米曲霉prb-1菌株在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了米曲霉（Aspergillusoryzae）PRB-1菌株在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用。所述米曲霉PRB-1菌株是從廣東珠江橋生物科技股份有限公司的醬油種曲中復(fù)壯、分離、純化獲得。該菌株已于2013年12月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2013628。大量的試產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該菌株生長(zhǎng)繁殖力強(qiáng)，菌絲生長(zhǎng)旺盛，遺傳穩(wěn)定性好，該菌株制備的成曲色澤鮮綠，孢子豐富，孢子發(fā)芽率高，蛋白酶活高，發(fā)酵醬油產(chǎn)量高、質(zhì)量好。本發(fā)明的菌株將在釀造醬油中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】米曲霉PRB-1菌株在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及工業(yè)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及米曲霉PRB-1菌株在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]醬油屬于傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味食品，菌種是發(fā)酵的基礎(chǔ)，其性能對(duì)醬油產(chǎn)量和質(zhì)量影響甚大。米曲霉(Aspergillus oryzae)是釀造醬油中必不可少的微生物,也是釀造醬油生產(chǎn)過程中的核心技術(shù)。醬油釀造主要依賴于米曲霉所產(chǎn)生的豐富的酶系，來分解原料中的多種成分，從而形成醬油獨(dú)特的色、香、味、體。醬油生產(chǎn)米曲霉菌種的生產(chǎn)性能決定了醬油的品質(zhì)及原料利用率，優(yōu)良米曲霉菌種的選用能夠提高原料的利用率，縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本，提高醬油的風(fēng)味和品質(zhì)，因此，醬油釀造選育優(yōu)良的米曲霉菌株至關(guān)重要，它關(guān)系到醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0003]目前,我國(guó)醬油釀造企業(yè)90%以上使用的是米曲霉滬釀
3.042，該菌種具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)孢子多、酶系豐富、中性蛋白酶活性高等優(yōu)點(diǎn)，是醬油釀造的主要菌種。然而，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其蛋白酶活力迅速下降，導(dǎo)致釀造醬油的原料蛋白利用率和氨基酸轉(zhuǎn)化率偏低，產(chǎn)品風(fēng)味較弱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有用于釀造醬油的米曲霉的不足，提供一株優(yōu)良的、孢子豐富、蛋白酶活高、發(fā)酵醬油產(chǎn)量高、質(zhì)量好的米曲霉菌株及其在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了一株米曲霉(Aspergillus oryzae )PRB_1菌株及其在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
[0006]所述的米曲霉oryzaey?W>~\菌株于2013年12月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013628，保藏單位地址為中國(guó)武漢市武漢大學(xué)。
[0007]所述的米曲霉PRB-1囷株屬于曲霉目、曲霉科、曲霉屬。
[0008]所述的米曲霉PRB-1菌株的形態(tài)學(xué)特征描述如下:
菌落呈圓形，質(zhì)地疏松，菌落中間部位著生孢子多，孢子粗壯，菌絲層厚；菌落生長(zhǎng)初期小、白色、圓形，隨著菌落的逐漸長(zhǎng)大，白色范圍也逐漸擴(kuò)大，菌絲層變厚，菌落的中心開始著生淺黃綠色的孢子，然后淺黃綠色逐步向四周擴(kuò)散；菌落成熟后孢子呈黃綠色，孢子粗壯，菌絲層厚。
[0009]上述米曲霉PRB-1菌株是從廣東珠江橋生物科技股份有限公司的醬油種曲中，經(jīng)過大量的復(fù)壯篩選、分離、純化獲得的。
