脫脂、溶解、干燥、加工(例如萃取)、或研磨。其剰余部分可以用作原料，用作改進(jìn)的原料或用作改進(jìn)原料的補(bǔ)充物。例如，一種組合物可以包含ー種原料和ー種基因修飾的藻類(lèi)的一部分，其中該基因修飾的藻類(lèi)至少部分地去除了脂質(zhì)、脂肪酸、類(lèi)異戊ニ烯、類(lèi)胡蘿卜素、碳水化合物、或選擇的蛋白質(zhì)。該基因修飾的藻類(lèi)還可以被基因修飾以產(chǎn)生如在此披露的生物質(zhì)降解酶。 在此還披露了產(chǎn)生、修飾、補(bǔ)充或改進(jìn)原料組合物的方法。這些方法可以包括將ー種基因修飾的藻類(lèi)或其一部分與ー種原料結(jié)合來(lái)產(chǎn)生改進(jìn)的原料。在一個(gè)實(shí)例中，該方法包括從基因修飾的藻類(lèi)中去除脂質(zhì)、脂肪酸、類(lèi)異戊ニ烯、或碳水化合物。可以將剩余的基因修飾的藻類(lèi)或其一部分與ー種原料結(jié)合來(lái)產(chǎn)生改進(jìn)的原料組合物。在本方法的ー個(gè)實(shí)例中，該修飾的藻類(lèi)不表達(dá)外源植酸酶。該基因修飾的藻類(lèi)或其一部分可以包括ー種核酸(例如一種外源核酸)。該核酸可以是ー種載體。在本方法的一個(gè)實(shí)例中，該核酸編碼ー種生物質(zhì)降解酶。該生物質(zhì)降解酶可以是ー種半乳聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶、糖酶、脂肪酶、還原酶、氧化酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或植酸酶。該生物質(zhì)降解酶可以是ー種糖酶，其中該糖酶是ー種α-淀粉酶、β_淀粉酶、內(nèi)切-β_葡聚糖酶、木聚糖內(nèi)切酶、β_甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、或支鏈淀粉酶。該生物質(zhì)降解酶可以是ー種蛋白酶，其中該蛋白酶是ー種枯草桿菌蛋白酶、菠蘿蛋白酶、或真菌酸穩(wěn)定蛋白酶。該生物質(zhì)降解酶可以是ー種植酸酶。在本方法的另ー個(gè)實(shí)例中，基因修飾的NVPO進(jìn)ー步包括編碼類(lèi)異戊ニ烯生物合成途徑中的ー種酶的外源核酸。在類(lèi)異戊ニ烯生物合成途徑中的酶可以是法尼基焦磷酸合成酶、物牛兒基櫳牛兒基磷酯酸合成酶、角鯊烯合成酶、硫酯酶、或脂肪酰CoA脫飽和酶。類(lèi)異戊ニ烯生物合成途徑中的酶可以是處于甲羥戊酸途徑中。在本方法的另ー個(gè)實(shí)例中，該方法可以進(jìn)ー步包括在與原料結(jié)合之前從基因修飾的NVPO中去除脂質(zhì)、脂肪酸、或類(lèi)異戊ニ烯以產(chǎn)生改進(jìn)的原料?？梢詮脑S多生物(包括真核生物、原核生物、或病毒)獲得用于動(dòng)物飼料中的用于指導(dǎo)這些蛋白質(zhì)(例如酶)在基因修飾的藻類(lèi)中表達(dá)的候選基因。在一些情況下，表達(dá)的酶是代謝途徑(例如類(lèi)異戊ニ烯生物合成途徑)的ー個(gè)成員?？梢詫?shù)種酶引入到藻類(lèi)中來(lái)產(chǎn)生增加水平的所希望的代謝產(chǎn)物，或可以將數(shù)種酶引入以產(chǎn)生包含多種有用飼料酶活性的藻類(lèi)(例如同時(shí)產(chǎn)生木聚糖酶、內(nèi)切-β -葡聚糖酶、以及植酸酶活性)。飼料酶類(lèi)可以被表達(dá)于宿主生物中(例如柵藻)并且純化到有用的水平。能夠以類(lèi)似于當(dāng)前實(shí)踐的方式將純化的酶類(lèi)加入動(dòng)物飼料中。飼料酶類(lèi)還可以表達(dá)于宿主生物中(例如藻類(lèi))并且生成的宿主生物可以作為飼料成分加入,對(duì)動(dòng)物飼料產(chǎn)物同時(shí)添加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和所希望的酶活性。在本申請(qǐng)中，可以將基因修飾的宿主生物以活的、整個(gè)的并且不能成活的或作為溶解產(chǎn)物添加到原料中，其中該宿主生物通過(guò)任何適合的手段而被溶解(例如，物理、化學(xué)或熱的手段)。許多動(dòng)物飼料可以含有植物種子，除了別的之外包括大豆、玉米、小麥、以及大麥。植物種子可以含有高水平的肌醇多磷酸酯(植酸)。這種植酸對(duì)于非反芻動(dòng)物是不可消化的，因此具有高水平植酸的飼料可以具有低水平的生物可利用的磷。植酸還可以螯合多種重要的營(yíng)養(yǎng)礦物質(zhì)，如鈣和鎂。