專利名稱：攜帶nk4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)發(fā)明領(lǐng)域，尤其是涉及一種攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的 制備方法及其攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在治療胃癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國胃癌年患病率和死亡率為世界平均水平的2倍多，且多數(shù)患者確診時(shí)已處于 進(jìn)展期。雖然早期胃癌的治療效果較為樂觀，但對進(jìn)展期胃癌而言，大多有淋巴和血行轉(zhuǎn) 移，相當(dāng)一部分患者確診時(shí)已失去手術(shù)時(shí)機(jī)，化療及綜合治療策略雖使其療效有所改善，但 整體療效欠佳。因此，有必要探索新的治療方法。腫瘤基因治療是目前腫瘤新技術(shù)的重要研究熱點(diǎn)，基因治療成功的關(guān)鍵之一在于 有效基因載體的選擇。目前常用的腫瘤基因治療導(dǎo)入載體系統(tǒng)有病毒(腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病 毒、慢病毒等)和非病毒(脂質(zhì)體、裸露DNA等)兩種。它們各有優(yōu)點(diǎn)及不足之處，其共同 的缺點(diǎn)之一就是缺乏靶向性，載體的非特異性分布使腫瘤組織內(nèi)的藥物濃度不高，難以達(dá) 到滿意療效。因此，尋找高效具有靶向性的基因治療載體系統(tǒng)是目前亟待解決的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，它是來源于中胚層的具有高度 自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。早期研究顯示MSCs在機(jī)體內(nèi)可主動募集至 炎癥或受損部位以修復(fù)受損組織，隨著研究深入，MSCs在體內(nèi)可趨向腫瘤病灶處，因此提出 MSCs可作為載體攜帶治療藥物至腫瘤處。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)具有易獲得、易培養(yǎng)、低免疫原性、能在宿主體內(nèi)長期存活、易于外源基 因轉(zhuǎn)染和長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。目前多數(shù)MSCs基因治療的研究是以腺病毒為載體將目的基因 導(dǎo)入，轉(zhuǎn)染率較低。有報(bào)道指出這是因?yàn)镸SCs表面低表達(dá)柯薩奇腺病毒受體，使腺病毒為 載體時(shí)轉(zhuǎn)染率最高僅20%左右。NK4基因具有阻斷HGF/c-met信號通路抑制HGF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及抑制 腫瘤血管生成的雙重作用。有研究顯示NK4基因治療可明顯抑制腹腔種植轉(zhuǎn)移及皮下移植 瘤生長，但上述實(shí)驗(yàn)均以腺病毒為載體，是瘤體、腹腔局部給藥。而臨床上進(jìn)展期胃癌患者 多已發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，瘤體局部給藥難度大；靜脈系統(tǒng)給藥病毒將直接暴露于血循環(huán) 中，通常被大量粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞表面或直接被血液中的抗體中和，再者病毒 侵入非腫瘤組織細(xì)胞造成病毒被大量損耗而難以到達(dá)腫瘤組織。因此，以病毒為載體的局 部及靜脈給藥方式的NK4基因治療可能難以達(dá)到預(yù)期效果。目前尚未見以慢病毒介導(dǎo)NK4基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)靶向治療胃癌 的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是建立構(gòu)建NK4-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedGreen fluorescent protein, EGFP)融合基因重組慢病毒表達(dá)載體的方法，它是從肝細(xì)胞生長 因子Ofepatocyte Growth Factor, HGF)質(zhì)粒中克隆NK4基因后，采用In-Fusion技術(shù)，將其定向克隆至慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒中，構(gòu)建了 NK4-EGFP融合基因重組慢病毒載體質(zhì)粒 (PGC-FU-NK4)，確定正常表達(dá)后，將構(gòu)建的重組的NK4-EGFP慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及pHelperl. 0 載體和pHelper2. 0載體三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝生產(chǎn)NK4過表達(dá)慢病毒顆粒 (Lenti-NK4)。它解決了以腺病毒為載體將NK4基因?qū)腴g充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染率較低的問題。本發(fā)明的第二個(gè)目的是建立能在體外持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞，即攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，它是通過慢病毒介導(dǎo)將NK4基因轉(zhuǎn)染 入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并確定NK4表達(dá)正常。本發(fā)明的第三個(gè)目的是攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在治療胃癌藥物中的 應(yīng)用，它是將攜帶NK4的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，治療裸鼠胃癌皮 下移植瘤，該方法利用了間充質(zhì)干細(xì)胞對腫瘤的趨向性，因此使提高可NK4基因治療的靶 向性，治療效果明顯，抑瘤率高，實(shí)施方法簡單，解決了目前NK4基因治療靶向性差、僅能局 部注射給藥等缺點(diǎn)。本發(fā)明的第一個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、目的基因的獲取1. 1NK4 基因片段 a以 HGFcDNA 為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增 NK4 基因片段a(521bp)。(1)引物名稱及序列NK4-Age I-F GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGA CCA AACTCCNK4-mut-R CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG(2) PCR 反應(yīng)體系 (3)循環(huán)條件反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、6(TC退火30s、 72°C延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin。
