專利名稱：一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光pcr的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及核酸擴增PCR技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種減少乃至不與引物聚合的水解探針實時熒光PCR技術(shù)。
背景技術(shù)：
核酸擴增PCR技術(shù)是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的進步而一起發(fā)展、成熟的，早在1971 年，Korana就提出了核酸體外擴增的設(shè)想“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。1983年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis在研究核酸測序方法時產(chǎn)生了核酸擴增的靈感于試管中模擬天然的DNA體內(nèi)復(fù)制過程。提供一種合適的條件一模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間，就可成幾何級數(shù)地擴增已知兩端序列的一段DNA分子。經(jīng)過一系列探索、發(fā)展和耐熱聚合酶、熱循環(huán)儀的發(fā)明、應(yīng)用，Cetus公司于1987年申請了首個PCR發(fā)明專利(US Patent 4,683,202)。各種PCR技術(shù)以其獨有的靈敏度、簡便而成為生命科學(xué)研究的核心基礎(chǔ)技術(shù)，但這些終末PCR不能精確定量和擴增產(chǎn)物再污染的難題，常規(guī)PCR加產(chǎn)物凝膠電泳檢測方法不適用于臨床檢驗等應(yīng)用檢測。1992年Higuchi等首次提出了采用動態(tài)PCR方法和封閉式熒光檢測方式對目的基因數(shù)量進行分析，為解決傳統(tǒng)PCR的難題提出了新思路。實時熒光 PCR定量分析是通過實時檢測擴增產(chǎn)物量(產(chǎn)物標(biāo)記熒光強度)與起始靶基因量直接相關(guān)而定量。擴增產(chǎn)物量增加的熒光信號達到對數(shù)期的循環(huán)數(shù)Ct值(Cycle threshold)與靶模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在負相關(guān)線性關(guān)系。即起始模板稀釋一倍達到同樣對數(shù)期熒光強度所需的擴增循環(huán)就要增加一個循環(huán)數(shù)(Ct)。擴增產(chǎn)物增加的信號既可通過產(chǎn)物DNA熒光染料顯示，又可采用帶淬滅基團的熒光探針來檢測。被淬滅的熒光探針即可以通過降解而激活，如1995年美國PE公司研制出了 Taq酶水解的熒光標(biāo)記探針及實時熒光定量PCR技術(shù) (Livak KJ, et al.，1995，Genome Res 4 :357-362)，于 1997 年申請了水解探針(商品名 TaqMan) PCR發(fā)明專利(US Patent6, 485，903)，以及Epoch公司在水解熒光探針基礎(chǔ)上增加結(jié)合效率的MGB探針(US Patent7, 205，105)。被淬滅的熒光探針也可以通過二級結(jié)構(gòu)改變而激活，分子信標(biāo)Molecular beacon(Tyagi S，et al, 1996,Nat Biotechnol 14:303—308) 正是這樣一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雜交探針，于1999年申請了 Molecular beacon發(fā)明專利(US Patent 05925517)。其它雙雜交(FRET)探針，蝎形(Scorpion)探針，Sunrise-Primer，Lux Pimers等使用范圍局限于一定的應(yīng)用，不明顯優(yōu)于水解探針TaqMan方法，且與本發(fā)明路線、原理不同。目前臨床檢驗使用最廣的是水解探針TaqMan實時熒光PCR，而基礎(chǔ)科研還是廣泛使用基于熒光染料STOR Green I的實時熒光PCR。常規(guī)PCR檢測終末反應(yīng)-平臺期擴增產(chǎn)物，一般只需擴增25至30個循環(huán)；而實時熒光PCR檢測的是對數(shù)初期的循環(huán)數(shù)Ct值，TaqMan等標(biāo)記探針PCR至少需要擴增40個循環(huán)，基于熒光染料STOR Green I的實時熒光PCR為了發(fā)揮更高靈敏度通常需要擴增45個循環(huán)。因此實時熒光PCR技術(shù)存在著更嚴重的引物二聚體非特異性擴增問題，過量的一對引物3’末端互補延伸產(chǎn)生二聚體，再大量被非特異性擴增。引物二聚體一般借助3’末端多個互補堿基配對、互為引物延伸形成二聚體，引物對之間多個連續(xù)互補序列可通過常規(guī)引物設(shè)計方法避免，但有1-2個互補序列不可避免，由于DNA鏈可彎曲轉(zhuǎn)向，末端少數(shù)堿基互補可借助3’末端外的多個不連續(xù)互補堿基的合力結(jié)合、延伸產(chǎn)生二聚體，在隨后熱循環(huán)中以二聚體為模板結(jié)合引物大量非特異性擴增、并結(jié)合染料。