專利名稱：土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及微生物的菌劑制備方法，尤其涉及利用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢液制 備巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌三菌組合的液體菌劑的制備方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的微生物液體菌劑的制備方法，所用原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、牛肉 膏、維生素，無機鹽和水配制成液體培養(yǎng)基，從試管斜面菌種上刮取菌苔接種在液體培 養(yǎng)基中，經(jīng)好氧或厭氧培養(yǎng)制備成液體菌劑，其缺點是所用原料成本高，生產(chǎn)工藝復(fù) 雜，不能節(jié)約能源。
混合菌劑傳統(tǒng)做法，是將各種不同的菌種(好氧和厭氧)在各自不同的生長環(huán)境 中培養(yǎng)菌種，然后從每個菌種的培養(yǎng)物中刮取菌苔制取每個菌的液體菌懸液，再轉(zhuǎn)種于 各自的液體培養(yǎng)液經(jīng)通氣或厭氧發(fā)酵培養(yǎng)后離心制取活性細胞菌，將沉淀物噴霧干燥制 成粉劑，制成多菌的混合。其缺點是制備工藝復(fù)雜，發(fā)酵周期長，成本高，應(yīng)用受到 限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有微生物液體菌劑生產(chǎn)技術(shù)不足之處而提供一種土著 益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑的制備方法。使用巨大芽孢 桿菌與膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌科學(xué)配伍，以新鮮豆腐或粉絲或玉米或洋芋淀粉產(chǎn) 生的廢水為原料，添加少量無機鹽制備巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液 體菌劑。
本發(fā)明的目的可以通過采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種土著益生巨大芽孢桿 菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，其主要特點在于由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)、圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和液體培養(yǎng)基組成，其三種菌株的重量百分比為巨大芽孢桿菌為55 65%,膠凍樣芽孢桿菌為30 35%、圓褐固氮菌5 10%，所述的巨大芽孢桿菌的保藏 號為CGMCC No.3770 ；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號為CGMCC No.3769 ；所述的圓 褐固氮菌的保藏號為CGMCC No.3768。
所述的土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，所述 的液體培養(yǎng)基包括有在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢水中 加入硫酸銨l-2g，磷酸0.5-lml，用的石灰水調(diào)pH 7.2-7.5。
—種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑的制備方 法，其主要特點在于有如下步驟
A. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培 養(yǎng)4
a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨 0.2-0.6%,瓊脂粉1_3%、無菌水80-120ml，加熱溶解后，用1 %的氫氧化鈉調(diào)pH值至 7.0-7.5，經(jīng)110-114°C，30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下分裝于15 X 1.5cm的干 燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備用；
b. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌菌種的培養(yǎng)分別取巨大芽孢桿 菌、膠凍樣芽孢桿菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條件下，轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培 養(yǎng)基上，經(jīng)觀-321、24-48小時培養(yǎng)，即得瓊脂斜面菌種，為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽 孢桿菌一級菌種；
B.所述土著益生圓褐固氮菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)
a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備磷酸二氫鉀0.01-0.03%，硫酸鎂0.01-0.03%， 氯化納0.01-0.03%，碳酸鈣0.4-0.6%，甘露醇0.8-1.2%，硫酸鈣0.08-0.12 %，瓊脂 1.8-2.2%,水80-120毫升，加熱溶解用1 %的氫氧化納調(diào)pH值6.8-7.0，經(jīng)110_114°C， 30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下，分裝于15 X 1.5cm干燥滅菌的試管擺成斜面待 凝固后備用；
b. 土著益生圓褐固氮菌菌種的培養(yǎng)取土著益生圓褐固氮菌的母種瓊脂斜面 菌，在無菌條件下轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)觀_321，48-32h，即得瓊脂 斜面菌種，為圓褐固氮菌一級菌種；
C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及 液體菌種的培養(yǎng)