1. 2NK4 基因片段 b(1)引物名稱及序列以HGFcDNA為模板，PCR擴(kuò)增NK4基因片段b (976bp)。NK4-mut-F :CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACCNK4-Age I-R :TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC(2) PCR 反應(yīng)體系 (3)循環(huán)條件同前反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，共 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin01. 3以a+b為模板PCR擴(kuò)增NK4基因片段c(1)引物名稱及序列NK4-Age I-F :GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCAA ACTCCNK4-Age I-R :TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC(2) PCR 反應(yīng)體系 (3)循環(huán)條件同前反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，共 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin02. PCR產(chǎn)物回收取10μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下將PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝 膠切下，以膠回收試劑盒回收獲得人ΝΚ4 cDNA溶液。3. pGC-FU慢病毒表達(dá)載體的酶切限制性內(nèi)切酶AgeI進(jìn)行酶切，使其線性化。酶切反應(yīng)體系 反應(yīng)條件為37°C，Ih ；酶切產(chǎn)物經(jīng)過0. 75%瓊脂糖凝膠電泳后回收，并溶于50 μ 1 滅菌雙蒸水中，準(zhǔn)備用于構(gòu)建重組質(zhì)粒。4.目的基因重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建用In-Fusion酶將上述處理過的PCR產(chǎn)物與線性化載體進(jìn)行交換反應(yīng)重組質(zhì)粒。 反應(yīng)條件為 230C，15min,再 42°C，15min。交換反應(yīng)體系對照 1酶切回收的載體DNA(100ng/μ 1) 2μ 1回收的 PCR 產(chǎn)物(lOOng/μ 1)-10 X In-Fusio 交換酶緩沖液 2 μ 1In-Fusio 交換酶酶0. 5 μ 1dd H2O補(bǔ)至 20 μ 15.感受態(tài)細(xì)胞制備采用CaCl2法制備Ε. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞。(1)從37°C培養(yǎng)16h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有IOOmlLB培養(yǎng) 基的IL燒瓶中。于37°C劇烈振搖培養(yǎng)3h(旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)/min)；
對照2
2μ 1 2μ 1 0. 5μ 1 補(bǔ)至20 μ 1
連接組 2μ 1 2μ 1 1 μ 1 0. 5μ 1 補(bǔ)至20 μ 1
(2)在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放 置lOmin，使培養(yǎng)物冷卻至0°C ；(3)于 40C，4000 轉(zhuǎn) /min 離心 IOmin,回收細(xì)胞；(4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；(5)用IOml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上；(6) 40C，4000 轉(zhuǎn) /min 離心 IOmin,回收細(xì)胞；(7)倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；(8)每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀；(9)將細(xì)胞分裝成小份，放于_70°C凍存。6.轉(zhuǎn)化(1)用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ 1轉(zhuǎn)移到無菌的微量 離心管中，每管加10μ 1連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min ；(2)將管放到42°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s，勿搖動試管；(3)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻l-2min ；(4)每管加800 μ ILB培養(yǎng)基，水浴加溫至37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育 45min ；(5)將150 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性(IOOug/ ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上；(6)將平板置于室溫直至液體被吸收；(7)倒置平皿，于37°C培養(yǎng)16h ；(8)長出的克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定和測序。7.陽性克隆的PCR鑒定及測序(1)質(zhì)粒DNA的提取用堿裂解法，按質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書操作；(2)以獲取的質(zhì)粒DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。①引物名稱及序列EGFP-N-R CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGNK4-mut-R :CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG②反應(yīng)體系陰性對照ddH20及空載體自連對照組；陽性對照GAPDH③循環(huán)條件 為反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、6(TC退火30s、72°C延伸30s，共30 個(gè)循環(huán)；結(jié)束前72°C延伸6min。 (3)接種陽性轉(zhuǎn)化子，37°C培養(yǎng)16小時(shí)后保存為甘油菌，分裝200 μ 1送測序，以確 保所篩選克隆堿基序列完全正確。8.質(zhì)粒表達(dá)檢測pGC-FU-NK4轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況觀 察；9.質(zhì)粒大量抽提以Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取pGC-FU_NK4表達(dá)載體、p-Helperl. 0和 p-Helper2. 0的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度， 保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1. 8 2. 0之間。10.重組慢病毒包裝A、細(xì)胞轉(zhuǎn)染(1)轉(zhuǎn)染前24h，用0. 25%胰酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10% FBS的高 糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1. 