在不加模板的基于染料STOR Green I實時熒光PCR實驗中，絕大多數(shù)一對引物產(chǎn)生二聚體的循環(huán)閾值(Ct值)一般在 30個循環(huán)左右，嚴重干擾低濃度靶分子定量和弱陽性誤讀。其實常被忽略的是TaqMan等探針實時熒光PCR亦存在引物二聚體問題，只是不見引物二聚體發(fā)射熒光，但會耗盡PCR系統(tǒng)成份，降低擴增效率。更嚴重的是TaqMan等探針與過量引物之間亦會雜交互補、延伸，在不加模板，僅加一對引物與iTaqMan探針的STOR Green I實時PCR的Ct值提前至25個循環(huán)左右，說明引物加探針PCR會形成一些“帶探針序列的二聚體、三聚體”，隨后非特異性擴增的“二、三聚體”競爭結(jié)合大量TaqMan探針，導(dǎo)致弱陽性模板不易結(jié)合探針而可能漏檢。為了減少或消除引物與探針結(jié)合、延伸的非特異性擴增干擾，本發(fā)明“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”整合了 5’端TaqMan探針的標(biāo)記，和3’端分子信標(biāo)Molecular Beacon的中間技術(shù)路線，其探針借助兩端互補序列自身結(jié)合，從而減少乃至不與引物聚合的水解探針熒光PCR技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服標(biāo)記探針與引物對間形成二聚體、三聚體造成的TaqMan實時熒光PCR的非特異性干擾靶擴增，以及非特異性竟?fàn)幗Y(jié)合導(dǎo)致弱陽性標(biāo)本容易漏檢的局限。本發(fā)明“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其綜合了水解熒光探針TaqMan和分子信標(biāo) Molecular Beacon的原理技術(shù)，探針5’端具有與水解熒光探針I(yè)1aqMan的相同作用機理，而其3’端類似分子信標(biāo)Molecular Beacon的莖環(huán)設(shè)計，提供了一種探針5’端序列完全與靶基因互補且末端標(biāo)記熒光素，探針3’端多加5-6baSe的與5’末端互補堿基，可與5’末端形成分子信標(biāo)樣的莖環(huán)結(jié)構(gòu)且末端標(biāo)記淬滅劑，通過探針自身結(jié)合從而大大減少探針與引物對間聚合的水解探針，和增強弱陽性檢出率的實時熒光PCR途徑。“ 一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其特征是一種TaqMan和 Molecular Beacon重新組合的新性能探針及實時熒光PCR技術(shù)，其探針采用5’酶解熒光探針，和3’末端添加的5’端互補序列形成雜交莖結(jié)構(gòu)而淬滅探針的實時熒光PCR檢測。所述的5’酶解熒光探針是指模板序列探針5’末端標(biāo)記熒光素且在PCR中可被DNA聚合酶外切酶活性水解，所述的3’末端添加的5’端互補序列形成雜交莖結(jié)構(gòu)而淬滅探針是指探針 3’末端多加5-6baSe的與5’端互補堿基且在最末端標(biāo)記淬滅劑，室溫下末端雜交形成鍋柄樣的莖結(jié)構(gòu)，因此淬滅劑緊靠熒光素而淬滅探針。所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其熒光探針設(shè)計策略原則是首先選取一段小于40nt的靶熒光探針序列并遵守一般常規(guī)熒光探針設(shè)計所有原則， 再在其3’末端多加5-6baSe的與5’端互補堿基呈廻文方式排列，且在最末端標(biāo)記淬滅劑 TAMRA (6-羧基-四甲基-羅丹明rhodamine)，則探針5，端可選擇標(biāo)記熒光素FAM、HEX或 TET ；標(biāo)記淬滅劑Dabcyl [4-(4' - 二甲氨基苯基偶但氮)安息香酸]則可選擇多種熒光素， 從而可進行一個反應(yīng)中同時監(jiān)測多種不同靶分子的多元(重)實時熒光PCR。
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所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其探針(ft~0be)3’末端淬滅劑還可選擇一種非熒光淬滅劑和小溝結(jié)合分子(Minor Groove Binding，MGB)，或自身二級結(jié)構(gòu)淬滅Lux 引物樣的Probe和探針莖結(jié)構(gòu)含1_2個RNA樣的鎖核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)堿基對的淬滅劑。所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其熒光PCR引物含2-7 個RNA/RNA樣的鎖核酸(LNA)替換堿基可相應(yīng)減少自身聚合并增加引物結(jié)合力；探針模板序列含2-6個RNA樣的鎖核酸(LNA)替換堿基可大大減少探針序列長度。所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其實驗條件同于一般常規(guī)TaqMan探針實時熒光PCR反應(yīng)體系。為了更進一步增加擴增特異性和減少循環(huán)前低溫非特異性反應(yīng)，聯(lián)合采用各種熱啟動DNA聚合酶，化學(xué)修飾耐熱聚合酶或加熱緩釋Mg2+緩沖液等各種PCR優(yōu)化方法，將更加極大地完善本發(fā)明帶有莖末端的水解探針實時熒光PCR質(zhì)量。