a.液體培養(yǎng)基的制備在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀 粉廢水中加入硫酸銨l_2g，磷酸0.5-lml，用的石灰水調(diào)pH 7.0-7.5，分裝于500ml三 角燒瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然后經(jīng)110-112°C，30-35分鐘高壓滅菌，冷卻后
b.分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌的一級菌種，在無菌條 件下，接種于液體培養(yǎng)液中，經(jīng)觀_321、24-48小時培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為二級菌種；
c.分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌的二級菌種再擴大培 養(yǎng)，上搖床振蕩培養(yǎng)，經(jīng)振幅100 120r/mte、溫度^ 32°C、18 M小時培養(yǎng)，其 菌液為三級菌種；
d.分別將重量百分比為巨大芽孢桿菌為55 65%、膠凍樣芽孢桿菌為30 35%,圓褐固氮菌為5 10%三級菌種再擴大培養(yǎng)，三種菌在同一個發(fā)酵罐，經(jīng) 28-3218-M小時的通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其菌液為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和 圓褐固氮菌混合菌劑，即為四級菌種，然后繼續(xù)逐級擴大培養(yǎng)。
一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑在農(nóng)作物 和植物生長劑的應(yīng)用。
利用巨大芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，配伍圓褐固氮菌三菌組合制備巨大芽孢 桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌菌劑，三菌的科學(xué)配比和獨特的發(fā)酵工藝，使其在 生長過程中產(chǎn)生的有用物質(zhì)及其分泌物質(zhì)成為各自或相互生長的基料和原料，通過三菌 相互間的這種共生增殖關(guān)系，形成了一個復(fù)雜而穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，發(fā)揮了多功能的優(yōu)勢。
巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌三菌在新鮮的豆腐、粉絲、玉 米、洋芋淀粉產(chǎn)生的廢水中，添加少量的無機鹽，直接發(fā)酵制備巨大芽孢桿菌、膠凍樣 芽孢桿菌和圓褐固氮菌菌劑，既節(jié)省了培養(yǎng)基的原料，減少原料配制和高壓滅菌的工 序，節(jié)省了能源，也解決了這些行業(yè)治污的難題，是一項變廢為寶，一舉多得的生物技 術(shù)。
土著益生巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、圓褐固氮菌是在暗灰鈣土、淡灰鈣 土、紅粘土和鹽堿土四種不同土壤類型多種植物根區(qū)的O-lOcm、10-20cm、20_30cm深 層土壤中的266個樣品分離培養(yǎng)所得的3868株，經(jīng)篩選優(yōu)育后，經(jīng)紫外線和亞硝基胍 (NTG)誘變和反復(fù)馴化培養(yǎng)又經(jīng)生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)鑒定獲得優(yōu)良菌株。2010年04月 沈日，在中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) (LJP-106)菌種保藏號為 CGMCC No.3770，膠凍樣芽孢桿菌(Bacillusmucihginosus) (LJK-35)菌種保藏號為 CGMCC No.3769,圓褐固氮菌(Azotcybacterchroococcum) (LGN-09)菌種保藏號為CGMCC No.3768，三種菌能在同一條件下，同一發(fā)酵時間，完 成各自的生長功能，起到菌種間的互補作用。圓褐固氮菌可利用空氣中的氮轉(zhuǎn)化成微生 物生長所用的氮素，巨大芽孢桿菌和膠凍樣芽胞桿菌能將有機物中生物難以利用的磷元 素、鉀元素轉(zhuǎn)化成易吸收的營養(yǎng)元素、由于多菌的協(xié)同作用，明顯提高了對有機廢水的 利用率和菌細胞數(shù)量的增加，從而產(chǎn)生大量的被植物和動物吸收利用的生物活性酶，生 物激素和有益的生長因子。這一生物代謝過程即降解了廢水中的有機物又以廢水為液體 培養(yǎng)基制備了巨大芽胞桿菌、膠凍樣芽胞桿菌和圓褐固氮菌組合的微生物菌劑。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢液為原料，生產(chǎn)過程無“三 廢”污染，生產(chǎn)工藝簡單，操作方便，節(jié)省人力，節(jié)省能源，其液體菌劑，即可用于有 機廢水凈化劑，又可作為微生物肥料和微生物飼料。


圖1為本發(fā)明的制備工藝流程示意圖；
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明
實施例1: 一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌 齊U，由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)、 圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和液體培養(yǎng)基組成，其三種菌株的重量百分比 為巨大芽孢桿菌為陽 65%、膠凍樣芽孢桿菌為30 35%、圓褐固氮菌5 10%， 所述的巨大芽孢桿菌的保藏號為CGMCC No.3770 ；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號為 CGMCCNo.3769 ；所述的圓褐固氮菌的保藏號為CGMCC No.3768。
所述的液體培養(yǎng)基包括有在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋 芋淀粉廢水中加入硫酸銨l_2g，磷酸0.5-lml，用的石灰水調(diào)pH 7.2-7.5。
實施例2:見圖1，一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌 液體菌劑的制備方法，其有如下步驟
A. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培 養(yǎng)
a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨 0.2-0.6%,瓊脂粉1_3%、無菌水80-120ml，加熱溶解后，用1 %的氫氧化鈉調(diào)pH值至 7.0-7.5，經(jīng)110-114°C，30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下分裝于15 X 1.5cm的干 燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備用；
b. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌菌種的培養(yǎng)分別取巨大芽孢桿 菌、膠凍樣芽孢桿菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條件下，轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培 養(yǎng)基上，經(jīng)觀_321、24-48小時培養(yǎng)，即得瓊脂斜面菌種，為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽 孢桿菌一級菌種；
B.所述土著益生圓褐固氮菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)
a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備磷酸二氫鉀0.01-0.03%，硫酸鎂0.01-0.03%， 氯化納0.01-0.03%，碳酸鈣0.4-0.6%，甘露醇0.8-1.2%，硫酸鈣0.08-0.12 %，瓊脂 1.8-2.2%,水80-120毫升，加熱溶解用1 %的氫氧化納調(diào)pH值6.8-7.0，經(jīng)110_114°C， 30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下，分裝于15 X 1.5cm干燥滅菌的試管擺成斜面待 凝固后備用；
b. 土著益生圓褐固氮菌菌種的培養(yǎng)取土著益生圓褐固氮菌的母種瓊脂斜面 菌，在無菌條件下轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)觀_321，48-32h，即得瓊脂 斜面菌種，為圓褐固氮菌一級菌種；
C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及 液體菌種的培養(yǎng)
(1)試管液體菌種的培養(yǎng)，取新鮮豆腐廢水經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液 100ml，加入(NH4)2SO4 O.lg, H3PO4 0.05ml,充分溶解后調(diào)節(jié)PH至7.0 7.5，分裝于 500ml三角燒瓶中，經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種巨大芽孢桿菌、 膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌一級菌種于試管液體培養(yǎng)基中，經(jīng)觀 32°C培養(yǎng)M 48 小時，即為試管液體菌種(二級菌種)。
(2)三角燒瓶液體菌種的培養(yǎng)
取新鮮豆腐廢水經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 Ig, H3P040.5ml,充分溶解后調(diào)節(jié)PH至7.0 7.5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子 總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將試管液體菌種接種在液體 三角燒瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)觀 321培養(yǎng)M 48小時，即為液體三角燒瓶菌種(三級菌種)
(3)液體擴大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種
取新鮮豆腐廢水經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO4 10g, H3PO4 5ml,充分溶解后調(diào)節(jié)PH至7.0 7.5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量 為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將三級菌種接種在液 體三角燒瓶培養(yǎng)基中，上搖床振蕩培養(yǎng)，振幅為100 120Γ/η ι，經(jīng)溫度^ 32°C培養(yǎng) 18 M小時發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為四級菌種。
(4)取四級菌種再擴大培養(yǎng)，上發(fā)酵罐，所用新鮮豆腐廢水不滅菌，將重量百分 比為55%的巨大芽孢桿菌、35%的膠凍樣芽孢桿菌和10%的圓褐固氮菌三菌培養(yǎng)液接入7后，經(jīng)觀 321培養(yǎng)18 M小時，通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵液即為巨大芽孢桿菌、 膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液，活細胞數(shù)為1.0 2.0X 101°個/ml ；
(5)根據(jù)需要可逐級擴大產(chǎn)量。
實施例3:見圖1，一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌 液體菌劑的制備方法，其有如下步驟步驟A-B與實施例2相同，
C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及 液體菌種的培養(yǎng)