2X107細(xì)胞ΛΟπιΙ，接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37°C、 5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)70% 80%轉(zhuǎn)染；(2)轉(zhuǎn)染前2h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基；(3)向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC_FU載體20 μ g，pHelper 1. O載體15 μ g，pHelper 2. O載體10 μ g)，與Opti-MEM混合均勻，調(diào)整總體積為2. 5ml，在 室溫下溫育5min ；(4)將 Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻，取 100 μ 1 Lipofectamine2000 試劑在 另一管中與2. 4ml Opti-MEM混合，在室溫下溫育5min ；(5)把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻， 不要振蕩；(6)室溫孵育20min，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物；(7)將DNA與Lipofectamine2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻， 37°C,5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(8)培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20ml的PBS液，以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，棄去；(9)每瓶細(xì)胞中加入含10% FBS的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基25ml，于37°C，5% C02 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h。B、病毒的收集與濃縮(1)收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞上清液；(2) 40C，4000g 離心 lOmin，除去細(xì)胞碎片；(3)以0. 45 μ m濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；(4)把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中，蓋上蓋子；將過濾杯插到濾過液收集管 中；(5)4000g離心10_15min，至需要的病毒濃縮體積；(6)離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開；(7)將過濾杯倒扣在樣品收集杯上；(8)轉(zhuǎn)速低于lOOOg，離心2min。把過濾杯從樣品收集杯上移開，樣品收集杯中的 即為病毒濃縮液；(9)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80°C保存；取其中一支進(jìn)行病 毒生物學(xué)滴度測定。所得病毒為攜帶NK4-EGFP融合基因的重組慢病毒。本發(fā)明的第二個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將攜帶NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)轉(zhuǎn)染BMSCs，通過觀察熒光及流 式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率確定最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity ofinfection,M0I)；采用酶聯(lián)免疫 口及Pti式KEnzyme linked immunosorbent assay,ELISA) ^Western blot^IlJLenti-NK4 轉(zhuǎn)染BMSCs后NK4表達(dá)。具體步驟如下1. Lenti-NK4 轉(zhuǎn)染 BMSCs，確定最佳感染 MOI(1)用0. 125%胰酶+0.02% EDTA消化對數(shù)生長期的BMSCs，以含10 % FBS的 L-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為以8X103/Cm2，種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5% C02培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；(2) 24h后吸去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)洗滌細(xì) 胞一次，按肌1值為0、1、10、20、50、100加入相應(yīng)體積的重組慢病毒顆粒(Lenti_NK4)，同時(shí) 補(bǔ)充5 μ g/ml的Polybrane及完全培養(yǎng)基至總量為500 μ 1 ；(3)置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)IOh后，換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，病毒感染 24 120小時(shí)及傳代后用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP表達(dá)；感染72h時(shí)分別收集各MOI值 的BMSCs的培養(yǎng)上清液，離心后-80°C保存，ELISA法檢測培養(yǎng)液中NK4含量。收集細(xì)胞 Western blot檢測NK4蛋白表達(dá)。2.流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率(1)轉(zhuǎn)染 Lenti-NK4 的 BMSCs 長滿約 85%時(shí)，0. 125%胰酶+0. 02% EDTA 消化，顯 微鏡下控制消化時(shí)間；(2)棄去消化液，以10 % FBS的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打培養(yǎng)瓶；(3)液體移至離心管，lOOOrpm，離心5min ；(4)棄去培養(yǎng)基，加入PBS重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為IXlOfVml ；(5)用同時(shí)培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染Lenti-NK4的BMSCs設(shè)為陰性對照，上機(jī)檢測轉(zhuǎn)染率。
14
采用最佳MOI的Lenti-NK4轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而獲得了能在體外持續(xù)、穩(wěn) 定表達(dá)NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明的第三個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1.慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs(1)用0. 125%胰酶+0.02% EDTA消化對數(shù)生長期的BMSCs，以含10 % FBS的 L-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為以8 X 107cm2，種植于細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C,5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)
