專利名稱：一種耐熱植酸酶畢赤酵母工程菌及其耐熱植酸酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)耐熱植酸酶畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及利用該菌株生產(chǎn)耐熱植 酸酶的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植酸酶由于可通過水解植酸及植酸鹽而在飼料、食品、醫(yī)藥中具有廣闊的應(yīng)用前 景。在動物飼料方面，添加到飼料中的植酸酶通過水解植酸及植酸鹽可緩解植酸及植酸鹽 在飼料中的抗營養(yǎng)作用，同時，動物體內(nèi)由于植酸及植酸鹽被植酸酶水解而可降低動物糞 便中磷的排放量，減輕了磷對環(huán)境造成的污染。在食品工業(yè)方面，雖然到目前為止在市場上 還沒有出現(xiàn)與食品相關(guān)的植酸酶產(chǎn)品，但植酸酶在食品工業(yè)方面仍然存在著很大的應(yīng)用潛 力，如亞洲人主要以稻米、小麥為主食，而稻米、小麥中70%左右的磷都是以植酸的形式存 在，由于植酸的抗營養(yǎng)作用，就會降低人體對各種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，如果向稻米、小麥 中添加植酸酶就能很好解決這個問題。同樣，植酸酶也可應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。但是，在工業(yè)生產(chǎn)中要使植酸酶實現(xiàn)高效應(yīng)用價值，就要求其具有良好的酶學性 質(zhì)。例如，在飼料行業(yè)中，飼料生產(chǎn)加工過程中存在高溫制粒環(huán)節(jié)，這就要求植酸酶必須具 備良好的熱穩(wěn)定性。另一方面，植酸酶的作用部位是動物胃腸道，而動物胃腸道的溫度一般 是37°C，所以商品化的植酸酶又必須在37°C時具有良好的活性。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前廣泛使用的外源基因表達系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)已經(jīng) 成功表達了數(shù)百種外源蛋白，其在表達外源蛋白的過程中，因其表達量高、內(nèi)源蛋白分泌量 少、分離純化簡便、適宜工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點倍受研究者的親睞。隨著其菌株和載體的改良以 及表達策略的不斷優(yōu)化，此系統(tǒng)已經(jīng)日漸成為實驗室基礎(chǔ)科學研究及商業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白 的寵兒。目前，生產(chǎn)中耐熱植酸酶大多數(shù)是在細菌中表達，很少有耐熱植酸酶在酵母中表 達，工業(yè)生產(chǎn)中更未見在酵母中表達且在90°C處理后仍保留50%及以上酶活的耐熱植酸 酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過基因合成的方法得到衍生于E. coli K12經(jīng)酵母密碼子優(yōu)化 的耐熱植酸酶基因，該耐熱植酸酶基因在畢赤酵母中表達后熱穩(wěn)定性明顯提高，通過基因 工程的手段構(gòu)建能高效表達的耐熱植酸酶畢赤酵母工程菌，并從中培養(yǎng)分離純化制取耐熱 的重組植酸酶，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，以已知序列的耐熱植酸酶出發(fā)，設(shè)計36條引物通過基因合 成得到該耐熱植酸酶基因，通過在酵母細胞表達，生產(chǎn)出熱穩(wěn)定性高的植酸酶。具體做法是，設(shè)計36條引物(appA)Fl-(appA)R36，通過兩步法擴增得到耐酸植 酸酶基因。首先，將大小為1299bp的耐熱植酸酶基因分為641bp和658bp的兩個小片段
