專利名稱：利用雙熱滅活親本通過(guò)原生質(zhì)體融合構(gòu)建酵母菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種原生質(zhì)體融合技術(shù)，特別涉及一種利用雙熱滅活親本并通過(guò)原生 質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建同時(shí)具有酒精發(fā)酵與色素積累能力的酵母菌株的方法，屬于生物技術(shù)制 菌領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酒精是重要的有機(jī)溶劑及燃料。在世界經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展、能源危機(jī)日益加深的今天， 酒精作為一種可再生能源受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前，燃料酒精，尤其是以纖維素水解產(chǎn)物 作為原料的燃料酒精生產(chǎn)，已成為世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)。與此同時(shí)，一些酵母菌體具有一定的色素積累能力，如類胡蘿卜素、黃酮類色素等 的積累。然而，多數(shù)情況下這些酵母菌體的色素含量較低，如果僅以這些酵母菌體生產(chǎn)色素 則成本太高，缺乏工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。一般而言，產(chǎn)色酵母多分布在紅酵母屬(Rhodotorula)、 發(fā)夫酵母屬(Phaffia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、瓶型酵母屬(Pityrosporum)以 及黑酵母屬(Aureobasidium)等數(shù)屬，不具備產(chǎn)乙醇的能力；而產(chǎn)酒酵母分布在釀酒酵母 屬(Saccharomyces)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、翰遜酵母屬(Hansenula)、德巴利酵母 屬(Debaryomyces)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、假絲酵母屬(Candida)等數(shù)屬，具備將 葡萄糖、麥芽糖等小分子糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖嫉哪芰??？梢?jiàn)，通過(guò)微生物育種的方式，獲得 同時(shí)具有產(chǎn)色素和產(chǎn)乙醇的酵母菌株，意義極大。常用的微生物育種技術(shù)主要有自然分離、誘變篩選、細(xì)胞結(jié)合、原生質(zhì)體融合、基 因?qū)胍约盎蚱茐牡确绞健Ｆ渲?，原生質(zhì)體融合是指通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的 兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程。這種育 種方式可以打破微生物的種界界限，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組，使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整， 獲得更多基因重組的機(jī)會(huì)，從而把更多優(yōu)良性狀組合到一個(gè)單一菌株中。原生質(zhì)體融合育種工作在酵母菌種中已有廣泛開(kāi)展，傳統(tǒng)方法采用抗藥性標(biāo)記 或營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記親本菌株，以便檢出融合子菌株，其工作相當(dāng)繁瑣，且這些遺傳標(biāo)記往往 會(huì)干擾菌株的正常代謝，影響菌株的一些重要性狀[劉玲，葉博，劉長(zhǎng)江.原生質(zhì)體融合 親本菌株抗藥性標(biāo)記的篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(3) =225-227.]；[譚悠久，譚紅 等.以抗生素抗性為選擇標(biāo)記的毛殼菌種間原生質(zhì)體融合[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自 然科學(xué)版),2010,36(1) 36-41.]；以及[B. S. Gunashree, G. Venkateswaran. Enhanced phytaseproduction through interspecific protoplast fusion of Aspergillus niger CFR 335 andAspergillus ficuum SGA 01 auxotrophic mutants[J]. Enzyme and Microbial Technology 46(2010)562-567.]