培養(yǎng)；(2) 24h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞一次，按MOI為50加入相應(yīng)體積的Lenti-NK4 同時(shí)補(bǔ)充5 μ g/ml的Polybrane及完全培養(yǎng)基；同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染Lenti-GFP(MC)I 50)為陰性 對照，未轉(zhuǎn)染BMSCs做為空白對照；(3)置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)IOh后，換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長滿 80%，收集細(xì)胞備用；2. BMSCs-NK4治療裸鼠胃癌皮下移植瘤(1)取32只BALB/C(nu/nu)裸鼠，雌雄各半，6 8W，體重15 23g，用胃癌皮下 移植瘤瘤組織塊接種至裸鼠右側(cè)腋窩中部外側(cè)皮下；(2)當(dāng)皮下移植瘤長徑約1. 5cm時(shí)，隨機(jī)分為4組，分別在分組后0、7、14、21天給 藥；具體分組如下治療A組尾靜脈注射BMSCS-NK4，6 X IO5個(gè)/只，0. 2ml細(xì)胞懸液；治療B組尾靜脈注射Lenti_NK4，3X IO7TU/只，0. 2ml病毒液；對照C組尾靜脈注射BMSCs-GFP，6 X IO5個(gè)/只，0. 2ml細(xì)胞懸液；對照D組尾靜脈注射PBS，0. 2ml/只(3)取對數(shù)期生長期的 BMSCs-NK4、BMSCs-GFP 經(jīng)0. 125%胰酶+0. 02% EDTA 消化， PBS重懸細(xì)胞沉淀，制備單細(xì)胞懸液；每天觀察精神狀態(tài)、活動及飲食、飲水情況；3-4天稱重一次，并用游標(biāo)卡尺測量 皮下移植瘤的長徑(a)、與之相垂直的短徑(b)及厚度(c)，瘤體體積(mm3) = π abc/6計(jì) 算皮下移植瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率(％)=(對照組腫瘤體積-實(shí) 驗(yàn)組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積X 100 %。28天處死裸鼠，取出瘤體稱重。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1、構(gòu)建的NK4-EGFP融合基因的重組慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞后可正常表 達(dá)；重組慢病毒(Lenti-NK4)滴度為2X108TU/ml ；2、Lenti-NK4轉(zhuǎn)染BMSCs后熒光表達(dá)隨著時(shí)間延長及MOI值增加而增強(qiáng)、增多；攜 帶NK4基因的BMSCs (BMSCs-NK4)NK4表達(dá)正常，NK4分泌量隨著MOI值增加而增加，同時(shí)也 隨感染時(shí)間延長而增加，最佳MOI值為50 ；MOI為50時(shí)，Lenti_NK4轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染率達(dá) 87. 8% ,Lenti-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染率為96. 5%。提示攜帶NK4的慢病毒能安全、有效地 轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染后NK4基因可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。3、以BMSCs為載體的NK4基因治療對胃癌治療效果(1) BMSCs_NK4對皮下 移植瘤治療結(jié)果顯示BMSCs-NK4治療組瘤體體積均明顯小于BMSCs-GFP及PBS組(P < 0. 05) ；BMSCs-NK4 治療組抑瘤率達(dá) 52. 2% (2)BMSCs_NK4 組瘤重 1. 94士0. 67g，明顯低于 BMSCs-GFP 組及 PBS 組(P < 0. 05) ； (3)BMSCs_NK4 組壞死評分 3. 63 士 0. 47，明顯低于兩對照組(P < 0. 05)。BMSCs為載體的NK4基因治療使腫瘤組織壞死增加，抑制胃癌皮下移植 瘤的生長。從以上實(shí)驗(yàn)可得知Balb/C裸鼠動物實(shí)驗(yàn)證明BMSCs為載體的NK4基因治療可明 顯抑制胃癌皮下移植瘤的生長，抑瘤率高，實(shí)施方法簡單，解決了目前NK4基因治療靶向性 差、僅能局部注射給藥等缺點(diǎn)，是一種良好的胃癌基因治療新方法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但應(yīng)理解本發(fā)明的范圍并非僅限于這 些實(shí)施例的范圍。一種制備NK4-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合基因重組慢病毒表達(dá)載體的方法1、目的基因的獲取1. 1NK4 基因片段 a以 HGFcDNA 為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增 NK4 基因片段a(521bp)。(1)引物名稱及序列NK4-Age I-F GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACC AAACTCCNK4-mu t-R CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG(2) PCR 反應(yīng)體系 (3)循環(huán)條件反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、60°C退火30s、 72°C延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin。1.2NK4 基因片段 b(1)引物名稱及序列以HGFcDNA為模板，PCR擴(kuò)增NK4基因片段b (976bp)。NK4-mut-F CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACC
16
NK4-AgeI-R TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTA TC(2) PCR 反應(yīng)體系 (3)循環(huán)條件同前反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，共 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin01. 3以a+b為模板PCR擴(kuò)增NK4基因片段c(1)引物名稱及序列NK4-AgeI-F :GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCAA ACTCCNK4-AgeI-R :TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC(2) PCR 反應(yīng)體系 (3)循環(huán)條件同前反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，共 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin02. PCR產(chǎn)物回收取10μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下將PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝 膠切下，以膠回收試劑盒回收獲得人NK4cDNA溶液。3. pGC-FU慢病毒表達(dá)載體的酶切限制性內(nèi)切酶AgeI進(jìn)行酶切，使其線性化。酶切反應(yīng)體系 反應(yīng)條件為37°C，Ih ；酶切產(chǎn)物經(jīng)過0. 75%瓊脂糖凝膠電泳后回收，并溶于50 μ 1 滅菌雙蒸水中，準(zhǔn)備用于構(gòu)建重組質(zhì)粒。4.目的基因重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建用In-Fusion酶將上述處理過的PCR產(chǎn)物與線性化載體進(jìn)行交換反應(yīng)重組質(zhì)粒。 