所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其帶有莖末端的水解探針設(shè)計策略應(yīng)用于計算機軟件程序編寫，提高大規(guī)模熒光探針及基因檢測方法設(shè)計時的效率。所述的“一種減少與引物聚合的水解探針熒光PCR”，其技術(shù)用于基因檢測試劑盒， 盒成份包括核酸提取試劑，IOmM dNTPs，Taq等DNA聚合酶及其緩沖液，(/逆轉(zhuǎn)錄酶及其緩沖液)，熒光探針，上游引物F/下游引物R，標(biāo)準對照物，純化水dH20，礦物油。本發(fā)明“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，目的是為減少實時熒光 PCR短Oligo間聚合并非特異性擴增的干擾，通過將TaqMan探針3’末端多加5_6個與其 5’末端互補的堿基(base)而增加自身相互結(jié)合、減少與引物Oligo聚合，改善TaqMan實時熒光PCR檢測質(zhì)量。在一般PCR反應(yīng)體系中，既存在引物與靶模板結(jié)合的特異性擴增，亦存在過量引物與引物，或引物與探針等短Oligo雜交、延伸的聚合體非特異性擴增，這種非特異性擴增一般在30個左右熱循環(huán)開始進入對數(shù)增長期，非特異性擴增開始嚴重起來，對于一般PCR 而言，30個熱循環(huán)擴增產(chǎn)物量足夠用了，大多PCR可以結(jié)束了，如果沒有二聚體擴增產(chǎn)物的污染以及污染被反復(fù)擴增，引物二聚體對于大多數(shù)30個熱循環(huán)以內(nèi)的PCR影響不太大。而實時熒光PCR第30-40個熱循環(huán)正位于其黃金檢測窗口期，因此嚴重干擾低濃度靶分子精確定量和弱陽性標(biāo)本準確定性。引物二聚體的形成是因為過量的一對引物3’末端存在互補序列而雜交、并互為引物延伸產(chǎn)生引物二聚體，在隨后熱循環(huán)中以二聚體為模板非特異性指數(shù)擴增，大量產(chǎn)生引物二聚體DNA。引物對3’末端存在的多個連續(xù)互補堿基可通過常規(guī)引物設(shè)計原則而避免，但由于核酸DNA僅由4種堿基排列組合，核酸Oligo末端有1-2個互補堿基就無法避免；由于DNA單鏈易彎曲轉(zhuǎn)向，引物對3’末端1-2個互補堿基雖不夠獨立形成穩(wěn)定氫鍵，但仍可借助引物轉(zhuǎn)向后3’末端外的多個互補堿基包括多個不連續(xù)互補堿基的氫鍵合力而結(jié)合，延伸數(shù)個堿基后產(chǎn)生穩(wěn)定的互補序列，進而產(chǎn)生完整的引物二聚體。 引物二聚體雖不直接干擾TaqMan探針工作，但其競爭性地消耗PCR試劑成份包括引物、聚合酶、酶底物等，顯著降低擴增效率，進一步減低TaqMan實時熒光PCR檢測靈敏度。TaqMan等探針實時熒光PCR反應(yīng)中，過量的一對引物還會與過量的較長探針雜交聚合，首先產(chǎn)生兩種引物與探針序列雜交、部分延伸的不完整二聚體，兩種不完整二聚體再在PCR熱循環(huán)反應(yīng)中互為引物而雜交、延伸并被大量非特異性指數(shù)擴增，產(chǎn)生帶部分探針序列的“引物-部分探針-引物”三聚體。一般探針序列兩末端的標(biāo)記率均只有70% -80% 左右，剩余20%的3’末端羥基游離的探針Oligo會直接與兩種引物3’末端雜交、延伸并大量指數(shù)式擴增，產(chǎn)生非特異性擴增的“引物-探針”二聚體。帶部分探針序列的二聚體、 三聚體將與特異性靶分子競爭結(jié)合熒光標(biāo)記TaqMan探針，部分探針序列的竟?fàn)幗Y(jié)合并不能使其5’端標(biāo)記熒光基團被水解，但是減少了 TaqMan探針與特異性靶分子結(jié)合幾率從而也就減少了 TaqMan探針5’端特異性水解，降低了系統(tǒng)檢測靈敏度，造成弱陽性標(biāo)本不被檢出、有漏檢的可能。水解探針TaqMan是一種實時熒光PCR檢測寡核苷酸探針，它設(shè)計為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對并盡量靠近一端引物，但又不重疊(間隔一個堿基以上)的一段寡核苷酸(<40nt)，其5’末端標(biāo)記熒光基團，淬滅劑TAMRA (6-羧基-四甲基-羅丹明rhodamine)則連接在3’末端。當(dāng)探針完整時，通過Filter共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) 作用，因熒光基團發(fā)射的熒光與淬滅劑的接近而被抑制、產(chǎn)生熒光淬滅效應(yīng)。當(dāng)PCR反應(yīng)時，完整的探針先與目標(biāo)序列配對雜交，當(dāng)引物退火延伸，新合成的DNA鏈接近探針雜交位置時，DNA聚合酶利用其所帶的外切酶活性將探針切開，使報告熒光基團釋放到反應(yīng)緩沖液中，當(dāng)熒光基團與淬滅劑分離時就發(fā)出熒光，DNA鏈合成繼續(xù)進行，直到擴增循環(huán)結(jié)束。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累，熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。