。目前有較多采用的雙親菌株不同方式滅活處 理，如紫外線滅活、熱滅活，由于菌株失活機(jī)制的不同，根據(jù)“致死損傷互補(bǔ)”原則，滅活細(xì)胞 通過(guò)雙親本原生質(zhì)體融合而再生，可生長(zhǎng)成具有雙親性狀的機(jī)能完整的融合子菌株。在此 基礎(chǔ)上，經(jīng)研究實(shí)驗(yàn)，提出一種更為簡(jiǎn)單的、利用雙熱滅活親本并通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu) 建同時(shí)具有酒精發(fā)酵與色素積累能力的酵母菌株的方法，這正是本發(fā)明的任務(wù)所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述傳統(tǒng)方法中所存在的不足，基于滅活兩親本細(xì)胞 通過(guò)原生質(zhì)體融合而再生成融合子菌株基礎(chǔ)上，提出一種以酒精酵母和產(chǎn)色酵母菌株為親 本，利用雙熱滅活親本并通過(guò)原生質(zhì)體融合構(gòu)建同時(shí)具有乙醇發(fā)酵與色素積累能力的酵母 菌株的方法，通過(guò)該方法不僅可獲得同時(shí)具有乙醇能力和色素積累能力的新型酵母菌株; 且方法簡(jiǎn)單，過(guò)程易實(shí)現(xiàn)；還能減少乙醇與色素同時(shí)生產(chǎn)的設(shè)備投入及生產(chǎn)成本。本發(fā)明的目的是由以下措施構(gòu)成的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的利用雙熱滅活親本通過(guò)原生質(zhì)體融合構(gòu)建酵母菌株的方法，依次包括以 下工藝步驟(1)兩親本菌體的制備分別將具有產(chǎn)乙醇和產(chǎn)色素能力的兩親本酵母細(xì)胞接種于酵母膏蛋白胨葡萄糖 瓊脂培養(yǎng)基即YPD固體培養(yǎng)基斜面上，待生長(zhǎng)時(shí)間18 24小時(shí)后，刮取斜面上生長(zhǎng)的酵 母細(xì)胞，制得細(xì)胞濃度為IO7 IO9個(gè)/mL的菌懸液，吸取200 μ L菌懸液，接種于經(jīng)115 125°C和15 25分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基的瓶中，置于28 32°C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng) 10 18小時(shí)，制得兩親本菌體；(2)兩親本原生質(zhì)體的制備將步驟(1)的兩親本菌體培養(yǎng)液以濃度為0. 4 0. 9mol/L NaCl離心洗滌三次，再 將洗滌的菌體細(xì)胞稀釋到濃度為IO6 IO7個(gè)/mL，取IOmL稀釋后的菌懸液，用4°C冷凍離 心機(jī)離心2 4分鐘，再加入5mL濃度為8 12mg/mL的蝸牛酶液酶解，輕搖使離心后的菌 體和酶液充分混合，再置于溫度28 32°C、轉(zhuǎn)速150 200r/min的恒溫?fù)u床中，酶解90 150分鐘；然后將酶解后的酵母細(xì)胞懸液置于4°C冷凍離心機(jī)中用0. 4 0. 9mol/LNaCl溶 液洗滌兩次，離心洗滌條件為2200r/min、4分鐘，再將其懸于5mL，0. 4 0. 9mol/LNaCl溶 液中，即制得兩親本原生質(zhì)體；(3)兩親本原生質(zhì)體融合于65 95°C下分別對(duì)產(chǎn)酒酵母和產(chǎn)色酵母的原生質(zhì)體滅活15 45分鐘后，將兩 親本原生質(zhì)體懸液在離心管中等量混合，于4°C冷凍離心機(jī)中2200r/min離心4分鐘，然后 加入配比為 20 40% PEG6000、0. 01mol/L CaCl2,0. 4 0. 9mol/LNaCl 的融合劑，混勻后 放入恒溫培養(yǎng)箱中，25 35°C保溫，靜置30 45分鐘以待融合；取出融合后酵母原生質(zhì)體 懸液，放入冷凍離心機(jī)中，在2200r/min、4分鐘條件下用0. 4 0. 9mol/L NaCl溶液離心洗 滌兩次，以將融合劑洗凈，將洗滌后的原生質(zhì)體重懸于0. 4 0. 9mol/L NaCl溶液中，得到 融合后的原生質(zhì)體；(4)融合子的檢出與挑選對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行初次篩選，先將其接種于具有再生培養(yǎng)基的平皿中，培 養(yǎng)24 48小時(shí)，生長(zhǎng)出融合子菌落；從生長(zhǎng)的融合子菌落中挑選出菌落顏色接近粉紅色 的菌落；然后用劃線分離法純化挑選出融合子菌株，再將純化后的融合子菌株接種于固體 YPD培養(yǎng)基斜面，25 32°C培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，每隔約8 12h觀察一次，挑選出具顯著酒香 味的斜面菌株，進(jìn)行再次劃線分離純化，通過(guò)傳代培養(yǎng)，以獲得具有明顯酒香味的穩(wěn)定的融 合子菌株，以試管斜面保存；