[0010]具體地，本發(fā)明所述米曲霉PRB-1菌株的分離獲得方法如下:51.分離復(fù)壯:取廣東珠江橋生物科技股份有限公司釀造醬油種曲，無菌操作，制備成孢子懸液，按照10倍梯度稀釋法，分別用無菌生理鹽水將孢子懸液稀釋到10_\10_2、10_3、10_4、10_5、10_6的濃度，得孢子稀釋液；取所述孢子稀釋液涂布于復(fù)壯分離培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)；挑選其中菌落生長(zhǎng)快、透明圈大、菌落大、孢子多的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的純化；
52.純化:將SI挑選的菌落生長(zhǎng)快、透明圈大、菌落大、孢子多的單菌落孢子接種于改良豆汁固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落，即獲得純菌株；
53.鑒定:根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步鑒定，所述米曲霉菌株的形態(tài)學(xué)特征描述如下:
菌落呈圓形，質(zhì)地疏松，菌落中間部位著生孢子多，孢子粗壯，菌絲層厚；菌落生長(zhǎng)初期小、白色、圓形，隨著菌落的逐漸長(zhǎng)大，白色范圍也逐漸擴(kuò)大，菌絲層變厚，菌落的中心開始著生淺黃綠色的孢子，然后淺黃綠色逐步向四周擴(kuò)散；菌落成熟后孢子呈黃綠色，孢子粗壯，菌絲層厚；
54.篩選:對(duì)上述培養(yǎng)得到的純菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)以及生產(chǎn)試產(chǎn)，篩選出一株生長(zhǎng)速度快，種曲和成曲的孢子豐富，孢子發(fā)芽率高，蛋白酶活最高的菌株。該菌株命名為米曲霉PRB-1菌株，已于2013年12月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013628，保藏地址為中國(guó)武漢市武漢大學(xué)。
[0011]其中，SI所述的復(fù)壯分離培養(yǎng)基平板為酪蛋白豆汁平板，其配制方法為:稱取干酪素 4g，KH2PO40.36g，無水 MgSO4 0.50g, Na2HPO4 1.07g,大豆提取物 2.0g,瓊脂粉 20.0g,溶于1000mL蒸餾水，調(diào)pH值至6.5~7.0，分裝，0.lMPa、121°C滅菌20min即得。
[0012]優(yōu)選地，SI所述培養(yǎng)的條件是30~38°C培養(yǎng)50~72h，更優(yōu)選地是32°C培養(yǎng)72h，培養(yǎng)過程中觀察記錄菌落生長(zhǎng)快慢情況、菌落大小及透明圈大小。
[0013]S2所述改良豆汁固體培養(yǎng)基的配方為:
按照I~2kg黃豆/L水的比例準(zhǔn)備黃豆和水，將黃豆煮爛，過濾后取濾液，用蒸餾水定容得到豆汁；分別在豆汁中加入0.50g/L的無水MgSO4U.50g/L的K2HPO4U.00g/L的Na2HPO4U0.0g/L的可溶性淀粉、20.0g/L的瓊脂粉，調(diào)pH值至6.5~7.0 ;分裝，0.1MPa,121°C滅菌20min。優(yōu)選地，所述過濾的孔徑為50~100目，所述煮爛的時(shí)間為I~2h。
[0014]優(yōu)選地，S2所述培養(yǎng)的溫度為30~38°C，更優(yōu)選地為32°C。
[0015]優(yōu)選地,本發(fā)明提供了所述米曲霉(AspergiIlus oryzae )菌株的培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
51.一級(jí)菌種擴(kuò)大培養(yǎng):將米曲霉PRB-1菌株的孢子接種到改良豆汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至成熟即得到成熟的一級(jí)菌種孢子，于4~10°C保存；
52.二級(jí)菌種擴(kuò)大培養(yǎng):將成熟的一級(jí)菌種孢子接種到改良麩皮固態(tài)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至成熟即得到成熟的二級(jí)菌種孢子；于4~10°C保存；
53.三級(jí)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，將成熟的二級(jí)菌種孢子接種到改良麩皮固態(tài)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至成熟，于4~10°C保存。
[0016]其中，SI所述改良豆汁固體培養(yǎng)基的配方同前所述。
[0017]優(yōu)選地，S1、S2或S3所述培養(yǎng)至成熟的培養(yǎng)條件為30~38°C培養(yǎng)50~72h 更優(yōu)選地，S1、S2或S3所述培養(yǎng)至成熟的培養(yǎng)條件為32°C培養(yǎng)72h。
[0018]1.S2或S3所述改良麩皮固態(tài)培養(yǎng)基的配制方法為:按照麩皮:面粉的質(zhì)量比為I~4.5:1稱取麩皮和面粉，混勻，加入水和/或豆汁攪拌均勻，滅菌即得；