分子信標(biāo)(Molecular Beacon)是一段雙重標(biāo)記的寡核苷酸Q5-40nt)，形成具有一個環(huán)(探針)和一個自身末端互補的莖(添加序列)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。熒光報告分子標(biāo)在5’ 末端，抑制作用范圍小的淬滅劑DabCyl[4-G’-二甲氨基苯基偶但氮)安息香酸]標(biāo)在3’ 末端。室溫條件下，分子信標(biāo)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光報告分子和淬滅劑通過信標(biāo)自身互補形成的莖結(jié)構(gòu)緊密靠近在一起，因而抑制了熒光信號。當(dāng)PCR變性后退火時，信標(biāo)遇到靶DNA鏈， 根據(jù)熱力學(xué)原理，信標(biāo)探針將與靶DNA結(jié)合而不是形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。由于莖結(jié)構(gòu)破壞，熒光報告分子與弱作用淬滅劑相對分離開，報告分子得以發(fā)射熒光。綜合水解探針和分子信標(biāo)技術(shù)原理，本發(fā)明“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”是帶有末端莖結(jié)構(gòu)的水解熒光探針及其實時熒光PCR，技術(shù)線路見附圖1并與 TaqMan, Molecular Beacon的比較。帶有莖末端探針設(shè)計為5’端探針序列與目標(biāo)基因上游引物和下游引物之間的序列配對，而其3’末端在常規(guī)TaqMan序列基礎(chǔ)上增加4_7個，優(yōu)選5-6個與5’末端互補的堿基并與5’末端成廻文方式排列，其探針兩末端在室溫下分子內(nèi)互補形成的莖結(jié)構(gòu)緊靠在一起，更多的情況是兩探針反向靠近、探針分子間兩末端互補形成探針二聚體，少量情況是探針分子間5’ -3’首尾互補形成探針多聚體，探針自身末端互補結(jié)合就大大減少與引物聚合的可能。探針分子內(nèi)部任何4-6個廻文排列的堿基也可進一步增強自身結(jié)合力。熒光報告基團分子標(biāo)在探針5’末端，淬滅劑標(biāo)在3’末端，由于熒光分子-淬滅劑緊密靠近產(chǎn)生強熒光淬滅效應(yīng)，系統(tǒng)本底低。當(dāng)PCR反應(yīng)變性再退火時，探針遇到靶DNA鏈，根據(jù)熱力學(xué)原理，探針更易與靶DNA結(jié)合而不是自身結(jié)合，引物退火延伸后， 新合成的DNA鏈接近探針雜交位置時，DNA聚合酶利用其所帶的外切酶活性將探針5’端切開，使報告熒光基團釋放到反應(yīng)緩沖液中，當(dāng)熒光基團與淬滅劑分離時就發(fā)出熒光。探針3’ 末端標(biāo)記既可采用抑制作用強的TaqMan常用的TAMRA，相應(yīng)的報告熒光染料只有FAM、HEX
6和TET三種選擇，由于這些染料光譜重疊，限制了其在多元PCR中的應(yīng)用；又可使用分子信標(biāo)通用的弱淬滅劑Dabcyl，相應(yīng)的報告熒光染料就可有較多種的選擇，從而可在一個反應(yīng)中同時監(jiān)測不同的靶分子。本發(fā)明淬滅基團還可以有一些變通的發(fā)展1)帶有末端莖結(jié)構(gòu)的水解探針3’末端亦可連接一種非熒光淬滅劑和小溝結(jié)合分子(Minor Groove Binding, MGB)以增加莖結(jié)構(gòu)自身結(jié)合力度；2)帶有末端莖結(jié)構(gòu)的水解探針3’末端發(fā)夾序列還可設(shè)計為自身熒光淬滅(Lux 引物樣的)二級結(jié)構(gòu)序列LUXTMPr0be代替淬滅劑；3)帶有末端莖結(jié)構(gòu)的水解探針部分堿基可采用鎖核酸(Locked Nucleic Acid, LNA, Petersen Μ. &ffengel J.，et al.， Trends Biotechnol. 2003Feb,21(2) :74-81 禾口 Tran Tan ea al, Virology Journal 2010， 7 46)增加雜交親和力，莖結(jié)構(gòu)含1-2個LNA堿基可增加莖結(jié)構(gòu)自身結(jié)合力度，環(huán)結(jié)構(gòu)含 2-6個LNA堿基可相應(yīng)減少探針序列長度，結(jié)合DNA鏈的每個LNA堿基增加3° -5°C的Tm 值；結(jié)合RNA鏈的每個LNA堿基增加4° _8°C的Tm值。較短的LNA探針更有利于單堿基變異(SNP)的敏感檢測。當(dāng)設(shè)計帶有末端莖結(jié)構(gòu)的水解探針時首先也必需尊循常規(guī)TaqMan探針設(shè)計的一般原則1)探針的Tm值比引物的Tm值要高10°C以上；2)探針5’端不能是G堿基，被酶切降解的G仍具有淬滅報告熒光作用；3)探針中的G不能多于C ;4)避免單一核苷酸成串，尤其是G ;5)富含AT的序列要增加長度，以達到符合要求的Tm值，但探針必須< 40nt，否則淬滅效率低，反應(yīng)本底高；6)探針退火時，其5’端應(yīng)盡可能接近引物，同時又不重疊，離引物的3’端至少一個堿基遠；7)檢測單堿基變異(SNP)時，突變點盡量置于探針中間或靠近 5’端，探針盡可能短；8)探針做mRNA表達分析時，探針序列應(yīng)包括外含子/-/外含子邊界； 9)探針的3’端必須封閉以防止PCR擴增時延伸，本發(fā)明帶有末端莖結(jié)構(gòu)的水解探針增加了 5-6個堿基游離的3’末端，加上淬滅劑本身封閉，探針末端雙重封閉就不會延伸。