(5)融合子發(fā)酵性能測(cè)試及復(fù)篩將初篩的融合子，通過(guò)杜氏管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)融合子的發(fā)酵能力強(qiáng)弱進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn) 時(shí)每支試管裝115 125°C、15 25分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基10mL，其中每支試管分別 接入一接種環(huán)相應(yīng)菌種，每3h觀察1次，記錄杜氏管中氣泡產(chǎn)生情況，選出產(chǎn)生氣泡多的融 合子，即發(fā)酵性能好的融合子；分別將發(fā)酵性能好的融合子斜面菌苔2-3環(huán)接種于115 125°C、15 25分鐘滅菌的麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 32°C恒溫振蕩培養(yǎng)發(fā)酵3 7天，待 發(fā)酵液有明顯酒味后，取樣常壓蒸餾，并用酒精計(jì)測(cè)定蒸餾液的酒精度數(shù)，選出產(chǎn)乙醇能力 強(qiáng)的融合子菌株。上述技術(shù)方案中，所述蝸牛酶液以濃度為0. 2mol/L、pH值為6. 2的磷酸緩沖溶液 配制，該磷酸緩沖溶液中含有0. 4 0. 9mol/L NH4Cl。上述技術(shù)方案中，所述蝸牛酶液的使用濃度為9mg/mL，酶解時(shí)間為120分鐘。上述技術(shù)方案中，所述融合劑融合時(shí)，應(yīng)保證親本的原生質(zhì)體細(xì)胞濃度為IO6 IO7個(gè)/mL，若細(xì)胞濃度小于此范圍，則離心濃縮；若細(xì)胞濃度大于此范圍，則加入滲穩(wěn)溶液 稀釋。上述技術(shù)方案中，所述的融合劑配比為30% PEG6000、0. Olmol/L CaCl2,0. 6mol/ LNaCl。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比進(jìn)一步具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益技術(shù)效果1、本發(fā)明方法利用雙親本滅活原生質(zhì)體融合手段選育同時(shí)具備產(chǎn)色素和產(chǎn)乙醇 能力的新菌株，其方法簡(jiǎn)單，過(guò)程易實(shí)現(xiàn)。2、采用本發(fā)明方法構(gòu)建具備產(chǎn)色素和產(chǎn)乙醇能力的融合子菌株，可以實(shí)現(xiàn)乙醇與 色素的同時(shí)生產(chǎn)，將原有的兩套工藝合二為一，從而減少設(shè)備投入及生產(chǎn)成本，有利于經(jīng)濟(jì) 效益的提高。3、本發(fā)明方法通過(guò)產(chǎn)酒酵母與產(chǎn)色酵母的原生質(zhì)體融合，將顏色這一簡(jiǎn)單直觀的 表征引入酒精發(fā)酵過(guò)程，有利于工藝控制及管理。4、采用本發(fā)明方法構(gòu)建具備產(chǎn)色素和產(chǎn)乙醇能力的融合子菌株，有利于通過(guò)發(fā)酵 工藝及產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)的分析，并從理論上探討酵母菌株乙醇與色素生物合成代謝的規(guī)律。


圖1為本發(fā)明方法所構(gòu)建的融合子KP-I菌株的發(fā)酵產(chǎn)氣狀態(tài)；圖2為本發(fā)明方法所構(gòu)建的融合子LP-23菌株的斜面培養(yǎng)外觀狀態(tài)；圖3為本發(fā)明方法所構(gòu)建的融合子KP-8-2菌株的液體培養(yǎng)外觀狀態(tài)。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。本發(fā)明的實(shí)例中使用的菌株有以下三種實(shí)驗(yàn)室編號(hào)PY-I的菌株為產(chǎn)色酵母，發(fā) 酵力微弱，不產(chǎn)乙醇，培養(yǎng)菌體呈粉紅色，用作親本A ；實(shí)驗(yàn)室編號(hào)LII-E12和K211的菌株為產(chǎn)酒酵母，發(fā)酵力強(qiáng)，培養(yǎng)菌體呈乳白色，用作親本B ；所使用的培養(yǎng)基有以下三種YPD固體培養(yǎng)基為酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5 2%瓊脂；麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽汁2%，蔗糖10%，MgSO4 · 7H20 0.5%, NH4 · NO3O. 5%， KH2PO4O. 5%, pH 自然；所使用的再生培養(yǎng)基1 %酵母膏，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，0. 