將植酸酶結(jié)合到飼料中(它可以在動(dòng)物上部腸中起作用)可以釋放螯合的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素以及顯著水平的生物可利用的磷兩者。凈結(jié)果是需要將較少的游離磷加入到動(dòng)物飼料產(chǎn)物中。此外，可以降低排泄物中的磷水平，從而可能降低下游磷污染。可以將表達(dá)植酸酶或類(lèi)似酶的基因修飾的藻類(lèi)添加到原料中，以改進(jìn)飼料營(yíng)養(yǎng)特性或可消化特性?？紤]在此使用的植酸酶可以來(lái)自任何生物(例如從細(xì)菌或真菌衍生的)。 考慮在此使用的植酸酶類(lèi)型的非限制性實(shí)例包括3-植酸酶(又名I-植酸酶；一種肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3. I. 3. 8)、4_植酸酶(又名6-植酸酶，基于IL-編號(hào)系統(tǒng)并且不是基于ID-編號(hào)命名，EC3. 1.3. 26)、以及5-植酸酶(EC 3.1.3.72)。另外的植酸酶的非限制性實(shí)例包括微生物植酸酶，如真菌、酵母或細(xì)菌植酸酶，如EP 684313、US 6139902、EP 420358、WO 97/35017、WO 98/28408、WO 98/28409、JP 11000164、W098/13480、AU724094、WO 97/33976、US 6110719、WO 2006/038062、WO 2006/038128、WO 2004/085638、WO 2006/037328、WO 2006/037327、WO 2006/043178、US 5830732 以及在 UniProt 指定下的 P34753、P34752、P34755、000093、031097、P42094,066037 和 P34754(UniProt, (2008)http://www. uniprot. ovr/)中披露的。與上述任何一種植酸酶的氨基酸序列(包括活性位點(diǎn))具有至少75%—致性的氨基酸序列的多肽也被考慮在此使用。在一個(gè)實(shí)例中，組合物可以包含ー種原料和ー種基因修飾的藻類(lèi)。該基因修飾的藻類(lèi)可以進(jìn)行基因修飾，以產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶，如植酸酶。一方面，該植酸酶是ー種細(xì)菌或真菌起源的植酸酶。一方面，該生物質(zhì)降解酶是ー種與植酸酶不同的酶。來(lái)自植物(例如像大豆、小麥、以及大麥)的許多植物部分(例如，種子、果實(shí)、莖、根、葉和花)包含某些動(dòng)物(例如非反芻動(dòng)物)不能消化的多糖。這類(lèi)碳水化合物的非限制性實(shí)例包括木聚糖、棉子糖、水蘇糖、以及葡聚糖。動(dòng)物飼料中不可消化的碳水化合物的存在可能降低營(yíng)養(yǎng)物的利用率。在禽飼料中的不可消化的碳水化合物可能導(dǎo)致粘性糞便(可能增加疾病水平)。在動(dòng)物飼料中的一種或多種碳水化合物降解酶(例如α-淀粉酶)的存在可能幫助降解多糖，増加了營(yíng)養(yǎng)物利用率，増加了動(dòng)物飼料的生物可利用能含量，以及降低健康風(fēng)險(xiǎn)?？紤]在此使用的碳水化合物降解酶類(lèi)的非限制實(shí)例包括淀粉酶類(lèi)(例如，α -淀粉酶和β -淀粉酶)、β -甘露聚糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶、β -葡聚糖酶、內(nèi)切-β -葡聚糖酶、葡萄糖異構(gòu)酶、木聚糖內(nèi)切酶、α -半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、支鏈淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶以及細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的任何碳水化合物消化酶。在一個(gè)實(shí)例中，組合物可以包含ー種原料和ー種基因修飾的藻類(lèi)。該基因修飾的藻類(lèi)可以進(jìn)行基因修飾，以產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶，如糖酶。一方面，該糖酶可以是ー種α -淀粉酶、β-淀粉酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、木聚糖內(nèi)切酶、β_甘露聚糖酶、α -半乳糖苷酶、或支鏈淀粉酶。