專利名稱：淡紫擬青霉的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種淡紫擬青霉的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus (Thom) samson 1974)是一種典型的土壤 及多種植物根系的習(xí)居菌，被認(rèn)為是最有前途的防治有害線蟲的天敵真菌之一。國際馬 鈴薯中心昆蟲系Jatala博士 1979年首次報道，淡紫擬青霉能夠有效防治南方根結(jié)線蟲 (Meloidogyne incognita)禾口白色球抱囊線蟲(Heterodera schachii),對南方牛艮結(jié)線蟲的 卵寄生率高達(dá)60% -70%。淡紫擬青霉菌極少在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，主要原因是缺乏廉價培養(yǎng)基和相應(yīng)的培養(yǎng) 技術(shù)。目前，國內(nèi)外對淡紫擬青霉仍然處于研究階段，主要目標(biāo)是篩選穩(wěn)定高效的生產(chǎn)菌 株、解決菌劑培養(yǎng)中的高成本低產(chǎn)率的技術(shù)瓶頸、研制穩(wěn)定高效的實(shí)用劑型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于培養(yǎng)淡紫擬青霉的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的固體培養(yǎng)基，由麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫 鉀、硫酸錳和水組成。上述固體培養(yǎng)基中，所述麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫 酸錳和水的配比為如下1)或2)或3)或4)所示1)麩皮(20kg_35kg)玉米(6Okg-I5Okg)甘蔗渣(3Okg-6Okg)椰糠 (10kg-40kg)蔗糖(15g-20g)硫酸銨(15g-20g)磷酸二氫鉀(8g_15g)硫酸錳 (0. 7g-2g)水(20L-50L)；2)麩皮(2Okg-35Iig)玉米(6Okg-IOOkg)甘蔗渣(3Okg-5Okg)椰糠 (10kg-30kg)蔗糖(15g-20g)硫酸銨(15g-18g)磷酸二氫鉀(8g_10g)硫酸錳 (0. 7g-2g)水(20L-40L)；3)麩皮(20kg_35kg)玉米(6Okg-7Okg)甘蔗渣(3Okg-5Okg)椰糠 (10kg-15kg)蔗糖(15g-16. 5g)硫酸銨(15g-18g)磷酸二氫鉀(8g_10g)硫酸錳 (0. 7g-lg)水(20L-35L)；4)麩皮30kg 玉米IOOkg 甘蔗渣60kg 椰糠30kg 蔗糖20g 硫酸銨20g 磷酸二氫鉀IOg 硫酸錳2g 水50L ；或，麩皮35kg 玉米150kg 甘蔗渣40kg 椰糠40kg 蔗糖20g 硫酸銨20g 磷酸二氫鉀15g 硫酸錳Ig 水40L ；或，麩皮30kg 玉米IOOkg 甘蔗渣60kg 椰糠30kg 蔗糖15g 硫酸銨15g 磷酸二氫鉀8g 硫酸錳0. 7g 水50L ；或，麩皮30kg 玉米IOOkg 甘蔗渣60kg 椰糠30kg 蔗糖20g 硫酸銨18g 磷酸二氫鉀IOg 硫酸錳Ig 水50L ；
或，麩皮35kg 玉米150kg 甘蔗渣40kg 椰糠40kg 蔗糖20g 硫酸銨20g 磷酸二氫鉀IOg 硫酸錳Ig 水40L ；或，麩皮20kg 玉米60kg 甘蔗渣30kg 椰糠IOkg 蔗糖15g 硫酸銨15g 磷酸二氫鉀IOg 硫酸錳Ig 水20L ；或，麩皮30kg 玉米70kg 甘蔗渣50kg 椰糠15kg 蔗糖16. 5g 硫酸銨 16. 5g 磷酸二氫鉀8. 5g 硫酸錳0. 7g 水35L。上述固體培養(yǎng)基中，所述麩皮為小麥的麩皮，所述玉米為玉米粉。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法，包括如下 步驟將淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)接種于上述任一所述固體培養(yǎng)基，固體培 養(yǎng)，將容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作固體培養(yǎng)物質(zhì)。 上述方法中，所述固體培養(yǎng)的條件為所述固體培養(yǎng)包括如下步驟在濕度為 30% -70%和溫度為24°C _26°C的條件下，培養(yǎng)2_3天；將所有固體培養(yǎng)物質(zhì)搗碎，再在濕 度為50% -70%、溫度為24°C _26°C的條件下，培養(yǎng)3_4天；上述方法中，所述固體培養(yǎng)中所用的容器為培養(yǎng)架；所述培養(yǎng)架為腔內(nèi)設(shè)有若干 尼龍紗網(wǎng)隔層的柱體；所述固體培養(yǎng)物質(zhì)位于所述尼龍紗網(wǎng)隔層上。上述方法中，所述固體培養(yǎng)在無菌條件下進(jìn)行。上述方法中，在所述固體培養(yǎng)前，包括如下種子培養(yǎng)的步驟將淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus)接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，將種子培養(yǎng)產(chǎn)物再進(jìn)行 所述固體培養(yǎng)；上述方法中，所述種子培養(yǎng)基由殼聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆餅粉、KH2PO4, MnSO4、醋 酸和水組成；所述殼聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆餅粉、KH2PO4, MnSO4、醋酸和水的配比為殼聚糖 20g 蔗糖 15g 蛋白胨 IOg 豆餅粉 15g KH2PO4 0. 