6mmol/LNaCl，1. 5 2%瓊脂。本發(fā)明實(shí)施例依次按照下面的操作步驟構(gòu)建所述融合子菌株。實(shí)施例1(1)兩親本菌體的制備分別將產(chǎn)酒酵母K211菌株與產(chǎn)色酵母PY-I菌株接種于酵母膏蛋白胨葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基即YPD固體培養(yǎng)基斜面上，待生長(zhǎng)時(shí)間24小時(shí)后，刮取斜面上生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞，制得 細(xì)胞濃度為5 X IO8個(gè)/mL的菌懸液，吸取200 μ L菌懸液，接種于盛有30mL，經(jīng)123°C、15分 鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于30°C、150r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18小時(shí)，制得 兩親本菌體；(2)兩親本原生質(zhì)體的制備將步驟(1)的兩親本菌體培養(yǎng)液以濃度為0. 6mol/L NaCl溶液在4°C冷凍離心機(jī) 中離心洗滌三次，再將洗滌的菌體細(xì)胞稀釋到濃度為IXlO7個(gè)/mL，取IOmL稀釋后的菌懸 液，于4°C冷凍離心機(jī)中2200r/min離心4分鐘，然后將離心后的產(chǎn)酒酵母K211菌株與產(chǎn)色 酵母PY-I菌株細(xì)胞中分別加入5mL濃度為8mg/mL的蝸牛酶液，該蝸牛酶液以含0. 6mol/L NH4Cl的0. 2mol/L、pH6. 2磷酸緩沖溶液配制，輕搖使細(xì)胞與酶液充分混合，置于溫度32°C、 轉(zhuǎn)速為200r/min的恒溫?fù)u床中，酶解150分鐘；酶解完成的酵母細(xì)胞懸液置于4°C冷凍離心機(jī)中用0. 6mol/L NaCl溶液離心洗滌 兩次，離心條件為2200r/min、4分鐘，離心完成后將其懸于5mL 0. 6mol/L NaCl溶液中，即 制得兩親本原生質(zhì)體；(3)親本原生質(zhì)體融合于90°C下對(duì)酒精酵母K211的原生質(zhì)體滅活15分鐘，95°C下對(duì)產(chǎn)色酵母PY_1的原 生質(zhì)體滅活15分鐘，兩酵母菌原生質(zhì)體致死率達(dá)100%，將兩滅活親本原生質(zhì)體懸液在離 心管中等量混合，于4°C冷凍離心機(jī)2200r/min離心4分鐘，然后加入配比為20% PEG6000、 0. 01mol/L CaCl2、0. 4mol/L NaCl的融合劑，融合前調(diào)整原生質(zhì)體細(xì)胞懸浮液濃度達(dá)1 X IO6 個(gè)/mL，混合好后放入恒溫培養(yǎng)箱中，25°C保溫靜置45分鐘，取出融合后酵母原生質(zhì)體懸 液，放入4°C冷凍離心機(jī)中，2200r/min、4分鐘條件下用0. 6mol/LNaCl溶液離心洗滌兩次， 以洗凈融合劑，將洗滌完成的原生質(zhì)體重懸于0. 6mol/LNaCl溶液中，可獲得融合后的原生 質(zhì)體；(4)融合子的檢出以菌落顏色為第一次的篩選條件，先將融合后的原生質(zhì)體接種于具有再生培養(yǎng)基 的平皿中，培養(yǎng)48小時(shí)，從生長(zhǎng)的融合子菌落中挑選出菌落顏色接近粉紅色的菌落；用劃 線分離法純化挑選出的融合子菌株，再將純化后的融合子菌株接種于固體YPD培養(yǎng)基斜 面，32°C培養(yǎng)，于24小時(shí)后每隔8小時(shí)觀察一次，挑選出具顯著酒香味的斜面菌株，進(jìn)行4次傳代培養(yǎng)，從中再一次挑選出能明顯保持酒味和香味的菌株作為融合子，以試管斜面保 存；(5)融合子發(fā)酵性能測(cè)試及復(fù)篩初篩出融合子后，通過(guò)杜氏管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)融合子的發(fā)酵能力強(qiáng)弱進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn) 時(shí)每支試管裝123°C、15分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基10mL，其中每支試管分別接入一接種環(huán) 相應(yīng)菌種，每3小時(shí)觀察1次，記錄杜氏管中氣泡產(chǎn)生情況，選出產(chǎn)生氣泡最多，即發(fā)酵能力 相對(duì)最強(qiáng)的融合子編號(hào)為KP-I菌株，如圖1所示，產(chǎn)色酵母親本A基本上無(wú)氣泡生成，發(fā)酵 能力微弱，產(chǎn)酒酵母親本B的杜氏管中充滿氣泡，發(fā)酵性能強(qiáng)，融合子1-5為融合子KP-I菌 株的平行實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)氣量與親本B相當(dāng)，具有良好的發(fā)酵能力；將KP-I融合子菌株斜面菌苔2-3環(huán)接種于123°C、15分鐘滅菌的麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng) 基中，32°C恒溫振蕩培養(yǎng)發(fā)酵3天，發(fā)酵液呈淺粉紅色，色素生成情況良好，同時(shí)發(fā)酵液酒 味明顯，發(fā)酵液常壓蒸餾后，可檢測(cè)到0. 