(1)試管液體菌種的培養(yǎng)，取新鮮粉絲廢水100ml，加入(NH4)2S04 O.lg，H3PO4 0.05ml，充分溶解后調(diào)節(jié)PH至7.0 7.5，分裝于15X 1.2cm的干燥試管中，經(jīng)112°C， 30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌 一級菌種于試管液體培養(yǎng)基中，經(jīng)觀 321培養(yǎng)M 48小時，即為試管液體菌種(二 級菌種)。
(2)三角燒瓶液體菌種的培養(yǎng)
取新鮮粉絲廢水1000ml，WA(NH4)2SO4Ig, H3PO4 0.5ml,充分溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0 7.5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分 鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將試管液體菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)觀 32°〇 培養(yǎng)M 48小時，即為液體三角燒瓶菌種(三級菌種)。
(3)液體擴大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種
取新鮮粉絲廢水10000ml，WA(NH4)2SO4IOg, H3PO4 5ml,充分溶解后調(diào)節(jié) pH至7.0 7.5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C， 30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將三級菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，上搖床振蕩 培養(yǎng)，振幅為100 120r/mte，經(jīng)溫度28 32°C培養(yǎng)18 M小時發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液 為四級菌種。
(4)取四級菌種再擴大培養(yǎng)，上發(fā)酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分 比為65%的巨大芽孢桿菌、30%的膠凍樣芽孢桿菌和5%的圓褐固氮菌三菌培養(yǎng)液接入 后，經(jīng)觀 321培養(yǎng)18 M小時，通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其成熟的發(fā)酵液即為巨大芽孢 桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液，活細胞數(shù)為0.8 1.8X 101°個/ml ；
(5)根據(jù)需要可逐級擴大產(chǎn)量。
實施例4: 一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌 劑的制備方法，其有如下步驟步驟A-B與實施例2相同，
C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及 液體菌種的培養(yǎng)
(1)試管液體菌種的培養(yǎng)，取新鮮玉米淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上 清液100ml，加入(NH4)2SO4 O.lg，H3PO4 0.05ml,充分溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0 7.5，分裝于15X 1.2cm的干燥試管中，經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種巨大 芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌一級菌種于試管液體培養(yǎng)基中，經(jīng)觀 32°〇培 養(yǎng)M 48小時，即為試管液體菌種(二級菌種)。
(2)三角燒瓶液體菌種的培養(yǎng)
取新鮮玉米淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 lg, H3PO4 0.5ml,充分溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0 7.5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將試管液 體菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)觀 321培養(yǎng)M 48小時，即為液體三角燒 瓶菌種(三級菌種)。
(3)液體擴大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種
取新鮮玉米淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液10000ml，加入 (NH4)2SO4IOg, H3PO4 5ml,充分溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0 7.5，分裝于500ml三角燒瓶中， 分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將三級菌種 接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，上搖床振蕩培養(yǎng)，振幅為100 120r/min，經(jīng)溫度觀 32°C培養(yǎng)18 M小時發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為四級菌種。
(4)取四級菌種再擴大培養(yǎng)，上發(fā)酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分 比為60%的巨大芽孢桿菌、32%的膠凍樣芽孢桿菌和8%的圓褐固氮菌三菌培養(yǎng)液接入 后，經(jīng)觀 321培養(yǎng)18 M小時，通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其成熟的發(fā)酵液即為巨大芽孢 桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液，活細胞數(shù)為1.2 2.2 X IOltl個/ml;
(5)根據(jù)需要可逐級擴大產(chǎn)量。
實施例5:見圖1，一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌 液體菌劑的制備方法，其有如下步驟步驟A-B與實施例2相同，