反應(yīng)條件為 230C，15min,再 42°C，15min。交換反應(yīng)體系對照 1酶切回收的載體DNA(100ng/μ 1) 2μ 1回收的PCR 產(chǎn)物(lOOng/μ 1) -10 X In-Fusio 交換酶緩沖液 2 μ 1In-Fusio 交換BIBI0. 5 μ 1ddH20補(bǔ)至 20 μ 15.感受態(tài)細(xì)胞制備采用CaCl2法制備Ε. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞。(1)從37°C培養(yǎng)16h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有IOOmlLB培養(yǎng) 基的IL燒瓶中。于37°C劇烈振搖培養(yǎng)3h(旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)/min)；(2)在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放 置lOmin，使培養(yǎng)物冷卻至0°C ；(3)于 4°C，4000 轉(zhuǎn)/min 離心 lOmin，回收細(xì)胞；(4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；0183](5)用IOml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上；
0184](6)4°C,4000 轉(zhuǎn) /min 離心 IOmin,回收細(xì)胞；
0185](7)倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；
0186](8)每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀；
0187](9)將細(xì)胞分裝成小份，放于-70°C凍存。
0188]6.轉(zhuǎn)化
0189](1)用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ 1轉(zhuǎn)移到無菌的微量 離心管中，每管加10μ 1連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min ；
(2)將管放到42°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s，勿搖動試管；
(3)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻l-2min；
⑷每管加800 μ ILB培養(yǎng)基，水浴加溫至37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育 (5)將150 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性(IOOug/
0190]
0191]
0192]
45min
0193]
ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上；
0194](6)將平板置于室溫直至液體被吸收；
0195](7)倒置平皿，于37°C培養(yǎng)16h ；
0196](8)長出的克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定和測序。
0197]7.陽性克隆的PCR鑒定及測序
0198](1)質(zhì)粒DNA的提取用堿裂解法，按質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書操作；
0199](2)以獲取的質(zhì)粒DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
0200]①引物名稱及序列
0201]EGFP-N-R CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
0202]NK4-mut-R :CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG
0203]②反應(yīng)體系陰性對照ddH20及空載體自連對照組；陽性對照GAPDH③循環(huán)條件 為反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、6(TC退火30s、72°C延伸30s，共30 個(gè)循環(huán)；結(jié)束前72°C延伸6min。
(3)接種陽性轉(zhuǎn)化子，37°C培養(yǎng)16小時(shí)后保存為甘油菌，分裝200 μ 1送測序，以確 保所篩選克隆堿基序列完全正確。8.質(zhì)粒表達(dá)檢測pGC-FU-NK4轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況觀 察；9.質(zhì)粒大量抽提以Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取pGC_FU_NK4表達(dá)載體、p-Helperl. 0和 p-Helper2. 0的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度， 保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1. 8 2. 0之間。10.重組慢病毒包裝A、細(xì)胞轉(zhuǎn)染(1)轉(zhuǎn)染前24h，用0. 25%胰酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10% FBS的高 糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1. 2X107細(xì)胞ΛΟπιΙ，接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37°C、 5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)70% 80%轉(zhuǎn)染；(2)轉(zhuǎn)染前2h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基；(3)向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC_FU載體20 μ g，pHelper 1. O載體15 μ g，pHelper 2. O載體10 μ g)，與Opti-MEM混合均勻，調(diào)整總體積為2. 5ml，在 室溫下溫育5min ；(4)將 Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻，取 100 μ 1 Lipofectamine2000 試劑在 另一管中與2. 4ml Opti-MEM混合，在室溫下溫育5min ；(5)把稀釋后的DNA與稀釋后的LipofectamindOOO進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻， 不要振蕩；(6)室溫孵育20min，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物；(7)將DNA與Lipofectamine2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻， 37°C,5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(8)培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20ml的PBS液，以洗 滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，棄去；(9)每瓶細(xì)胞中加入含10% FBS的H-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基25ml，于37°C，5% C02培 養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h。B、病毒的收集與濃縮(1)收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞上清液；(2) 40C，4000g 離心 lOmin，除去細(xì)胞碎片；