5g MnSO4 0. 05g 醋酸 0. 5ml 水IL0上述方法中，所述種子培養(yǎng)的條件27°C _29°C搖床振蕩培養(yǎng)48_72小時，接種濃 度為IO5個孢子/ml。上述方法中，將種子培養(yǎng)產(chǎn)物再進(jìn)行所述固體培養(yǎng)中，接種量為20% -30% (體積 百分含量)，具體為20%、25%或30%。上述方法中，所述淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)為淡紫擬青霉 (Paecilomyceslilacinus)E7，保藏編號為 ACCC 32494。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用液體培養(yǎng)快速生長的大量菌絲體，轉(zhuǎn)接到固體營養(yǎng) 基質(zhì)上產(chǎn)生氣生分生孢子，從而縮短菌絲生長周期，提高產(chǎn)率，避免前期污染；其次，本發(fā)明 框架式培養(yǎng)室培養(yǎng)，生產(chǎn)工藝簡單，顯著減少了培養(yǎng)過程中的污染機(jī)率，縮短了發(fā)酵時間， 而且不需要復(fù)雜設(shè)備，對濕度的要求降低；第三，原料主要為農(nóng)副產(chǎn)品麩皮、玉米粉、甘蔗 渣、椰糠，來源廣泛、充足，成本低廉，易調(diào)控，成功率高；第四，在培養(yǎng)原料中添加部分甘蔗 渣和椰糠，不僅可以使農(nóng)業(yè)廢棄物得到有效利用，而且明顯改善了培養(yǎng)基的粘度、空隙率和 疏松度，培養(yǎng)過程中不用額外通氣。因此，本發(fā)明不僅對農(nóng)業(yè)廢棄物的利用、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持 續(xù)發(fā)展、保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面意義重大，而且有著切實(shí)的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所使用的菌株為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E7，分離自 線蟲土壤的淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)，購自于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理 中心(ACCC)，保藏編號為ACCC 32494。實(shí)施例1、1.斜面菌種固體斜面培養(yǎng)基馬鈴薯200g、蔗糖20g、蛋白胨10g、KH2PO4 0. 5g、MnSO4 0. 05g、 瓊脂18g、水1L。
將淡紫擬青霉菌接種于試管斜面培養(yǎng)基，在28°C傳代培養(yǎng)、活化，至斜面長滿淡紫 色孢子。2.種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成殼聚糖20g、蔗糖15g、蛋白胨10g、豆餅粉15g、KH2PO4 0. 5g、 MnSO4 0.05g、醋酸0.5ml，水1L。殼聚糖購自浙江金殼生物化學(xué)有限公司，產(chǎn)品目錄號 為K071113289，脫乙酰度為95% ；蛋白胨購自海南青鳥生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為 050170;豆餅粉購自農(nóng)貿(mào)市場。每個250ml三角瓶中放入60ml種子培養(yǎng)基，121°C蒸汽滅菌20分鐘。從固體斜面中挑出一小塊菌苔，用種子培養(yǎng)基配置分生孢子懸浮液，再將分生孢 子懸浮液接入250ml三角瓶，初始濃度為IO5個/ml，一只斜面可接6_8個瓶子；在27°C搖 床振蕩培養(yǎng)48小時，至長成淡紫色粘稠菌絲體。3、固體培養(yǎng)培養(yǎng)架腔內(nèi)具有尼龍紗網(wǎng)隔層的四立柱架子，長3. 5m、寬0. 6m、高2. 5m，用尼龍 紗網(wǎng)隔成6層結(jié)構(gòu)，層間距30cm，四立柱材質(zhì)是碳鋼噴塑。a.固體培養(yǎng)基小麥麩皮20kg，玉米粉60kg、甘蔗渣30kg、椰糠10kg、蔗糖15g、硫 酸銨15g、磷酸二氫鉀10g、硫酸錳lg、自來水20L。配制方法先用水將硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸錳溶解，攪拌均勻，pH自然，121°C 高壓蒸汽滅菌60分鐘。再將其與其余物質(zhì)混勻。b.接種按20% (體積百分比)接種量，將種子培養(yǎng)的產(chǎn)物倒入固體培養(yǎng)基中，攪 拌均勻，置于培養(yǎng)架的尼龍紗網(wǎng)上，一起置于發(fā)酵室內(nèi)(發(fā)酵室預(yù)先消毒)；c.培養(yǎng)方法在溫度24°C、發(fā)酵室內(nèi)濕度30% (體積百分含量)和密閉條件下培 養(yǎng)2天，至長滿淡紫色菌絲；然后將培養(yǎng)架上的所有物質(zhì)搗碎，在溫度24°C、培養(yǎng)室內(nèi)濕度 50%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天。從培養(yǎng)室中將所有物質(zhì)拿出，放在陰涼通風(fēng)處晾干或空調(diào)抽濕，即得到粗品。4、血球計數(shù)板計數(shù)1. 31 X IO10個孢子/克粗品；平板計數(shù)1. 31 X IO10個孢子/
克粗品。上述步驟1-3均在無菌條件下操作。實(shí)施例2