5%以上乙醇含量，即有乙醇生成能力。實(shí)施例2(1)親本菌體的制備分別將產(chǎn)酒酵母LII-E12菌株與產(chǎn)色酵母PY_1菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基斜面 上，待生長(zhǎng)時(shí)間18小時(shí)后，刮取斜面上生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞，制得細(xì)胞濃度為5Χ IO7個(gè)/mL的 菌懸液，吸取200 μ L菌懸液，接種于盛有30mL經(jīng)121°C、15分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基的 三角瓶中，30°C、150r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)13小時(shí)，制得兩親本菌體；(2)親本原生質(zhì)體的制備將步驟(1)的兩親本菌體培養(yǎng)液以濃度為0. 6mol/LNaCl在4°C冷凍離心機(jī)中離 心洗滌三次，再將洗滌的菌體細(xì)胞稀釋到濃度為1 X IO6個(gè)/mL，取IOmL稀釋后的菌懸液，于 4°C冷凍離心機(jī)中2200r/min離心4分鐘，然后向離心后的產(chǎn)酒酵母LII-E12菌株與產(chǎn)色酵 母PY-I菌株細(xì)胞中分別加入5mL濃度為12mg/mL的蝸牛酶液，該蝸牛酶液以含0. 6mol/L NH4Cl的0. 2mol/L、pH6. 2磷酸緩沖溶液配制，輕搖使細(xì)胞與酶液充分混合，置于恒溫?fù)u床 中，200r/min，28°C 酶解 90 分鐘；酶解后的酵母細(xì)胞懸液置于4°C冷凍離心機(jī)中用0. 6mol/LNaCl溶液離心洗滌兩 次，離心條件為2200r/min、4分鐘，離心完成后將其懸于5mL 0. 6mol/L NaCl溶液中，即制 得兩親本原生質(zhì)體；(3)兩親本原生質(zhì)體融合于80°C下對(duì)產(chǎn)酒酵母LII-E12的原生質(zhì)體滅活25分鐘，85°C下對(duì)產(chǎn)色酵母PY_1 的原生質(zhì)體滅活35分鐘，此條件下兩酵母菌的原生質(zhì)體致死率達(dá)100%，兩滅活親本原生 質(zhì)體懸液在離心管中等量混合，4°C冷凍離心機(jī)2200r/min離心4分鐘，然后加入配比為 40% PEG6000、0. 01mol/LCaCl2、0. 9mol/L NaCl的融合劑，融合前調(diào)整原生質(zhì)體細(xì)胞懸液濃 度達(dá)1 X IO7個(gè)/mL，混合好后放入恒溫培養(yǎng)箱中，35°C保溫靜置30分鐘；取出融合后的酵母 原生質(zhì)體懸液，放入4°C冷凍離心機(jī)中，用0. 6mol/LNaCl溶液2200r/min、4分鐘離心洗滌兩 次，以將融合劑洗凈，將洗滌完成的原生質(zhì)體重新懸浮于0. 6mol/LNaCl溶液中，得到融合 后的原生質(zhì)體；(4)融合子的檢出以菌落顏色為第一次的篩選條件，先將融合后的原生質(zhì)體分別接種于具有再生培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)40小時(shí)，從生長(zhǎng)的融合子菌落中挑選出菌落顏色接近粉紅色的菌落； 用劃線分離法純化挑選出的融合子菌株，再將純化后的融合子菌株接種于固體YPD培養(yǎng)基 斜面，25°C培養(yǎng)，于24小時(shí)后每隔12小時(shí)觀察一次，挑選出具顯著酒香味的斜面菌株，進(jìn)行 3次傳代培養(yǎng)，從中再一次挑選出能明顯保持酒味和香味的菌株作為融合子，以試管斜面保 存；(5)融合子發(fā)酵性能測(cè)試及復(fù)篩初篩出融合子后，通過(guò)杜氏管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)融合子的發(fā)酵能力強(qiáng)弱進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn) 時(shí)每支試管裝121°C、15分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基10mL，其中每支試管分別接入一接種環(huán) 相應(yīng)菌種，每3小時(shí)觀察1次，記錄杜氏管中氣泡產(chǎn)生情況，選出產(chǎn)生氣泡最多，即發(fā)酵能力 相對(duì)較強(qiáng)的融合子LP-23菌株，其與產(chǎn)色來(lái)源親本菌株A顏色類似，為粉紅色，但相對(duì)于產(chǎn) 色酵母親本菌株A顏色略淺，各菌株顏色如圖2所示；將LP-23融合子菌株斜面菌苔2-3環(huán)接種于121°C、15分鐘滅菌的麥芽汁發(fā)酵培 養(yǎng)基中，25°C恒溫振蕩培養(yǎng)發(fā)酵7天，發(fā)酵液呈淺粉紅色，酒味明顯，經(jīng)蒸餾檢測(cè)乙醇含量， LP-23融合子菌株有1. 