20
(3)以0. 45 μ m濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；(4)把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中，蓋上蓋子；將過濾杯插到濾過液收集管 中；(5)4000g離心10_15min，至需要的病毒濃縮體積；(6)離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開；(7)將過濾杯倒扣在樣品收集杯上；(8)轉(zhuǎn)速低于lOOOg，離心2min。把過濾杯從樣品收集杯上移開，樣品收集杯中的 即為病毒濃縮液；(9)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80°C保存；取其中一支進(jìn)行病 毒生物學(xué)滴度測定。所得病毒為攜帶NK4-EGFP融合基因的重組慢病毒。一種攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法將攜帶NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)轉(zhuǎn)染BMSCs，通過觀察熒光及流 式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率確定最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity ofinfection,M0I)；采用酶聯(lián)免疫 口及Pti式KEnzyme linked immunosorbent assay,ELISA) ^Western blot^IlJLenti-NK4 轉(zhuǎn)染BMSCs后NK4表達(dá)。具體步驟如下1. Lenti-NK4 轉(zhuǎn)染 BMSCs，確定最佳感染 MOI(1)用0. 125%胰酶+0. 02 % EDTA消化對數(shù)生長期的BMSCs，以含10 % FBS的 L-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為以8X103/Cm2，種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5% C02培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；(2)24h后吸去培養(yǎng)液，？83洗滌細(xì)胞一次，按而1值為0、1、10、20、50、100加入相 應(yīng)體積的重組慢病毒顆粒(Lenti-NK4)，同時(shí)補(bǔ)充5μ g/ml的Polybrane及完全培養(yǎng)基至總 量為500μ 1 ；(3)置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)IOh后，換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，病毒感染 24 120小時(shí)及傳代后用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP表達(dá)；感染72h時(shí)分別收集各MOI值 的BMSCs的培養(yǎng)上清液，離心后-80°C保存，ELISA法檢測培養(yǎng)液中NK4含量。收集細(xì)胞 Western blot檢測NK4蛋白表達(dá)。2.流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率(1)轉(zhuǎn)染 Lenti-NK4 的 BMSCs 長滿約 85%時(shí)，0. 125%胰酶 +0. 02% EDTA 消化，顯 微鏡下控制消化時(shí)間；(2)棄去消化液，以10 % FBS的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打培養(yǎng)瓶；(3)液體移至離心管，lOOOrpm，離心5min ；(4)棄去培養(yǎng)基，加入PBS重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為1 X 106/ml ；(5)用同時(shí)培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染Lenti-NK4的BMSCs設(shè)為陰性對照，上機(jī)檢測轉(zhuǎn)染率。采用最佳MOI的Lenti-NK4轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而獲得了能在體外持續(xù)、穩(wěn) 定表達(dá)NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例1 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，以攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為原料制成氯化 鈉注射溶液，用于靶向治療胃癌。實(shí)施例2
用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，以攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為原料制成磷酸 鹽緩沖液，用于靶向治療胃癌。
權(quán)利要求
攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在治療胃癌藥物中的應(yīng)用。
2.一種建立構(gòu)建NK4-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合基因重組慢病毒表達(dá)載體的方法，其 特征在于2.1目的基因的獲取 A NK4基因片段a以HGFcDNA為模板，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增NK4基因片段a :521bp ； a引物名稱及序列NK4-Age I-F :GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCA AACTCC NK4-mut-R CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG b PCR反應(yīng)體系上游引物NK4-Age I-F0. 4ul下游引物NK4-mut-R0. 4ulIOXbuffer2ulMgCl20. 5ulDNTPs (2. 5mM)0. 8ulpfu polymerase0. 2ulTemplate(lOng/μ 1)IulddH20補(bǔ)至20ulc循環(huán)條件反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、6(TC退火30s、72°C延 伸60s，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ； B NK4基因片段ba引物名稱及序列以HGFcDNA為模板，PCR擴(kuò)增NK4基因片段b :976bp ； NK4-mut-F :CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACC NK4-Age I-R :TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGT ATC b PCR反應(yīng)體系上游引物NK4-mut-F0. 4ul下游引物NK4-AgeI-R0. 4ulIOXbuffer2ulMgCl20. 