許多原料包含具有減少動(dòng)物飼料中營(yíng)養(yǎng)物利用率的抗?fàn)I養(yǎng)蛋白(例如，蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑以及其他物質(zhì))的植物部分(例如種子)。添加廣譜蛋白酶(例如菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、或真菌酸穩(wěn)定的蛋白酶)可以分解這些抗?fàn)I養(yǎng)蛋白并且增加動(dòng)物飼料中的營(yíng)養(yǎng)物的利用率?？紤]在此使用的蛋白酶的非限制性實(shí)例包括內(nèi)肽酶和外肽酶?？紤]在此使用的蛋白酶的非限制性實(shí)例包括絲氨酸蛋白酶類(lèi)(例如枯草桿菌蛋白酶、糜蛋白酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、ニ肽基肽酶、羧肽酶、ニ肽酶、以及氨基肽酶)、半胱氨酸蛋白酶類(lèi)(例如，木瓜蛋白酶、鈣蛋白酶_2、以及木瓜蛋白酶樣肽酶和菠蘿蛋白酶)、天冬氨酸肽酶類(lèi)(例如，胃蛋白酶和胃蛋白酶Α)、谷氨酸蛋白酶類(lèi)、蘇氨酸蛋白酶類(lèi)、真菌酸性蛋白酶類(lèi)以及酸穩(wěn)定蛋白酶類(lèi)，如(US 6855548)中披露的那些。在一個(gè)實(shí)例中，組合物可以包含ー種原料和ー種基因修飾的藻類(lèi)。該基因修飾的藻類(lèi)可以進(jìn)行基因修飾，以產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶，如蛋白酶。一方面，該蛋白酶可以是ー種枯草桿菌蛋白酶、菠蘿蛋白酶、或真菌酸穩(wěn)定性蛋白酶。考慮在此使用的脂肪酶的非限制性實(shí)例包括胰脂肪酶、溶酶體脂肪酶、溶酶體酸性脂肪酶、酸性膽固醇酯水解酶、肝酯酶、脂蛋白脂肪酶、胃脂肪酶、內(nèi)皮脂肪酶、胰脂肪酶相關(guān)蛋白2、胰脂肪酶相關(guān)蛋白I、舌脂肪酶和磷脂酶(例如磷脂酶Al (EC 3. I. I. 32)、磷脂酶Α2、磷脂酶B (溶血磷脂酶)、磷脂酶C和磷脂酶D)?？梢酝ㄟ^(guò)使ー種原料與ー種藻類(lèi)結(jié)合來(lái)產(chǎn)生改進(jìn)的原料，該藻類(lèi)被基因改變以產(chǎn)生ー種酶(例如，糖酶、蛋白酶或脂肪酶)。在ー些方面，該酶是針對(duì)該生物離體地產(chǎn)生的。在ー些方面，該酶被分泌。在被動(dòng)物攝食之前，相對(duì)于生物離體產(chǎn)生的酶可以分解原料的組分。因此，可以通過(guò)使ー種原料與一種藻類(lèi)結(jié)合并且使該混合物經(jīng)歷保持時(shí)間來(lái)產(chǎn)生改進(jìn)的原料，該藻類(lèi)被基因改變以產(chǎn)生ー種酶(例如，糖酶、蛋白酶或脂肪酶)。保持時(shí)間可以允許該基因改變的藻類(lèi)繁殖并且將更多的酶分泌到原料中。保持時(shí)間可以是從數(shù)小時(shí)一直到數(shù)天。在ー些方面，保持時(shí)間是持續(xù)一直到1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在ー些方面，保存使其是持續(xù)一直到數(shù)天至數(shù)周。在ー些方面，保持時(shí)間是無(wú)定期的。無(wú)定期的保持時(shí)間允許間歇地去除和使用改進(jìn)的原料并且間歇地添加基礎(chǔ)原料。宿主細(xì)胞或宿主牛物可以從宿主細(xì)胞或宿主生物中獲得在在此所述的方法和系統(tǒng)中有用的生物質(zhì)。宿主細(xì)胞可以含有編碼本披露的多肽的ー種多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是多細(xì)胞生物的一部分。在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞作為單細(xì)胞生物培養(yǎng)。宿主生物可以包括任何適當(dāng)?shù)乃拗?，例如ー種微生物。用于在此所述方法的微生物包括例如光合細(xì)菌(例如，藍(lán)細(xì)菌)、非光合細(xì)菌(例如，大腸桿菌)、酵母(例如，釀酒酵母)、以及藻類(lèi)(例如，微藻，如萊茵衣藻)。 可以用感興趣的多核苷酸(例如，編碼涉及類(lèi)異戊ニ烯生物合成路徑的蛋白質(zhì)的多核苷酸)轉(zhuǎn)化的宿主生物的實(shí)例包括維管和非維管生物。