C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及 液體菌種的培養(yǎng)
(1)試管液體菌種的培養(yǎng)，取新鮮洋芋淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上 清液100ml，加入(NH4)2SO4 O.lg，H3PO4 0.05ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0 7.5，分裝于15 X 1.2cm的干燥試管中，經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種巨大 芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌一級菌種于試管液體培養(yǎng)基中，經(jīng)觀 32°〇培 養(yǎng)M 48小時，即為試管液體菌種(二級菌種)。
(2)三角燒瓶液體菌種的培養(yǎng)
取新鮮洋芋淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液1000ml，加入 (NH4)2SO4 lg, H3PO4 0.5ml,充分溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0 7.5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將試管液 體菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)觀 321培養(yǎng)M 48小時，即為液體三角燒 瓶菌種(三級菌種)
(3)液體擴大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種
取新鮮洋芋淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液10000ml，加入 (NH4)2SO4IOg, H3PO4 5ml,充分溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0 7.5，分裝于500ml三角燒瓶中， 分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將三級菌種 接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，上搖床振蕩培養(yǎng)，振幅為100 120r/min，經(jīng)溫度觀 32°C培養(yǎng)18 M小時發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為四級菌種。
(4)取四級菌種再擴大培養(yǎng)，上發(fā)酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分 比為60%的巨大芽孢桿菌、35%的膠凍樣芽孢桿菌和5%的圓褐固氮菌三菌培養(yǎng)液接入 后，經(jīng)觀 321培養(yǎng)18 M小時，通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其成熟的發(fā)酵液即為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液，活細胞數(shù)為1.2 2.2 X IOltl個/ml;
(5)根據(jù)需要可逐級擴大產(chǎn)量。
實施例6: —種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌 劑在農(nóng)作物和植物生長劑的應(yīng)用。
本發(fā)明液體菌劑在以灰鈣土和鹽堿土為試驗土壤的試驗效果
用苜蓿種籽做盆栽試驗，經(jīng)三次重復(fù)其結(jié)果見表1、表2、表3、表4和表5:
表 1
項目試驗處理試驗組生長期間施用本發(fā)明菌劑對照組生長期間不施用菌劑
表2灰鈣土盆栽生長期觀察
項目出苗時間出苗率三葉期苗高(d)(%)(d)(cm)試驗組394186.2對照組484214. 5
試驗組與對照組不論出苗時間、出苗率、三葉期、苗高均有顯著提高。
表3鹽堿土盆栽生長期觀察
項目出苗時間出苗率三葉期苗高(d)(%)(d)(cm)試驗組466203.2對照620252. 5
試驗組與對照組不論出苗時間、出苗率、三葉期、苗高均有顯著提高。
表4灰鈣土盆栽苜蓿根系觀察
項目根系長度根系數(shù)體積鮮重(cm)(根)(era3)(Kg)試驗組7.970.000020.01314對照組4.840.000010. 00726
試驗組與對照組不論根系長度、根系數(shù)、體積、鮮重均有顯著差異。
表5鹽堿土盆栽苜蓿根系觀察
項目根系長度根系數(shù)體積鮮重(cm)(根)(cm3)(Kg)試驗組4.270.0000080. 00811對照組3. 240.0000060. 00521
試驗組與對照組不論根系長度、根系數(shù)、體積、鮮重均有顯著差異。10
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神 和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，其特征在 于由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)、圓 褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)和液體培養(yǎng)基組成，其三種菌株的重量百分比為巨 大芽孢桿菌為55 65%、膠凍樣芽孢桿菌為30 35%、圓褐固氮菌5 10%，所述的 巨大芽孢桿菌的保藏號為CGMCC No.3770 ；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號為CGMCC No.3769 ；所述的圓褐固氮菌的保藏號為CGMCCNo.3768。
2.如權(quán)利要求1所述的土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌 齊IJ，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基包括有在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢 水或洋芋淀粉廢水中加入硫酸銨l_2g，磷酸0.5-lml，用1 %的石灰水調(diào)pH值7.2-7.5。