所述水和/或豆汁的加入量是:以麩皮、面粉與水和/或豆汁的總質(zhì)量計(jì)，水和/或豆汁占總質(zhì)量的40~60% ；
所述豆汁是按照I~2kg黃豆/L水的比例準(zhǔn)備黃豆和水，將黃豆煮爛，過濾后取濾液，用水定容得到。
[0019]水和豆汁配合使用時(shí)，兩者的比例不做嚴(yán)格限定。
[0020]所述水優(yōu)選采用蒸餾水。
[0021]本發(fā)明提供所述米曲霉PRB-1菌株在生產(chǎn)醬油方面的應(yīng)用，優(yōu)選地，本發(fā)明是將所述米曲霉PRB-1菌株應(yīng)用于提高醬油成曲孢子發(fā)芽率、蛋白酶活和/或發(fā)酵醬油產(chǎn)量質(zhì)量方面。
[0022]由米曲霉(As/76?r^777w5.0ryzae ) PRB-1菌株按照本領(lǐng)域常規(guī)方法制備得到的種曲，以及由米曲霉(Aspergillus oryzae ) PRB-1菌株按照本領(lǐng)域常規(guī)方法發(fā)酵得到的發(fā)酵液也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0023]同樣地，所述種曲或發(fā)酵液在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0024]經(jīng)過大量的試產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明所述米曲霉PRB-1菌株生長(zhǎng)繁殖力強(qiáng)，菌絲生長(zhǎng)旺盛，遺傳穩(wěn)定性好，該菌株制備的成曲色澤鮮綠，孢子豐富，孢子發(fā)芽率高，蛋白酶活高，發(fā)酵醬油產(chǎn)量高、質(zhì)量好。
[0025]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一株新的米曲霉PRB-1菌株在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用，因所述菌株生長(zhǎng)繁殖力強(qiáng)，菌絲生長(zhǎng)旺盛，遺傳穩(wěn)定性好，應(yīng)用本發(fā)明所述菌株生產(chǎn)制備得到的醬油成曲色澤鮮綠，孢子豐富，孢子發(fā)芽率高，蛋白酶活高，發(fā)酵醬油產(chǎn)量高、質(zhì)量好。所述米曲霉PRB-1菌株生產(chǎn)醬油種曲的孢子數(shù)可達(dá)到162億個(gè)/克(干基)，發(fā)芽率高達(dá)98.9%，中性蛋白酶活力可達(dá)到11880U/克干基(福林法)。所述米曲霉PRB-1菌株在釀造醬油方面具有非常大的生產(chǎn)價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
[0026]另外，米曲霉PRB-1菌株在成曲階段的生長(zhǎng)速度明顯較其它菌株快，成曲菌絲旺盛，曲香濃，孢子著生均勻，該菌株對(duì)溫度的適應(yīng)性較強(qiáng)，能夠在30°C~38°C正常生長(zhǎng)，制曲時(shí)間從原來的44h，縮短為34~36h，使用該菌株進(jìn)行生產(chǎn)能夠顯著地節(jié)約能源，特別適用于目前倡導(dǎo)的低碳、節(jié)約、綠色環(huán)保的生產(chǎn)模式。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為米曲霉PRB-1菌株在酪蛋白豆汁平板上的單菌落形態(tài)。
[0028]圖2為米曲霉PRB-1菌株的成熟斜面菌種形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0030]除非特別說明，本發(fā)明實(shí)施例所用培養(yǎng)基和試驗(yàn)條件為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)基和試驗(yàn)條件。[0031 ] 除非特別說明，本發(fā)明實(shí)施例所用試劑均為市購(gòu)。
[0032]實(shí)施例1米曲霉菌株的分離與鑒定 1、實(shí)驗(yàn)材料和條件
(I)廣東珠江橋生物科技股份有限公司釀造醬油種曲。
[0033](2)培養(yǎng)基:酪蛋白豆汁培養(yǎng)基、改良豆汁固體培養(yǎng)基。
[0034]酪蛋白豆汁培養(yǎng)基的配制方法為:稱取干酪素4g，KH2PO40.36g，無水MgSO4
0.50g, Na2HPO4 1.07g,大豆提取物2.0g,瓊脂粉20.0g,溶于1000mL蒸餾水，調(diào)pH值至
6.5 ~7.0，分裝，0.lMPa、121°C滅菌 20min。
[0035]改良豆汁固體培養(yǎng)基的配制方法為:按照I~2kg/L的比例，稱取黃豆，煮爛，過濾后取濾液，用蒸餾水定容得到豆汁；分別在豆汁中加入0.50g/L的無水MgS04、l.50g/L的K2HP04、1.00g/L的Na2HP04、10.0g/L的可溶性淀粉、20.0g/L的瓊脂粉，調(diào)pH值至6.5~