1、斜面菌種固體斜面培養(yǎng)基與實(shí)施例1中所述一致。將淡紫擬青霉菌接種于試管斜面培養(yǎng)基，在28°C傳代培養(yǎng)、活化，至斜面長滿淡紫 色孢子。2、種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成與實(shí)施例1中所述一致。每個IOOOml三角瓶中放入450ml培養(yǎng)基，121°C蒸汽滅菌20分鐘；從固體斜面中 挑出一小塊菌苔，用種子培養(yǎng)基配置分生孢子懸浮液，再將分生孢子懸浮液接入250ml三 角瓶，初始濃度為IO5個/ml，一只斜面可接6-8個瓶子；在28°C搖床振蕩培養(yǎng)64小時，至 長成白色粘稠菌絲體。3、固體培養(yǎng)
培養(yǎng)室與實(shí)施例1中所述一致。a.固體培養(yǎng)基小麥麩皮30kg，玉粉70kg、甘蔗渣50kg、椰糠15kg、蔗糖16. 5g、硫 酸銨16. 5g、磷酸二氫鉀8. 5g、硫酸錳0. 7g、自來水為35L。配制方法與實(shí)施例1中所述一致。b.接種按25% (體積百分比)接種量，將種子培養(yǎng)的產(chǎn)物倒入固體培養(yǎng)基中，攪 拌均勻，裝入發(fā)酵室的培養(yǎng)架(發(fā)酵室預(yù)先消毒)；c.培養(yǎng)方法在溫度25°C、發(fā)酵室內(nèi)濕度50%和厭氧密閉條件下培養(yǎng)3天，至長 滿淡紫色菌絲；然后將培養(yǎng)架上的所有物質(zhì)輕輕搗碎，在溫度25°C、發(fā)酵室內(nèi)濕度60%的 條件下繼續(xù)培養(yǎng)4天。從培養(yǎng)室中將所有物質(zhì)拿出，放在陰涼通風(fēng)處晾干或空調(diào)抽濕，即得到粗品。4、血球計數(shù)板計數(shù)3. 24X IO10個孢子/克粗品；平板計數(shù)3. 21 X IO10個孢子/
克粗品。上述步驟1-3均在無菌條件下操作。實(shí)施例3 1、斜面菌種固體斜面培養(yǎng)基與實(shí)施例1中所述一致。將淡紫擬青霉菌接種于試管斜面培養(yǎng)基，在28°C傳代培養(yǎng)、活化，至斜面長滿淡紫 色孢子。2、種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成與實(shí)施例1中所述一致。每個IOOOml三角瓶中放入450ml培養(yǎng)基，121°C蒸汽滅菌20分鐘；從固體斜面中挑出一小塊菌苔，用種子培養(yǎng)基配置分生孢子懸浮液，再將分生孢 子懸浮液接入250ml三角瓶，初始濃度為IO5個/ml，一只斜面可接6_8個瓶子；在29°C搖 床振蕩培養(yǎng)72小時，至長成白色粘稠菌絲體。3、固體培養(yǎng)培養(yǎng)室與實(shí)施例1中所述一致。a.固體培養(yǎng)基如表1中3所示。配制方法與實(shí)施例1中所述一致。b.接種按30% (體積百分比)(表1中3所示)接種量，將種子培養(yǎng)的產(chǎn)物倒入固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，裝入發(fā)酵室的培養(yǎng)架(發(fā)酵室預(yù)先消毒)；c.培養(yǎng)方法在溫度26°C、發(fā)酵室內(nèi)濕度70%和厭氧密閉條件下培養(yǎng)2天，至長 滿淡紫色菌絲；然后將培養(yǎng)架上的所有物質(zhì)輕輕搗碎，在溫度26°C、發(fā)酵室內(nèi)濕度70%的 條件下繼續(xù)培養(yǎng)4天。從培養(yǎng)室中將所有物質(zhì)拿出，放在陰涼通風(fēng)處晾干或空調(diào)抽濕，即得到粗品。4、血球計數(shù)板計數(shù)5. 21 X IO10個孢子/克粗品；平板計數(shù)5. 21 X IO10個孢子/
克粗品。上述步驟1-3均在無菌條件下操作。表 1 發(fā)酵周期由同類技術(shù)的12-14天縮短到6-7天，發(fā)酵水平多100億/克粗品。不 僅明顯縮短了發(fā)酵周期，而且不需要復(fù)雜設(shè)備，對濕度的要求降低。
權(quán)利要求
一種固體培養(yǎng)基，由麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸錳和水組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗 糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸錳和水的配比為如下1)或2)或3)或4)所示1)麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=(20kg-35kg) (60k纊 150kg) (30k^60kg) (10k^-40kg) (15纊20g) (15^-20g) (8^15g) (0.7纊 2g) (20L-50L)；2)麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=(20kg-35kg) (60k纊 100kg) (30kg-50kg) (10k纊30kg) (15纊20g) (15g-18g) (8g-10g) (0.7g-2g) (20L-40L)；3)麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=(20kg-35kg) (60k纊70kg) (30kg-50kg) (10k纊 15kg) (15g-16.5g) (15纊 18g) (8纊IOg) (0.7g -Ig) (20L-35L)；4)麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=30kg IOOkg 60kg 30kg 20g 20g IOg 2g 50L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=35kg 150kg 40kg 40kg 20g 20g 15g Ig 40L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=30kg IOOkg 60kg 30kg 15g 15g 8g 0. 