7%的乙醇生成能力。實(shí)施例3(1)親本菌體的制備分別將產(chǎn)酒酵母K211菌株與產(chǎn)色酵母PY-I菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基斜面上， 待生長(zhǎng)時(shí)間20小時(shí)后，刮取斜面上生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞，制得細(xì)胞濃度為1 X108f/mL的菌懸 液，吸取200 μ L菌懸液，接種于盛有30mL經(jīng)118°C、20分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基的三角 瓶中，32°C，150r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)15小時(shí)，制得兩親本菌體；(2)親本原生質(zhì)體的制備將步驟(1)的兩親本菌體培養(yǎng)液以濃度為0. 6mol/LNaCl在4°C冷凍離心機(jī)中離 心洗滌三次，再將洗滌的菌體細(xì)胞稀釋到濃度為5X IO6個(gè)/mL，取IOmL稀釋后的菌懸液， 于4°C冷凍離心機(jī)中2200r/min離心4分鐘，然后離心后的產(chǎn)酒酵母K211菌株與產(chǎn)色酵 母PY-I菌株細(xì)胞中分別加入5mL濃度為9mg/mL的蝸牛酶液，該蝸牛酶液以含0. 6mol/L NH4Cl的0. 2mol/L、pH6. 2磷酸緩沖溶液配制，輕搖使細(xì)胞與酶液充分混合，置于恒溫?fù)u床 中，200r/min，30°C酶解 120 分鐘；酶解完成的酵母細(xì)胞懸液置于4°C冷凍離心機(jī)中用0. 6mol/L NaCl溶液離心洗滌 兩次，離心條件為2200r/min、4分鐘，離心完成后將其懸于5mL 0. 6mol/L NaCl溶液中，即 制得兩親本原生質(zhì)體；(3)親本原生質(zhì)體融合于80°C下對(duì)產(chǎn)酒酵母K211的原生質(zhì)體滅活30分鐘，85°C下對(duì)產(chǎn)色酵母PY_1的 原生質(zhì)體滅活35分鐘，此條件下兩酵母菌的原生質(zhì)體致死率達(dá)100%，兩滅活親本原生質(zhì) 體懸液在離心管中等量混合，4°C冷凍離心機(jī)2200r/min離心4分鐘，然后加入配比為30% PEG6000、0. 01mol/LCaCl2、0. 6mol/L NaCl的融合劑，融合前調(diào)整原生質(zhì)體細(xì)胞懸液濃度達(dá) 5 X IO6個(gè)/mL，混合好后放入恒溫培養(yǎng)箱中，30°C保溫靜置35分鐘；取出融合后的酵母原生 質(zhì)體懸液，放入4°C冷凍離心機(jī)中，用0. 6mol/L NaCl溶液2200r/min、4分鐘離心洗滌兩次， 以將融合劑洗凈，將洗滌完成的原生質(zhì)體重新懸浮于0. 6mol/LNaCl溶液中，得到融合后的 原生質(zhì)體；
(4)融合子的檢出以菌落顏色為第一次的篩選條件，先將融合子分別接種于具有再生培養(yǎng)基的平皿 中，培養(yǎng)36小時(shí)，從生長(zhǎng)的融合子菌落中挑選出菌落顏色接近粉紅色的菌落；用劃線分離 法純化挑選出的融合子菌株，再將純化后的融合子菌株接種于固體YPD培養(yǎng)基斜面，30°C 培養(yǎng)，于24小時(shí)后每隔12小時(shí)觀察一次，挑選出具顯著酒香味的斜面菌株，進(jìn)行5次傳代 培養(yǎng)，從中再一次挑選出能明顯保持酒味和香味的菌株作為融合子，以試管斜面保存；(5)融合子發(fā)酵性能測(cè)試及復(fù)篩初篩出融合子后，通過(guò)杜氏管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)融合子的發(fā)酵能力強(qiáng)弱進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn) 時(shí)每支試管裝118°C、20分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基10mL，其中每支試管分別接入一接種環(huán) 相應(yīng)菌種，每3小時(shí)觀察1次，記錄杜氏管中氣泡產(chǎn)生情況，篩選出發(fā)酵能力相對(duì)最強(qiáng)的融 合子KP-8-2菌株，作為同時(shí)具有產(chǎn)酒精和產(chǎn)色素能力的融合子酵母菌株；將KP-8-2融合子菌株接種麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C恒溫振蕩培養(yǎng)發(fā)酵3天。