帶有莖末端的水解探針實時熒光PCR操作本發(fā)明“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”是一種帶有末端莖結(jié)構(gòu)的水解TaqMan探針實時熒光PCR，其具體操作同于一般常規(guī)TaqMan探針實時熒光PCR反應(yīng)體系。樣本RNA/DNA模板常規(guī)方法制備，沒有特殊要求。反轉(zhuǎn)錄(RT)即可分步反應(yīng)，亦可與 PCR 一步反應(yīng)?？焖贆z測選擇一步RT-PCR單管反應(yīng)，單管加入兩種不同的酶，即用于RT的反轉(zhuǎn)錄酶(如AMV或M-MLV突變體、Superscript ΙΙ/Supei^cript反轉(zhuǎn)錄酶等)，用于實時 PCR的熱穩(wěn)定DNA聚合酶(如TaqJaq Plus等)。熱穩(wěn)定DNA聚合酶活性在反轉(zhuǎn)錄過程中被其抗體所抑制，進入PCR過程的高溫變性使反轉(zhuǎn)錄酶失活，同時也使熱穩(wěn)定DNA聚合酶抑制抗體失活，使擴增反應(yīng)順利進行。還有一種策略是使用既具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，又具有DNA 聚合酶活性的Tth耐熱聚合酶。DNA/cDNA實時熒光PCR單個反應(yīng)模板(Template)10 μ 1上游引物F(5yM)0. 5μ 1下游引物R(5yM)0. 5μ 1IOmM dNTP0. 5 μ 1IOXTaq buffer2. 5 μ 1Taq0. 5 μ 1
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莖結(jié)構(gòu)水解探針(2. 5 μ Μ)0. 5 μ 1dHgO_10 μ 125 μ 1實際操作時，首先配制不加樽板的100次X 15 μ 1 = 1. 5ml反應(yīng)混合液，既每個成份加100倍單個反應(yīng)體積，混勻，平行分裝96 X 15 μ 1于96孔板或0. 2ml的PCR反應(yīng)管，每孔或每管再分別加10 μ 1標(biāo)本DNA/RNA或模擬標(biāo)準品。每個檢測可平行3份X 25 μ 1計平均Ct值。標(biāo)準曲線模擬標(biāo)準(1μ g/ml) X 1(Γ2，X 1(Γ3，X 1(Γ4，X 1(Γ5，X 1(Γ6，X 1(Γ7，X 1(Γ8稀釋。上實時熒光PCR儀(西安天隆公司TL988、TL988-II型禾Π MJ Inc. DNA Engine 0ption 2)。首先變性94 °C 4分鐘，然后40個循環(huán)，95 V 20秒，(可加74 V 10秒)， 54-600C 45-60秒，(可加72°C 10秒)。于M_60°C讀取熒光值。本發(fā)明優(yōu)點(1)沒有引物二聚體非特異擴增干擾，檢測特異性更準確，尤其是弱陽性標(biāo)本不易漏檢。(2)探針熒光標(biāo)記緊密靠近淬滅基團，熒光信號本底明顯低于TaqMan探針本底。(3)酶解的熒光分子被徹底游離，檢測靈敏度又明顯高于分子信標(biāo)Molecular Beacon ^ff0(4)探針5’端可標(biāo)記多種波長熒光分子，適用多元(多重)靶檢測及多熒光通道儀器擴增分析。(5)聯(lián)合采用LNA不僅極大改善探針結(jié)合性能，更能適合基因多態(tài)性及單核苷酸變異檢測。


圖1.為I^aqMaruMolecular Beacon和本發(fā)明帶莖末端水解探針三種技術(shù)比較圖， A.左邊示意TaqMan、右邊示意Molecular Beacon ；B.代表帶莖末端水解探針自身結(jié)合情況及PCR原理。其中，長直線示意模板，短箭頭代表引物及合成方向，〇代表熒光分子， 代表淬滅劑。圖2.為HBV實時熒光PCR標(biāo)準曲線及部分陽性結(jié)果，圖2A.為實時原始數(shù)據(jù)曲線， 圖2B.為程序分析Ct值曲線。圖3.為HEV實時熒光PCR試驗分析，A.為實時監(jiān)測原始曲線，B.為程序分析Ct
值曲線。
具體實施例以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、條件、步驟及應(yīng)用所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。實例一人乙型肝炎病毒實時熒光PCR檢測乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)由乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)引起的一種世界性的傳染性疾病。在我國人群中乙肝感染率非常高，極大的危害了人們的身體健康。目前乙肝的檢測方法主要有酶免疫法、放免法、化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法、核酸擴增 (PCR)熒光定量法等。酶免疫法應(yīng)用較廣，但是實時熒光PCR分析法可以精確測定乙型肝炎病人的病毒基因，對感染者病毒復(fù)制水平的判斷，病情傳染性及抗病毒藥物療效監(jiān)測具有無法替代的重要作用。