該生物可以是原核的或真核的。該生物可以是單細(xì)胞的或多細(xì)胞的。宿主生物是包括宿主細(xì)胞的ー種生物。在其他實(shí)施方案中，該宿主生物是光合性的。光合生物是天然地光合成的生物(例如藻類(lèi))或被基因工程化或以別的方式被修飾成光合性的生物。在一些情況下，可以用使光合生物機(jī)構(gòu)(photosynthetic apparatus)的全部或部分不可操作的本披露的構(gòu)建體或載體來(lái)轉(zhuǎn)化光合生 物。作為舉例，可以將非維管光合微藻種類(lèi)(例如萊茵衣藻、海洋微綠球藻、鹽生微綠球藻、鹽生杜氏藻、雨生紅球藻、二形柵藻、緑色杜氏藻、小球藻、以及杜氏鹽藻)基因工程化，以生產(chǎn)感興趣的多肽，例如ー種殼梭孢菌素ニ烯合成酶或ー種FPP合成酶。通過(guò)將這些微藻工程化以在藻類(lèi)葉綠體或細(xì)胞核中表達(dá)殼梭孢菌素ニ烯合成酶或FPP合成酶，可以實(shí)現(xiàn)在這些微藻中產(chǎn)生殼梭孢菌素ニ烯合成酶或FPP合成酶。在其他實(shí)施方案中，該宿主生物是ー種維管植物。這類(lèi)植物的非限制性實(shí)例包括多種單子葉植物和雙子葉植物，包括高油種子植物例如高油種子蕓苔屬(例如，黑芥、歐洲油菜、白芥、蕪青、白菜型油菜、埃塞俄比亞芥、以及芥菜型油菜)、黃豆(Glycine max)、盧淋+ (Ricinus communisノ、ネ吊花、紅花(Carthamus tinctorius)、向日葵(Helianthusannuus)、亞評(píng)木(Linum usitatissimum)、玉米(Zea mays)、挪子(Cocos nuciferaノ、ネ示櫚(Elaeis guineensis),油堅(jiān)果樹(shù)如橄欖(Olea europaea)、芝麻、和花生(Arachishypogaea)，以及擬南芥屬、煙草、小麥、大麥、燕麥、莧菜、馬鈴薯、水稻、番茄、以及豆類(lèi)(例如豌豆、菜豆、小扁豆、苜蓿等)。該宿主細(xì)胞可以是原核的。本披露的一些原核生物的實(shí)例包括但不限于藍(lán)細(xì)菌(例如，聚球藻、集胞藻、旋藻、粘球藻、顫藻以及假魚(yú)腥藻)。適當(dāng)?shù)脑思?xì)胞包括但不限于任何以下多種實(shí)驗(yàn)室菌株大腸桿菌、乳酸菌、沙門(mén)菌、以及志賀菌。(例如，如Carrier等人(1992)《免疫學(xué)期刊》(J. Immunol.) 148 :1176-1181 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，447，784 ;以及 Sizemore等人(1995)《科學(xué)》(Science)270 :299-302中說(shuō)明的)?？梢杂糜诒九吨械纳抽T(mén)氏菌菌株的實(shí)例包括但不限于傷寒沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌。適合的志賀菌株包括但不限于弗氏志賀菌、索氏志賀菌、以及痢疾志賀菌。典型地，該實(shí)驗(yàn)室菌株是非致病性菌株。其他適合的細(xì)菌的非限制性實(shí)例包括但不限于惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、mevalonii假單胞菌(Pseudomonas mevalonii)、類(lèi)球紅細(xì)菌、莢膜紅細(xì)菌、深紅紅螺菌、以及紅球菌屬。在一些實(shí)施方案中，該宿主生物是真核的(例如，綠藻、紅藻、褐藻)。在一些實(shí)施方案中，該藻類(lèi)是ー種綠藻類(lèi)，例如一種綠藻(Chlorophycean)。該藻類(lèi)可以是單細(xì)胞的或多細(xì)胞的。適合的真核宿主細(xì)胞包括但不限于酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、以及藻類(lèi)細(xì)胞。適合的真核宿主細(xì)胞包括但不限干巴斯德畢赤酵母、芬蘭畢赤酵母、喜海藻糖畢赤酵母、Pichia koclamae、膜醭畢赤酵母、Pichia opuntiae、耐熱畢赤酵母、柳畢赤酵母、松櫟畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮杰普畢赤酵母、樹(shù)干畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、斯巴達(dá)克畢赤酵母、釀酒酵母、酵母菌屬、多形漢遜酵母、克魯維酵母屬、乳酸克魯維酵母、白色念珠菌、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、錸孢霉屬、禾谷錸孢菌、鑲片錸孢菌(Fusarium venenatum)、粗糙脈孢菌、以及萊茵衣藻。