發(fā) 酵液呈淺粉紅色，如圖3所示，并有明顯酒味，取樣蒸餾，檢測(cè)酒精度數(shù)達(dá)到2. 3%。產(chǎn)乙醇產(chǎn)色素融合子菌株的獲得及其育種方法的實(shí)現(xiàn)，為進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)乙醇發(fā)酵 工藝以及進(jìn)行復(fù)合誘變育種，奠定了菌種資源基礎(chǔ)。本發(fā)明將產(chǎn)乙醇與產(chǎn)色素的多種性狀結(jié)合，構(gòu)建同時(shí)具備產(chǎn)色素及產(chǎn)乙醇能力的 新菌株，進(jìn)一步有以下幾方面的意義(1)由于在發(fā)酵過(guò)程中有色素生成，可以通過(guò)顏色的 變化來(lái)監(jiān)控酒精發(fā)酵過(guò)程；(2)很多色素在乙醇中具有較好的溶解性，因此在酒精發(fā)酵生 產(chǎn)的同時(shí)，有可能通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞中色素的溶出而減弱色素合成的反饋抑制效應(yīng)，從而提 高色素的生產(chǎn)能力；(3)由于色素不揮發(fā)的特性，發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，可在蒸餾獲得乙醇的同 時(shí)得到色素；(4)有可能將產(chǎn)色產(chǎn)乙醇菌株應(yīng)用于釀酒產(chǎn)業(yè)中以提高產(chǎn)品的保健價(jià)值。因 此，構(gòu)建同時(shí)具有產(chǎn)乙醇和色素積累能力的酵母菌株，不僅有利于提高發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)控水 平和生產(chǎn)效率，同時(shí)也可以降低色素生產(chǎn)成本，為乙醇及色素生產(chǎn)提供新途徑。
權(quán)利要求
一種利用雙熱滅活親本通過(guò)原生質(zhì)體融合構(gòu)建酵母菌株的方法，其特征在于依次包括以下工藝步驟(1)兩親本菌體的制備分別將具有產(chǎn)乙醇和產(chǎn)色素能力的兩親本酵母細(xì)胞接種于酵母膏蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基即YPD固體培養(yǎng)基斜面上，待生長(zhǎng)時(shí)間18～24小時(shí)后，刮取斜面上生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞，制得細(xì)胞濃度為107～109個(gè)/mL的菌懸液，吸取200μL菌懸液，接種于經(jīng)115～125℃和15～25分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基的瓶中，置于28～32℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10～18小時(shí)，制得兩親本菌體；(2)兩親本原生質(zhì)體的制備將步驟(1)的兩親本菌體培養(yǎng)液以濃度為0.4～0.9mol/LNaCl離心洗滌三次，再將洗滌的菌體細(xì)胞稀釋到濃度為106～107個(gè)/mL，取10mL稀釋后的菌懸液，用4℃冷凍離心機(jī)離心2～4分鐘，再加入5mL濃度為8～12mg/mL的蝸牛酶液酶解，輕搖使離心后的菌體和酶液充分混合，再置于溫度28～32℃、轉(zhuǎn)速150～200r/min的恒溫?fù)u床中，酶解90～150分鐘；然后將酶解后的酵母細(xì)胞懸液置于4℃冷凍離心機(jī)中用0.4～0.9mol/LNaCl溶液洗滌兩次，離心洗滌條件為2200r/min、4分鐘，再將其懸于5mL，0.4～0.9mol/LNaCl溶液中，即制得兩親本原生質(zhì)體；(3)兩親本原生質(zhì)體融合于65～95℃下分別對(duì)產(chǎn)酒酵母和產(chǎn)色酵母的原生質(zhì)體滅活15～45分鐘后，將兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管中等量混合，于4℃冷凍離心機(jī)中2200r/min離心4分鐘，然后加入配比為20～40％PEG6000、0.01mol/L