選取乙型肝炎病毒(HepatitisB virus, HBV)X g (1545-1887)序列如下加粗部分為保守區(qū)，劃線部分為實時熒光PCR擴增引物。將全長該序列克隆到 PUC19載體作為乙肝模擬陽性對照序列。AB493827X 區(qū)(1545-1887)CTCCCCGTCT GTGCCTTCTC ATCTGCCGGA CCGTGTGCACTTCGCTTCAC CTCTGCACGT AGCATGGAGA CCACCGGAACGCCCACCAG GTCTTGCCCA AGGTCTTACA CAAGAGGACTCTTGGACTCT CAGCAATGTC AACGACCGAC CTTGAGGCATACTTCAAAGA CTGTTTGTTT AAAGACTGGG AGGAGTTGGGGGAGGAGATT AGGTTAAAGG TCTTTGTACT AGGAGGCTGTAGGCATAAAT TGGTCTGTTC ACCAGCACCA TGCAACTTTTTCCCCTCTGC CTAATCATCT CATGTTCATG TCCTACTGTTCAAGCCTCCA AGCTGTGCCT TGG (343bp)HBV實時熒光PCR檢測引物設(shè)計，引物對序列如下rHBXF 5' -cac ttc get tea cct ctg_3，rHBXR 5' -tat gcc tac age ctc cta_3，(t 采用 LNA)探針序列如下gg agg aga tta ggt taa agg tct ttg，采用其反意鏈并加3’末端苯結(jié)構(gòu)堿基，HBTaqManX :5，-FAM caa aga cct tta acc taa tct cct cc tct ttR TAMRA-3，(1)臨床血標(biāo)本DNA提取取全血200 μ 1，加等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇 (25 24 1)抽提一次，再氯仿抽提一次，上清加3倍的DNA結(jié)合緩沖液(6Μ碘化納NaI) 移至商業(yè)DNA純化柱(質(zhì)粒小提純化柱，詳細步驟按Qiagen/Tiagen說明書進行)，洗滌緩沖液(含70% EtOH的2M NaI液)洗柱兩次，加40 μ 1 dH20洗脫收集純化的樣本。大量體積酚-氯仿抽提液須加1/10體積的3M乙酸鈉(pH5. 2)和2. 5倍無水乙醇或等體積的異丙醇沉淀。(2)實時熒光PCR定量反應(yīng)
標(biāo)本 DNA(Template)10 μ 1
rHBXF(5 μ Μ)0. 5μ 1
rHBXR (5 μ Μ)0. 5μ 1
IOmM dNTP0. 5μ 1
IOXTaq buffer2. 5μ 1
Taq0. 5μ 1
HB-TaXman(2. 5 μ Μ)0. 5μ 1
dH,010 μ 1
25 μ 1實際操作時，首先配制不加M扳的反應(yīng)混合液，混勻，平行分裝15 μ 1于96孔板或 0. 2ml的PCR反應(yīng)管，每孔或每管再加10 μ 1標(biāo)本DNA，最后再小心加20-25 μ 1礦物油于反應(yīng)表面封閉PCR反應(yīng)管。每個檢測可平行3份X 25 μ 1計平均Ct值，分析統(tǒng)計結(jié)果。上實時熒光PCR儀(西安天隆公司TL988型和MJ Inc. DNA Engine 0ption 2)，按說使用明書操作。首先變性94°C 4分鐘，然后40個循環(huán)，95°C 20秒，(可加72°C 10秒)， 54-56 0C 45-60秒，(可加72 °C 10秒)。于M_56°C讀取熒光值。(3)實驗結(jié)果(見圖2)分析圖2為中檢所乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量標(biāo)準品(批號0711)定量參考品L1-L5 標(biāo)準曲線和部分陽性參考品結(jié)果。A.為實時監(jiān)測曲線，B.為程序分析Ct值曲線實驗結(jié)果， 其濃度與測量Ct值線性關(guān)系較好，陽性參考品全部有Ct值，陰性參考品全為基線反應(yīng)。多次重復(fù)性非常好。實例二 人腸道病毒致病株實時熒光PCR檢測近年手足口病開始在我國幼兒中大規(guī)模流行，且病死率高。其病原腸道病毒 (Enterovirus, EV)的核酸實時熒光PCR檢測成為控制其傳染流行的關(guān)鍵手段，腸道病毒EV 最初分為60種以上不同的血清型、包括腸道病毒68-71型?；谄浜怂嵝蛄蟹诸悾薊V又分為 A、B、C、D 和 PolioVirus 五類，其中主要致病株 Coxsackie A16(CA16)、Enterovirus 71型(EV71)被歸為人腸道病毒A型。腸道病毒EV基因變異大，僅5’ UTR保守，有三段所有株MMM^E，發(fā)表的EV通用引物均選擇此保守區(qū)因而誤檢非致病株，只能作為總EV鑒別檢測；EV71型鑒別引物選變異大的VP1區(qū)又嚴重漏檢。