在其他實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞是微藻類(lèi)(例如萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、雨生紅球藻、海洋微綠球藻、鹽生微綠球藻、二形柵藻、小球藻、緑色杜氏藻、或杜氏鹽藻)。在一些情況下，該生物是紅藻、綠藻、不等長(zhǎng)鞭毛藻(heterokontophyte)、黃綠藻(tribophyte)、灰藻(,glaucophyte)、chloraracnniophyte> 眼蟲(chóng)藻(euglenoid)、定鞭藻(haptophyte)、隱藻(cryptomonad)、雙鞭藻(dinof Iagellum)、或浮游微藻(pnytopiankton)。在一些情況下，宿主生物是維管和光合性的。維管植物的實(shí)例包括但不限于被子植物、裸子植物、紅藻門(mén)植物、或其他維管植物。在一些情況下，宿主生物是非維管性和光合性的。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)“非維管光合生物”是指任何宏觀或微觀生物，其包括但不限于藻類(lèi)、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌，其不具有如在維管植物中發(fā)現(xiàn)的維管系統(tǒng)。非維管光合生物的實(shí)例包括苔蘚，例如地錢(qián)門(mén)植物(marchantiophyte)或角苔門(mén)植物(anthocerotophyte)。在一些情況下，該生物是一種藍(lán)細(xì)菌。在一些情況下，該生物是藻類(lèi)(例如巨藻或微藻)。該藻類(lèi)可以是單細(xì)胞或多細(xì)胞藻類(lèi)。例如，可以用一種載體或它的一個(gè)線性部分轉(zhuǎn)化微藻萊茵衣藻，從而編碼一種或多種感興趣的蛋白質(zhì)(例如一種涉及類(lèi)異戊二烯生物合成途徑的蛋白質(zhì))。藻類(lèi)轉(zhuǎn)化的方法在美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/142，091中進(jìn)行了說(shuō)明。本披露的方法可以使用藻類(lèi)例如微藻萊茵衣藻來(lái)進(jìn)行。根據(jù)本披露的方法使用微藻來(lái)表達(dá)肽或蛋白復(fù)合物提供的優(yōu)點(diǎn)是，可以使大量微藻生長(zhǎng)(包括商業(yè)上的(Cyanotech公司；Kailua_KonaHI))，因此允許生產(chǎn)并且如果希望的話分離大量的所希望的產(chǎn)物。 本披露的載體也許能夠穩(wěn)定地或瞬時(shí)地轉(zhuǎn)化多種光合生物，包括但不限于光合細(xì)菌(包括藍(lán)細(xì)菌)、藍(lán)藻門(mén)、原綠藻門(mén)、紅藻門(mén)、綠藻門(mén)、不等鞭毛門(mén)、黃綠藻植物門(mén)(tribophyta)、灰色藻門(mén)(glaucophyta)、chlorarachniophytes、裸藻門(mén)、眼蟲(chóng)藻、定鞭藻門(mén)、金藻門(mén)、隱藻門(mén)、隱藻、甲藻門(mén)、雙鞭藻門(mén)、定鞭金藻門(mén)(pyrmnesiophyta)、硅藻門(mén)、黃藻門(mén)、黃綠藻門(mén)(eustigmatophyta)、針胞藻門(mén)(raphidophyta)、褐藻門(mén)、以及浮游植物。本披露的其他載體能夠穩(wěn)定地或瞬時(shí)地轉(zhuǎn)化例如萊茵衣藻、海洋微綠球藻、鹽生微綠球藻、鹽生杜氏藻、雨生紅球藻、二形柵藻、綠色杜氏藻、或杜氏鹽藻。適當(dāng)宿主的實(shí)例包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門(mén)菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲(chóng)細(xì)胞，如果蠅S2和夜蛾Sf9 ;動(dòng)物細(xì)胞，如CH0、C0S或Bowes黑色素瘤；腺病毒類(lèi)；以及植物細(xì)胞類(lèi)。