3.—種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑的制備方 法，其特征在于有如下步驟A.土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨0.2_0.6%、瓊 脂粉1_3%、無菌水80-120ml，加熱溶解后，用1 %的氫氧化鈉調(diào)pH值至7.0-7.5，經(jīng) 110-114°C, 30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下分裝于15X 1.5cm的干燥滅菌的試 管擺成斜面待凝固后備用；b.土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌菌種的培養(yǎng)分別取巨大芽孢桿菌、 膠凍樣芽孢桿菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條件下，轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基 上，經(jīng)28-32°C、24-48小時培養(yǎng)，即得瓊脂斜面菌種，為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿 菌一級菌種；B.所述土著益生圓褐固氮菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備磷酸二氫鉀0.01-0.03%，硫酸鎂0.01-0.03%，氯化納 0.01-0.03%,碳酸鈣 0.4-0.6%，甘露醇 0.8-1.2%，硫酸鈣 0.08-0.12%，瓊脂 1.8-2.2%， 水80-120毫升，加熱溶解用的氫氧化納調(diào)pH值6.8-7.0，經(jīng)110-114°C，30-35分鐘 蒸汽滅菌，然后在無菌條件下，分裝于15X1.5cm干燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備 用；b.土著益生圓褐固氮菌菌種的培養(yǎng)取土著益生圓褐固氮菌的母種瓊脂斜面菌，在 無菌條件下轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32°C，48-32h，即得瓊脂斜面菌 種，為圓褐固氮菌一級菌種；C土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及液體 菌種的培養(yǎng)a.液體培養(yǎng)基的制備在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢 水中加入硫酸銨l_2g，磷酸0.5-lml，用的石灰水調(diào)pH 7.0-7.5，分裝于500ml三角 燒瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然后經(jīng)110-112°C，30-35分鐘高壓滅菌，冷卻后備 用；b.分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌的一級菌種，在無菌條件 下，接種于液體培養(yǎng)液中，經(jīng)28-32°C、24-48小時培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為二級菌種；C.分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌的二級菌種再擴大培養(yǎng)，上 搖床振蕩培養(yǎng)，經(jīng)振幅100 120r/min、溫度28 32°C、18 24小時培養(yǎng)，其菌液為三級菌種；d.分別將重量百分比為巨大芽孢桿菌為55 65%、膠凍樣芽孢桿菌為30 35%、圓 褐固氮菌為5 10%三級菌種再擴大培養(yǎng)，三種菌在同一個發(fā)酵罐，經(jīng)28-32°C、18-24 小時的通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其菌液為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌混合 菌劑，即為四級菌種，然后繼續(xù)逐級擴大培養(yǎng)。
4. 一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑在農(nóng)作物和 植物生長劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及微生物的菌劑制備方法，尤其涉及利用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢液制備巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌三菌組合的液體菌劑的制備方法。一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，其主要特點在于由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)、圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和液體培養(yǎng)基組成，其三種菌株的重量百分比為巨大芽孢桿菌為55～65％、膠凍樣芽孢桿菌為30～35％、圓褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢桿菌的保藏號為CGMCC No.3770；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號為CGMCC No.3769；所述的圓褐固氮菌的保藏號為CGMCC No.3768。本發(fā)明的優(yōu)點是用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢液為原料，生產(chǎn)過程無“三廢”污染，生產(chǎn)工藝簡單，操作方便，節(jié)省人力，節(jié)省能源，其液體菌劑，既可用于有機廢水凈化劑，又可作為微生物肥料和微生物飼料。
文檔編號C12N1/20GK102021118SQ20101023142
公開日2011年4月20日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者孫榮高, 李春杰, 柴青, 趙瑾, 鐘芳 申請人:蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 蘭州市南北兩山環(huán)境綠化工程指揮部, 甘肅求實生物工程有限公司