5ul c循環(huán)條件同前反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、6(TC退火30s、 72°C延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ； C以a+b為模板PCR擴(kuò)增NK4基因片段c a引物名稱及序列NK4-AgeI-F :GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGAC CAAACTCC NK4-AgeI-R TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC b PCR反應(yīng)體系 c循環(huán)條件同前反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、6(TC退火30s、 72°C延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ； 2. 2PCR產(chǎn)物回收取10μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下將PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠切下，以膠回收試劑盒回收獲得人NK4cDNA溶液；2. 3pGC-FU慢病毒表達(dá)載體的酶切限制性內(nèi)切酶AgeI進(jìn)行酶切，使其線性化；酶切反應(yīng)體系__ 反應(yīng)條件為37°C，Ih ；酶切產(chǎn)物經(jīng)過0. 75%瓊脂糖凝膠電泳后回收，并溶于50 μ 1滅菌 雙蒸水中，準(zhǔn)備用于構(gòu)建重組質(zhì)粒；`2.4目的基因重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建用In-Fusion酶將上述處理過的PCR產(chǎn)物與線性化載體進(jìn)行交換反應(yīng)重組質(zhì)粒，反應(yīng) 條件為 230C，15min,再 42°C，15min ； 交換反應(yīng)體系對照1酶切回收的載體DNA(100ng/μ 1) 2μ 1 回收的PCR產(chǎn)物(IOOng/ μ 1)-`10 X In-Fusio交換酶緩沖液2 μ 1In-Fusio 交換酶酶0. 5μ1ddH20補(bǔ)至 20 μ 1`2`. 5感受態(tài)細(xì)胞制備采用CaCl2法制備Ε. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞 A從37°C培養(yǎng)16h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有IOOmlLB培養(yǎng)基的IL 燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)3h，旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)/min ；B在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置 lOmin，使培養(yǎng)物冷卻至0°C ；C于4°C，4000轉(zhuǎn)/min離心IOmin,回收細(xì)胞；D倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；E用IOml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上；F 40C，4000轉(zhuǎn)/min離心IOmin,回收細(xì)胞；G倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；H每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀；I將細(xì)胞分裝成小份，放于-70°C凍存；`2. 6轉(zhuǎn)化A用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ 1轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管 中，每管加10 μ 1連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置`30min ； B將管放到42°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s，勿搖動試管； C快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻l-2min ；D每管加800 μ ILB培養(yǎng)基，水浴加溫至37 °C，然后將管轉(zhuǎn)移到37 °C搖床上，溫育 45min ；對照22μ 1 2μ 1 0. 5μ 1 補(bǔ)至20 μ 1連接組 2μ 1 2μ 1 1 μ 1 0. 5μ 1 補(bǔ)至20 μ 1E將150 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性100ug/ml的 LB瓊脂培養(yǎng)基上；F將平板置于室溫直至液體被吸收； G倒置平皿，于37°C培養(yǎng)16h ； H長出的克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定和測序； 2. 7陽性克隆的PCR鑒定及測序A質(zhì)粒DNA的提取用堿裂解法，按質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書操作； B以獲取的質(zhì)粒DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； a引物名稱及序列 EGFP-N-R CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG NK4-mu t-R :CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG b反應(yīng)體系陰性對照ddH20及空載體自連對照組；陽性對照GAPDH c循環(huán)條件為反應(yīng)先94°C預(yù)變性30s，加入聚合酶；94°C變性30s、6(TC退火30s、72°C 延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；結(jié)束前72°C延伸6min ； C接種陽性轉(zhuǎn)化子，37°C培養(yǎng)16小時(shí)后保存為甘油菌，分裝200 μ 1送測序，以確保所篩 選克隆堿基序列完全正確； 2. 8質(zhì)粒表達(dá)檢測PGC-FU-NK4轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況觀察； 2. 9質(zhì)粒大量抽提以Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取pGC_FU_NK4表達(dá)載體、p-Helperl. 0和 p-Helper2. 0的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度， 保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1. 8 2. 0之間； 2. 10重組慢病毒包裝 A、細(xì)胞轉(zhuǎn)染a轉(zhuǎn)染前24h，用0. 25%胰酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10% FBS的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.2X107細(xì)胞ΛΟπιΙ，接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70% 80%轉(zhuǎn)染；b轉(zhuǎn)染前2h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基；c向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液pGC-FU載體20 μ g，pHelperl. 