3通過PCR來擴增，首尾引物濃度為lOymol/L，中間引物濃度為lymol/L，V 920sec ； °C 6 sec ； "C 6sec(25cycle) ； "C 6min，擴增出641bp和658bp的DNA片段，然后將得到的2份 DNA片段等量混勻，加引物(appA)Fl和(appA) R36進行第二步擴增，引物濃度lOymol/ L, "C 9sec ； "C sec ； "C 6min 30sec(25 個循環(huán))；°C 6min，擴增產(chǎn)物為 1299bp 的 DNA 片 段。將上述的基因插入到畢赤酵母整合表達載體PHBM905A中，然后將得到的含耐熱植酸酶 基因的表達載體導(dǎo)入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一株高效表達耐熱植酸酶的酵母 基因工程菌菌株，命名為GS115/appANR。該巴斯德畢赤酵母基因工程菌菌株GS115/appA NR(Pichia pastoris GS115/appA NR)已于2010年7月6日交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保 藏，保藏號 CCTCCNO :M2010168oGS115/appANR菌株的菌學特性a、形態(tài)特性畢赤酵母菌的無性生殖為芽殖，有時有假菌絲。有性生殖產(chǎn)生子囊內(nèi) 含有1-4枚光滑圓形、禮帽形或土星子囊孢子。b、生理生化特性畢赤酵母菌能利用特殊的物質(zhì)為原料生長，如石油、甲醇、氨態(tài) 氮、有機酸等。GS115/appANR菌株具有畢赤酵母菌的生理生化特性，同時因插入了耐熱植酸 酶基因，具有高效表達耐熱植酸酶的特性。將工程菌GS115/appA NR在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，20_30°C培養(yǎng)至細胞密度 0D600達到20時，加入甲醇，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24-216小時，每隔24小時測酶活，酶活性達 978U/mL時停止誘導(dǎo)培養(yǎng)，將完成培養(yǎng)的酵母基因工程菌經(jīng)離心除去菌體，收集上清液，經(jīng) 過30-75%飽和度的硫酸銨沉淀濃縮即得重組植酸酶產(chǎn)品。表達的重組酶熱穩(wěn)定性顯著提高，將表達的重組酶在9°C，水浴lOmin，在；TC， pH5. 5測定酶活，經(jīng)上述處理后表達的重組酶仍保持92%的活性，與E. coli K12野生型植 酸酶相比其熱穩(wěn)定性提高了 80%左右。搖瓶發(fā)酵表明該酶在酵母的表達量高達978U/mL。 該酶分子量在90kDa左右，在40-60°C之間維持60%以上的酶活，最適pH在5. 5，具有良好 的胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受性，該酶在低溫中性PH條件下仍具有一定的酶活。上述的重組耐熱植酸酶粗酶液熱穩(wěn)定性的測量方法，其步驟為1)用pH5. 5,0. 25M的乙酸緩沖液配制7. 5mmol/L的植酸鈉溶液。2)將粗酶液在9°C，水浴lOmin，在3°C測定酶活。本發(fā)明的植酸酶生產(chǎn)成本低，具有良好的耐熱性能，很好的解決飼料生產(chǎn)過程中 因高溫制粒而造成酶活損失較多的問題，具有很好的市場價值。具體體現(xiàn)如下1)酶活高。2)酶學性質(zhì)好。具有良好的熱穩(wěn)定性，另有很寬的PH值范圍，具有良好的胃蛋白 酶和胰蛋白酶耐受性，低溫中性PH條件下仍具有一定的酶活。3)后處理簡單。其它來源的植酸酶后處理精制成本高，相應(yīng)的價格要高，利用酵 母基因工程菌GS115/appA NR生產(chǎn)的粗酶液可直接用載體吸附干燥后就可以達到商品的要 求，生產(chǎn)成本相對低。
具體實施例方式實施例1 設(shè)計36條引物(appA)Fl-(appA)R36，通過兩步法擴增得到耐酸植酸酶 基因。首先，將大小為1299bp的耐熱植酸酶基因分為641bp和658bp的兩個小片段通過PCR來擴增，首尾引物濃度為ΙΟμπιοΙ/L，中間引物濃度為lymol/L，94°C 20sec ；60°C 30sec ； 68°C 50sec(25cycle) ；68°C 7min，擴增出 641bp 和 658bp 的 DNA 片段，然后將得到的 2 份 DNA片段等量混勻，加引(appA)Fl和(appA) R36進行第二步擴增，引物濃度lOymol/L， 94°C 20sec ；60°C 30sec ；68°C Imin 30sec (25cycle) ；68 °C 7min)，擴增 1299bp 的 DNA 片 段。將上述的基因插入到畢赤酵母整合表達載體PHBM905A中，經(jīng)測序證實該DNA片段序列 無誤并正確插入表達載體PHBM905A中，然后將得到的含耐熱植酸酶基因的表達載體導(dǎo)入 到畢赤酵母GS115中，轉(zhuǎn)化子點種在含植酸鈣的底物平板上，再從中篩選出出現(xiàn)最大水解 圈的一種高效表達耐熱植酸酶的酵母基因工程菌GS115/appANR菌株。