CaCl2、0.4～0.9mol/LNaCl的融合劑，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中，25～35℃保溫，靜置30～45分鐘以待融合；取出融合后酵母原生質(zhì)體懸液，放入冷凍離心機(jī)中，在2200r/min、4分鐘條件下用0.4～0.9mol/LNaCl溶液離心洗滌兩次，以將融合劑洗凈，將洗滌后的原生質(zhì)體重懸于0.4～0.9mol/LNaCl溶液中，得到融合后的原生質(zhì)體；(4)融合子的檢出與挑選對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行初次篩選，先將其接種于具有再生培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24～48小時(shí)，生長(zhǎng)出融合子菌落；從生長(zhǎng)的融合子菌落中挑選出菌落顏色接近粉紅色的菌落；然后用劃線分離法純化挑選出融合子菌株，再將純化后的融合子菌株接種于固體YPD培養(yǎng)基斜面，25～32℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，每隔約8～12h觀察一次，挑選出具顯著酒香味的斜面菌株，進(jìn)行再次劃線分離純化，通過(guò)傳代培養(yǎng)，以獲得具有明顯酒香味的穩(wěn)定的融合子菌株，以試管斜面保存；(5)融合子發(fā)酵性能測(cè)試及復(fù)篩將初篩的融合子，通過(guò)杜氏管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)融合子的發(fā)酵能力強(qiáng)弱進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)時(shí)每支試管裝115～125℃、15～25分鐘滅菌的YPD液體培養(yǎng)基10mL，其中每支試管分別接入一接種環(huán)相應(yīng)菌種，每3h觀察1次，記錄杜氏管中氣泡產(chǎn)生情況，選出產(chǎn)生氣泡多的融合子，即發(fā)酵性能好的融合子；分別將發(fā)酵性能好的融合子斜面菌苔2-3環(huán)接種于115～125℃、15～25分鐘滅菌的麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，25～32℃恒溫振蕩培養(yǎng)發(fā)酵3～7天，待發(fā)酵液有明顯酒味后，取樣常壓蒸餾，并用酒精計(jì)測(cè)定蒸餾液的酒精度數(shù)，選出產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)的融合子菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述蝸牛酶液以濃度為0.2mol/L、pH值為 6. 2的磷酸緩沖溶液配制，該磷酸緩沖溶液中含有0. 4 0. 9mol/L NH4Cl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述蝸牛酶液的使用濃度為9mg/mL， 酶解時(shí)間為120分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的融合劑融合時(shí)，應(yīng)保證親本的原 生質(zhì)體細(xì)胞濃度為IO6 IO7個(gè)/mL，若細(xì)胞濃度小于此范圍，則離心濃縮；若細(xì)胞濃度大于 此范圍，則加入滲穩(wěn)溶液稀釋。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于所述的融合劑配比為30%PEG6000、 0. 01mol/L CaCl2、0. 6mol/L NaCl。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用雙熱滅活親本通過(guò)原生質(zhì)體融合構(gòu)建酵母菌株的方法，屬于生物技術(shù)制菌領(lǐng)域。該方法是利用產(chǎn)色酵母和產(chǎn)酒酵母種屬的差異，利用雙熱滅活親本并用原生質(zhì)體融合的方式，使雙親本原生質(zhì)體融合而再生，獲得同時(shí)具有來(lái)源于不同親本的產(chǎn)色產(chǎn)酒的融合子菌株。其工藝步驟包括兩親本菌體和兩親本原生質(zhì)體的制備；兩親本原生質(zhì)體融合；融合子的檢出與挑選和融合子發(fā)酵性能測(cè)試及復(fù)篩。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，過(guò)程易實(shí)現(xiàn)，育種成功幾率高；其獲得的酵母融合菌株，對(duì)于酒精發(fā)酵及色素積累過(guò)程的代謝調(diào)控理論研究及提高酒精發(fā)酵生產(chǎn)的管理控制效率都具有積極意義；同時(shí)也為酒精工業(yè)及色素生產(chǎn)的菌種選育提供了新的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/04GK101886069SQ20101021022
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者吳正云, 張文學(xué), 王燕, 王蓉, 郭泓辰 申請(qǐng)人:四川大學(xué)