0載體 15 μ g，pHelper 2. 0載體10 μ g，與Opti-MEM混合均勻，調(diào)整總體積為2. 5ml，在室溫下溫 育 5min ；d將 Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻，取 100 μ 1 Lipofectamine2000 試劑在另一管 中與2. 4ml Opti-MEM混合，在室溫下溫育5min ；e把稀釋后的DNA與稀釋后的LipofectamindOOO進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩；f室溫孵育20min，以便形成DNA與LipofectamindOOO稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物； g將DNA與Lipofectamine2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，37°C、5 % C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；h培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20ml的PBS液，以洗滌殘余 的轉(zhuǎn)染混和物，棄去；i每瓶細(xì)胞中加入含10% FBS的H-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基25ml，于37°C，5 % C02培養(yǎng)箱內(nèi) 繼續(xù)培養(yǎng)48h ；B、病毒的收集與濃縮 a收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞上清液； b4°C，4000g離心lOmin，除去細(xì)胞碎片； c以0. 45 μ m濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；d把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中，蓋上蓋子；將過濾杯插到濾過液收集管中； e4000g離心10-15min，至需要的病毒濃縮體積； f離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開； g將過濾杯倒扣在樣品收集杯上；h轉(zhuǎn)速低于lOOOg，離心2min，把過濾杯從樣品收集杯上移開，樣品收集杯中的即為病毒濃縮液；i將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80°C保存；取其中一支進(jìn)行病毒生物 學(xué)滴度測定，所得病毒為攜帶NK4-EGFP融合基因的重組慢病毒。
3. 一種攜帶NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于 將攜帶NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)轉(zhuǎn)染BMSCs，通過觀察熒光及流 式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率確定最佳感染復(fù)數(shù)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及Western blot檢測 Lenti-NK4轉(zhuǎn)染BMSCs后NK4表達(dá)，具體步驟如下 3. ILenti-NK4轉(zhuǎn)染BMSCs，確定最佳感染MOIA用0. 125%胰酶+0. 02% EDTA消化對數(shù)生長期的BMSCs，以含10% FBS的L-DMEM培 養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為以8X103/Cm2，種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)；B 24h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞一次，按MOI值為0、1、10、20、50、100加入相應(yīng)體積 的重組慢病毒顆粒(Lenti-NK4)，同時(shí)補(bǔ)充5 μ g/ml的Polybrane及完全培養(yǎng)基至總量為 500 μ 1 ；C置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)IOh后，換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，病毒感染24 120小時(shí)及傳代后用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP表達(dá)；感染72h時(shí)分別收集各MOI值的BMSCs 的培養(yǎng)上清液，離心后-80°C保存，ELISA法檢測培養(yǎng)液中NK4含量；收集細(xì)胞Western blot 檢測NK4蛋白表達(dá)；‘3. 2流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率A轉(zhuǎn)染Lenti-NK4的BMSCs長滿約85%時(shí)，0. 125%胰酶+0. 02% EDTA消化，顯微鏡下 控制消化時(shí)間；B棄去消化液，以10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打培養(yǎng)瓶； C液體移至離心管，IOOOrpm,離心5min ；D棄去培養(yǎng)基，加入PBS重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為1 XlO6Ail ； E用同時(shí)培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染Lenti-NK4的BMSCs設(shè)為陰性對照，上機(jī)檢測轉(zhuǎn)染率； 采用最佳MOI的Lenti-NK4轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而獲得了能在體外持續(xù)、穩(wěn)定表 達(dá)NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種攜帶NK4基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法及其在治療胃癌藥物中的應(yīng)用，它是從HGF質(zhì)粒中調(diào)取了NK4基因后，采用In-Fusion技術(shù)，將其定向克隆至慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒中，構(gòu)建了NK4-EGFP融合基因重組慢病毒載體質(zhì)粒(pGC-FU-NK4)后與pHelper1.0載體和pHelper2.0載體三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝生產(chǎn)NK4過表達(dá)慢病毒顆粒(Lenti-NK4)。將攜帶NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，建立了體外穩(wěn)定表達(dá)NK4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。Balb/C裸鼠動物實(shí)驗(yàn)證明BMSCs為載體的NK4基因治療可明顯抑制胃癌皮下移植瘤的生長，抑瘤率高，是一種良好的胃癌基因治療方法。
文檔編號C12N15/867GK101912618SQ20101024854
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者呂農(nóng)華, 張焜和, 祝蔭, 程明, 羅時(shí)文, 謝勇 申請人:祝蔭