如EV71 (SHZH98 株)5，UTR 同源保守區(qū)421 cgaaaaatct actgagctag ttagtagtcc tccggcccct gaatgcggct aatccCaact481 gcggagcaca cgccctcaag ccagcgggta gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga541 accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttatctttat attggctgct tatggtgaca att腸道病毒基因組反復(fù)比對，發(fā)現(xiàn)在nt 434-448gagctag ttagtagtcc tc為致病株CA16和EV71高度同源區(qū)可作為致病株檢測上游引物，選取第二段所有株保守區(qū)nt 538-557ga accgactact ttgggtg為逆轉(zhuǎn)錄和下游引物，第一段所有株保守區(qū)nt 458-481cct gaatgcggct aatcccaact g 3，末端加莖結(jié)構(gòu)ttc agg序列作為水解探針，且其 nt476位出現(xiàn)C大多為EV71株；T為CA16株。所以，即EV致病株P(guān)CR引物如下REV3F :5，-gag cta gtt agt agt cct c_3，(t 采用 LNA)REV3R 5' -C acc caa agt agt egg ttc_3，帶末端莖結(jié)構(gòu)的致病株通用探針如下EVTaqMan 5' -FAM cct gaa tgc ggc taa tcc Yaa ctg_ttc_agg TAMRA-3‘致病性CA16和EV71株二元(/ 二重)實時熒光PCR探針設(shè)計如下帶末端莖結(jié)構(gòu)的EV71株探針，TaqMan71 5' -FAM cct gaa tgc ggc taa tcc Caa ctg ttc agg Dabcy 1-3'(FAM :6_羧基-熒光素)
和帶末端苯結(jié)構(gòu)的CA16株探針，TaqMan 16 -JOE cct gaa tgc ggc taa tcc Taa ctg ttc agg D&bcyl_3，(JOE :6-羧基-4'，5' -二氯 _2'，7' - 二甲基熒光素)(I)RNA提取首選皰疹液、咽拭子，(或血液、腦脊液)，發(fā)病3天可選肛拭子或糞便浸出液(或細胞培養(yǎng)物)0. 1ml，糞便浸出液須自然沉淀10分鐘，取上清0. Iml (或0. Ig 固體標(biāo)本)加RNA裂解液Iml (0. 5ml的4M GTC液+0. 5ml水飽和酚)變性裂解，強烈漩渦振蕩，再加100 μ 1氯仿振蕩，最高速離心10分鐘，取上清加3Χ結(jié)合緩沖液(6Μ碘化納NaI) 移至商業(yè)硅膠純化柱(詳細操作按Qiagen/Tiangen公司說明書進行)，用洗滌緩沖液(含 70% EtOH的2M NaI液)洗柱兩次，加50 μ 1 DEPC處理的dH20洗脫、離心收集純化的RNA。 或裂解上清加等量異丙醇和1/10體積的2M醋酸鈉(PH4. 0)置-20°C 2小時再離心沉淀， 75%冷乙醇洗滌一次，加50 μ 1 DEPC處理的dH20溶解。


(GTC 液65°C溶解的 4M 異硫氰酸胍 +0. ImM DTT 和 0. 5% Sarkosyl (2) RT實時熒光PCR
逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光PCR兩步合并單管反應(yīng) 待測樽板CTeirolate)
上游正向引物F (5 μ M) 下游反向(RT)引物R(5 μ Μ) IOmM dNTP(dU 代替 dT) IOXTaq buffer Taq+rTth 酶水解探針(2. 5/5 μ Μ) RNase抑制劑
DEPC處理的dH。0_
10 μ 1 0. 5μ 1 0. 5μ 1
0.5μ 1 2. 5μ 1
1.0μ 1 0. 5μ 1 0. 5μ 1 9μ 1
25 μ 1
總體積
反應(yīng)液表面小心沿管壁再加20ul礦物油密閉！實際操作時，首先配制不加模板的100次X 15 μ 1 = 1. 5ml反應(yīng)混合液，既每個成份加100倍單個反應(yīng)體積，混勻，平行分裝96 X 15 μ 1于96孔板或0. 2ml的PCR反應(yīng)管，每孔或每管再分別加10 μ 1標(biāo)本DNA/RNA或模擬標(biāo)準品。每個檢測可平行3份X 25 μ 1計平均Ct值。標(biāo)準曲線模擬標(biāo)準(1μ g/ml) X 10_2，X 10_3，X 10_4，X 10_5，X 10_6，X 10_7，X 10_8 稀釋。上實時熒光PCR儀(西安天隆公司TL988、TL988-II型和MJ Inc. DNA Engine 0ption 2)。首先變性94 °C 4分鐘，然后40個循環(huán)，95 V 20秒，(可加74 V 10秒)， 54-56 0C 45-60秒，(可加72 °C 10秒)。于M_56°C讀取熒光值。(3)實驗結(jié)果(見圖3)分析標(biāo)準曲線及質(zhì)控將EV部分5’_UTR序列插入pUC19酶切載體、克隆生成pUC_EV3L 模擬陽性的質(zhì)粒定量對照，質(zhì)粒長2. 8kb,分子量麗=1.8X106,計算Ing = 3. 3X IO8Copy 分子。質(zhì)粒PUC-EV3L小提(Minipr印)制備DNA,測光密度OD260/OD280,按1個OD260值= 50 μ g/mlDNA計算含量，并用TE液稀釋成1 μ g/ml作為定量對照標(biāo)準品。
圖3為質(zhì)控模擬陽性的定量對照標(biāo)準曲線和部分陽性檢測結(jié)果。圖3A實時監(jiān)測原始數(shù)據(jù)曲線，圖3B為HEV實時熒光PCR程序分析Ct值實驗結(jié)果，樣本HEV濃度與測量Ct 值線性關(guān)系好，檢測準確可靠。
權(quán)利要求