適當(dāng)宿主的選擇被認(rèn)為是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的了解范圍內(nèi)。將如在此說(shuō)明的選擇和分離的多核苷酸引入到適合的宿主細(xì)胞內(nèi)。適合的宿主細(xì)胞是能夠促進(jìn)重組和/或還原性再分布(reductive reassortment)的任何細(xì)胞。選擇的多核苷酸可以是例如在包括適當(dāng)控制序列的載體中。宿主細(xì)胞可以是例如一種高等真核細(xì)胞，如一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，或該宿主細(xì)胞可以是一種原核細(xì)胞如一種細(xì)菌細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔來(lái)進(jìn)行將構(gòu)建體(載體)引入宿主細(xì)胞中。重組多肽(包括蛋白復(fù)合物)可以表達(dá)于植物中，允許生產(chǎn)這類(lèi)植物作物并且因此能夠方便地生產(chǎn)大量的所希望的產(chǎn)物。因此，可以使用任何植物來(lái)實(shí)踐本披露的方法，包括例如微藻和巨藻(例如海藻和海草)以及在土壤中生長(zhǎng)的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞是一種植物。術(shù)語(yǔ)“植物”在此廣泛地用來(lái)指含有質(zhì)體(如葉綠體)的一種真核生物，并且包括處于發(fā)育任何階段的任何這類(lèi)生物、或指植物的一部分，包括植物插條、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)物、植物器官、植物種子、以及小植株。植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以處于分離的單細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞的形式，或可以是高等組織單位的一部分，例如植物組織、植物器官、或植物。因此，植物細(xì)胞可以是一種原生質(zhì)體、配子產(chǎn)生細(xì)胞、或再生成全植物的一個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞集合。像這樣，包括多個(gè)植物細(xì)胞并且能夠再生成全植物的種子被認(rèn)為是用于本披露目的的植物細(xì)胞。植物組織或植物器官可以是種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、或組織成結(jié)構(gòu)或功能單位的任何其他植物細(xì)胞群。特別有用的植物部分包括可收獲部分以及用于繁殖子代植物的部分。植物的可收獲部分可以是植物的任何有用部分，例如花、花粉、幼苗、塊莖、葉、莖、果實(shí)、種子、以及根。用于繁殖的植物的一個(gè)部分包括例如種子、果實(shí)、插條、幼苗、塊莖、以及根莖。本披露的方法可以產(chǎn)生含有基因組DNA(例如，核和/或質(zhì)體基因組DNA)的植物，該植物被基因修飾以含有穩(wěn)定整合的多核苷酸(例如，Hager和Bock，《應(yīng)用微生物生物技術(shù)》(Appl. Microbiol. Biotechnol.) 54 :302-310, 2000 中所說(shuō)明的)。因此，本披露進(jìn)一步提供了含有一個(gè)或多個(gè)葉綠體的一種轉(zhuǎn)基因植物例如萊茵衣藻，這個(gè)或這些葉綠體含有編碼一個(gè)或多個(gè)外源或內(nèi)源多肽(包括可以允許分泌燃料產(chǎn)物和/或燃料產(chǎn)物前體(例如，類(lèi)異戊二烯、脂肪酸、脂質(zhì)、甘油三酯)的多肽)的多核苷酸。本披露的光合生物包括被修飾成產(chǎn)生例如一種燃料產(chǎn)物或一種燃料產(chǎn)物前體的至少一種宿主細(xì)胞。