實施例2 將實施例1得到的GS115/appANR菌株在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中， 20-30°C搖瓶培養(yǎng)，使細胞密度對應(yīng)的0D_達到20，再轉(zhuǎn)接到以甲醇作為唯一碳源的誘導(dǎo) 培養(yǎng)基中于20-30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)216小時，每隔24小時取樣，對所取樣進行分析， 當產(chǎn)酶水平達978U/mL以上時，停止誘導(dǎo)，離心分離菌體，收集含耐熱植酸酶的上清液，即 為粗酶液，對粗酶液進行酶活測定，酶活性為978U/mL。經(jīng)過30-75%飽和度的硫酸銨沉淀 濃縮即得耐高溫重組植酸酶產(chǎn)品。用pH5. 5,0. 25M的乙酸緩沖液配制7. 5mmol/L的植酸鈉溶液，將上述粗酶液在 95°C水浴10分鐘，在37 °C測定相對酶活，測得該酶在在95°C水浴10分鐘，還有92%的殘余 酶活。以濃度為7. 5mmol/L的植酸鈉溶液為底物，測定該酶的其它酶學性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在 中性PH的酶活高于E. coli K12野生型植酸酶，其他酶學性質(zhì)和E. coliK12野生型植酸酶 基本一致。另外，經(jīng)測定該耐熱植酸酶的表達量可達到10g/L。本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞XL10-G0LD購于Strategene公司， Pichiapastoris GS115菌株和pHBM905A質(zhì)粒均由本實驗室保存。所有引物均由上海捷瑞 生物工程公司合成。
權(quán)利要求
一種耐熱植酸酶畢赤酵母工程菌GS115/appA NR，其保藏號為CCTCCNoM2010168。
2.一種耐熱植酸酶的生產(chǎn)方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述的耐熱植酸酶酵母工程 菌GS115/appANR在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，20-30°C培養(yǎng)至細胞密度0D_達到20時， 再轉(zhuǎn)接到以甲醇作為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在20-30°C，經(jīng)24-216小時誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔 12-24小時間測酶活，酶活性達978U/ml時停止誘導(dǎo)培養(yǎng)，將完成培養(yǎng)的酵母工程菌經(jīng)離心 除去菌體，收集上清液，經(jīng)過30-75%飽和度的硫酸銨沉淀濃縮即得重組耐熱植酸酶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提出一種產(chǎn)耐熱重組植酸酶的畢赤酵母工程菌GS115/appA NR的構(gòu)建及利用該菌株生產(chǎn)耐熱植酸酶的方法。本發(fā)明采用兩步PCR法合成耐熱植酸酶基因并構(gòu)建重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入比赤酵母菌株GS115，表達步驟為1)將兩步PCR合成的耐熱植酸酶基因克隆至巴斯德畢赤酵母分泌型表達載體中，獲得畢赤酵母重組表達質(zhì)粒；2)將此重組表達質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母宿主菌GS115，經(jīng)MD平板和含植酸鈣的底物平板篩選再從中篩選出出現(xiàn)最大水解圈的菌株；3)挑取陽性克隆利用0.5％甲醇誘導(dǎo)表達。通過測定，畢赤酵母工程菌GS115/appA NR表達的重組耐熱植酸酶熱穩(wěn)定性較E.coli K12野生型植酸酶有很大的提高，具體表現(xiàn)為在95℃水浴10min，仍能保持92％的酶活。用該酵母基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的重組植酸酶，其發(fā)酵粗酶酶活性可達978U/mL。
文檔編號C12R1/84GK101935617SQ20101022915
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者余曉嵐, 鄒由, 馬立新 申請人:湖北大學