1.“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其特征是一種TaqMan和 Molecular Beacon重新組合的一種整合新性能探針及實時熒光PCR技術(shù)，其探針采用5’酶解熒光探針技術(shù)，和3’末端添加的與5’端互補序列形成雜交莖結(jié)構(gòu)而淬滅探針的實時熒光PCR檢測技術(shù)。所述的5’酶解熒光探針是指模板序列探針5’末端標(biāo)記熒光素且在PCR 中可被DNA聚合酶外切酶活性水解，所述的3’末端添加的與5’端互補序列形成雜交莖結(jié)構(gòu)而淬滅探針是指探針3’末端多加4-7baSe的與5’端互補堿基且在最末端標(biāo)記淬滅劑， 室溫下末端雜交形成鍋柄樣的莖結(jié)構(gòu)，因此淬滅劑緊靠熒光素而淬滅探針。
2.根椐權(quán)力要求1所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其所述的 3’末端添加的與5’端互補序列形成雜交莖結(jié)構(gòu)而淬滅探針是指探針3’末端多加4-7t3aSe 的與5’端互補堿基優(yōu)選為多加5-6baSe的與5’端互補堿基且在最末端標(biāo)記淬滅劑，室溫下末端雜交形成鍋柄樣的莖結(jié)構(gòu)，因此淬滅劑緊靠熒光素而產(chǎn)生強淬滅作用。
3.根椐權(quán)力要求1所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其特征在于熒光探針設(shè)計策略原則是首先選取一段小于40nt的靶熒光探針序列并遵守一般常規(guī)熒光探針設(shè)計所有原則，再在其3’末端多加5-6baSe的與5’端互補堿基呈廻文方式排列， 且在最末端標(biāo)記淬滅劑TAMRA (6-羧基-四甲基-羅丹明rhodamine)，則探針5’端可選擇標(biāo)記熒光素FAM、HEX或TET ；標(biāo)記淬滅劑Dabcyl [4-G，-二甲氨基苯基偶但氮)安息香酸] 則可選擇多種熒光素，從而可進行一個反應(yīng)中同時監(jiān)測多種不同靶分子的多元(重)實時熒光PCR。
4.根椐權(quán)力要求1所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其特征在于探針(ftx)be)3’末端淬滅劑還可選擇一種非熒光淬滅劑和小溝結(jié)合分子(Minor Groove Binding, MGB)，或自身二級結(jié)構(gòu)淬滅Lux 引物樣的Probe和探針莖結(jié)構(gòu)含1_2個RNA樣的鎖核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)堿基對的淬滅劑。
5.根椐權(quán)力要求1所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其特征在于熒光PCR引物含2-7個RNA/RNA樣的鎖核酸(LNA)替換堿基可相應(yīng)減少自身聚合并增加引物結(jié)合力；探針模板序列含2-6個RNA樣的鎖核酸(LNA)替換堿基可大大減少探針序列長度。
6.根椐權(quán)力要求1所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其特征在于實驗條件同于一般常規(guī)TaqMan探針實時熒光PCR反應(yīng)體系。為了更進一步增加擴增特異性和減少循環(huán)前低溫非特異性反應(yīng)，聯(lián)合采用各種熱啟動DNA聚合酶，化學(xué)修飾耐熱聚合酶或加熱緩釋Mg2+緩沖液等各種PCR優(yōu)化方法，將更加極大地完善本發(fā)明帶有莖末端的水解探針實時熒光PCR質(zhì)量。
7.根椐權(quán)力要求1所述的“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”，其特征在于帶有莖末端的水解探針設(shè)計策略應(yīng)用于計算機軟件程序編寫，提高熒光探針及基因檢測方法設(shè)計的效率。
8.根椐權(quán)力要求1所述的“一種減少與引物聚合的水解探針熒光PCR”，其特征在于其技術(shù)用于基因檢測試劑盒，盒成份包括核酸提取試劑，IOmM dNTPS，Taq等DNA聚合酶及其緩沖液，(逆轉(zhuǎn)錄酶及其緩沖液)，熒光探針，上游引物F/下游引物R，標(biāo)準對照物，純化水 dH20，礦物油。
全文摘要
本發(fā)明“一種減少與引物聚合的水解探針實時熒光PCR”是一種吸取了分子信標(biāo)末端鍋柄樣的雜交莖結(jié)構(gòu)、增加自身結(jié)合的改良水解探針及實時熒光PCR。其特征是采用模板探針序列5’端常規(guī)標(biāo)記熒光素，而其3’端則添加5-6個探針5’末端的互補序列，再在最末端標(biāo)記淬滅劑，并與探針5’末端序列雜交形成分子信標(biāo)末端類似的莖結(jié)構(gòu)。探針兩末端自身雜交結(jié)合，不僅增加了淬滅效果，降低了本底；而且自身結(jié)合就不易與PCR引物聚合，消除了引物-探針非特異性聚合擴增，進而提高了水解探針實時熒光PCR的檢測靈敏度，尤其是增加了弱陽性標(biāo)本的檢出率。
文檔編號C12Q1/68GK102373267SQ20101024828
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者劉濤, 周勇, 廖同兵, 張寶林, 林昊宇, 江必勝, 江洪 申請人:北京泰格瑞分子檢驗有限公司