用于所披露的實(shí)施方案中的一些宿主生物是，例如極端微生物，如超嗜熱菌、嗜冷性細(xì)菌、低溫菌、嗜鹽微生物、嗜壓微生物以及嗜酸菌?？梢杂糜趯?shí)踐本披露的一些宿主生物是嗜鹽的(例如,鹽生杜氏藻、綠色杜氏藻、或杜氏鹽藻)。例如,鹽生杜氏藻可以生長(zhǎng)在海水和鹽湖(例如鹽度從千分之30至千分之300)以及高鹽度培養(yǎng)基(例如人工海水培養(yǎng)基、海水營(yíng)養(yǎng)瓊脂、半咸水培養(yǎng)基、以及海水培養(yǎng)基)中。在本披露的一些實(shí)施方案中，表達(dá)本披露蛋白的宿主細(xì)胞可以生長(zhǎng)于液體環(huán)境中，該液體環(huán)境是例如0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2. 0、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3. 0、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4. 0、4. 1、4. 2、4. 3 摩爾或更高濃度的氯化鈉。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是其他鹽(鈉鹽、鈣鹽、鉀鹽、或其他鹽)也可以存在于這些液體環(huán)境中。當(dāng)嗜鹽生物用于本披露中時(shí)，可以用在此所述的任何載體將其轉(zhuǎn)化。例如，可以用能夠插入葉綠體或核基因組中的并且含有編碼一種蛋白質(zhì)(例如，一種FPP合成酶或一種殼梭孢菌素二烯合成酶)的核酸的載體轉(zhuǎn)化鹽生杜氏藻。然后可以使轉(zhuǎn)化的嗜鹽生物生長(zhǎng)于高鹽環(huán)境中(例如鹽湖、鹽池、以及高鹽培養(yǎng)基)以產(chǎn)生感興趣的產(chǎn)物(例如，脂質(zhì))。產(chǎn)物的分離可以涉及在從該生物中提取產(chǎn)物之前從高鹽環(huán)境中移出轉(zhuǎn)化的生物。在產(chǎn)物分泌到周?chē)h(huán)境中的情況下，在對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行任何進(jìn)一步處理之前，使該液體環(huán)境脫鹽可能是必需的。本披露進(jìn)一步提供了包括遺傳修飾的宿主細(xì)胞的組合物。組合物包括一種遺傳修飾的宿主細(xì)胞，并且在一些實(shí)施方案中可以包括一個(gè)或多個(gè)另外的組分，這些組分是部分基于預(yù)期使用遺傳修飾的宿主細(xì)胞而選擇的。適合的組分包括但不限于鹽類(lèi)、緩沖劑、穩(wěn)定齊U、蛋白酶抑制劑、細(xì)胞膜-和/或細(xì)胞壁-保護(hù)性化合物，例如甘油和二甲基亞砜、以及適合于該細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。為了生產(chǎn)蛋白質(zhì)，例如一種類(lèi)異戊二烯或類(lèi)異戊二烯前體化合物，宿主細(xì)胞可以是例如產(chǎn)生或已經(jīng)被基因修飾用來(lái)產(chǎn)生在異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶途徑和/或甲羥戊酸酯途徑和/或類(lèi)異戊二烯生物合成途徑中的一種或多種酶的一種細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是產(chǎn)生異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶、類(lèi)異戊二烯合成酶或甲羥戊酸酯途徑酶的底物的一種細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，基因修飾宿主細(xì)胞是包括內(nèi)源甲羥戊酸酯途徑和/或類(lèi)異戊二烯生物合成途徑和/或異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶途徑的一種宿主細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，基因修飾宿主細(xì)胞是這樣一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞在通常不經(jīng)由甲羥戊酸途徑產(chǎn)生甲羥戊酸酯，或經(jīng)由異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶途徑產(chǎn)生FPP、GPP或GGPP，但是已經(jīng)用包括編碼一個(gè)或多個(gè)甲羥戊酸途徑、類(lèi)異戊二烯合成酶途徑或異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶途徑的酶的核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸基因修飾(例如，如美國(guó)專(zhuān)利
發(fā)明者A·卡蘭, B·奧奈爾, K·博施, M·門(mén)德斯, S·塞卡, W·萊文 申請(qǐng)人:藍(lán)寶石能源公司