7g 50L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=30kg IOOkg 60kg 30kg 20g 18g IOg Ig 50L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=35kg 150kg 40kg 40kg 20g 20g IOg Ig 40L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=20kg 60kg 30kg IOkg 15g 15g IOg Ig 20L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=30kg 70kg 50kg 15kg 16. 5g 16. 5g ； 8. 5g ； 0. 7g 35L0
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述麩皮為小麥的麩皮，所述 玉米為玉米粉。
4.一種培養(yǎng)淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法，包括如下步驟將淡紫擬 青霉(Paecilomyces lilacinus)接種于權(quán)利要求1-3中任一所述固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)， 將容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作固體培養(yǎng)物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)包括如下步驟在濕度為 30% -70%和溫度為24°C _26°C的條件下，培養(yǎng)2_3天；將所述固體培養(yǎng)物質(zhì)搗碎，再在濕 度為50% -70%和溫度為24°C _26°C的條件下，培養(yǎng)3_4天；所述濕度具體為30%、50%、 60%或70% ；所述溫度具體為24°C、25°C或26°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)中所用的容器為培養(yǎng) 架；所述培養(yǎng)架為腔內(nèi)設(shè)有若干尼龍紗網(wǎng)隔層的柱體；所述固體培養(yǎng)物質(zhì)位于所述尼龍紗 網(wǎng)隔層上；所述固體培養(yǎng)在無菌條件下進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述固體培養(yǎng) 前，包括如下種子培養(yǎng)的步驟將淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)接種于種子培養(yǎng) 基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，將種子培養(yǎng)產(chǎn)物再進(jìn)行所述固體培養(yǎng)；所述種子培養(yǎng)基由殼聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆餅粉、KH2P04、MnS04、醋酸和水組成；所述殼 聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆餅粉、KH2P04、MnS04、醋酸和水的配比為:20g 15g IOg 15g 0. 5g 0.05g 0. 5ml IL0
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)的條件 270C -29°C振蕩培養(yǎng)48-72小時，接種濃度為IO5個孢子/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述將種子培養(yǎng)產(chǎn)物再進(jìn)行所 述固體培養(yǎng)中，接種量為20% -30% (體積百分含量)，具體為20%、25%或30%。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus)為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)E7，保藏編號為 ACCC32494。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種淡紫擬青霉的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基由麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸錳和水組成。本發(fā)明方法生長周期短，產(chǎn)率高，生產(chǎn)工藝簡單，不需要復(fù)雜設(shè)備。因此，本發(fā)明不僅對農(nóng)業(yè)廢棄物的利用、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面意義重大，而且有著切實(shí)的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/79GK101845398SQ201010209110
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者任文彬, 楊臘英, 梁昌聰, 汪軍, 王國芬, 趙培靜, 鄧國平, 黃俊生 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所