7.0 ;分裝，0.lMPa、121°C滅菌20min。優(yōu)選地，所述過濾的孔徑為50~100目，所述煮爛的時(shí)間為I~2h。
[0036](3)無菌操作條件:所有器皿和用具均須經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌(121°C，30min)，接種等操作均在無菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。
[0037]2、米曲霉PRB-1菌株的分離與鑒定
(O分離復(fù)壯:廣東珠江橋生物科技股份有限公司釀造醬油種曲，無菌操作，制備成孢子懸液，按照10倍梯度稀釋法，分別用無菌生理鹽水將孢子懸液稀釋到10_\10_2、10_3、10_4、10_5、10_6的濃度，得孢子稀釋液。
[0038]分別取0.1~0.2mL上述孢子稀釋液涂布于復(fù)壯分離培養(yǎng)基平板上，32°C培養(yǎng)72h，培養(yǎng)過程觀察記錄菌落生長(zhǎng)快慢情況、菌落大小及透明圈大小。整個(gè)過程共觀察記錄106個(gè)單菌落。
[0039]挑選其中12個(gè)菌落生長(zhǎng)快、透明圈大、菌落大、孢子多的菌株，記為PRB-1~PRB-12，對(duì)這12個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的純化。
[0040]其中，所述的復(fù)壯分離培養(yǎng)基平板為酪蛋白豆汁培養(yǎng)基。酪蛋白豆汁平板的配制方法為:稱取干酪素4g，KH2PO40.36g，無水MgSO4 0.50g, Na2HPO4 1.07g，大豆提取物2.0g,瓊脂粉20.0g，溶于1000mL蒸餾水，調(diào)pH值至6.5~7.0，分裝，0.1MPa、121°C滅菌20min即得。
[0041](2)純化:分別挑取上述12個(gè)菌落接種于改良豆汁固體斜面培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落，即獲得純菌株。
[0042](3)鑒定:根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步鑒定。
[0043]所述米曲霉菌株的形態(tài)學(xué)特征描述如下:
菌落呈圓形，質(zhì)地疏松，菌落中間部位著生孢子多，孢子粗壯，菌絲層厚；菌落生長(zhǎng)初期小、白色、圓形，隨著菌落的逐漸長(zhǎng)大，白色范圍也逐漸擴(kuò)大，菌絲層變厚，菌落的中心開始著生淺黃綠色的孢子，然后淺黃綠色逐步向四周擴(kuò)散；菌落成熟后孢子呈黃綠色，孢子粗壯，菌絲層厚。
[0044]實(shí)施例2米曲霉PRB-1菌株的獲得
1、米曲霉PRB-1菌株的篩選
對(duì)實(shí)施例1得到的12個(gè)單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)以及生產(chǎn)試產(chǎn)，篩選高產(chǎn)的米曲霉菌株。[0045]( I)三角瓶菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)
篩選出的12個(gè)菌株接種到裝有改良麩皮固態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行三角瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，在32°C條件下培養(yǎng)72h至成熟，成熟菌種孢子旺盛，色澤鮮綠，疏松均勻。培養(yǎng)成熟后，檢測(cè)孢子數(shù)、發(fā)芽率和中性蛋白酶活，結(jié)果如表1所示。
[0046]所述改良麩皮固態(tài)培養(yǎng)基的配制方法為:按照麩皮:面粉=1~4.5:1 (w/w)稱取麩皮和面粉，混勻，用40~60% (w/w)的蒸餾水和/或豆汁補(bǔ)足，攪拌均勻，滅菌即得。所述豆汁是按照I~2kg/L的比例，稱取黃豆，煮爛，過濾后取濾液，用蒸餾水定容得到。蒸餾水和豆汁配合使用時(shí)，兩者的比例不做限定。
[0047]表1
【權(quán)利要求】
1.米曲霉C45776?r^i77w5.0rj^ae) PRB-1菌株在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述菌株應(yīng)用于提高醬油成曲孢子發(fā)芽率、蛋白酶活和/或發(fā)酵醬油產(chǎn)量及質(zhì)量方面。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述應(yīng)用，其特征在于，所述的米曲霉PRB-1菌株于2013年12月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013628。
4.一種由權(quán)利要求1所述米曲霉PRB-1菌株制備得到的醬油釀造種曲。
5.一種由權(quán)利要求1所述米曲霉PRB-1菌株發(fā)酵得到的發(fā)酵液。
6.權(quán)利要求4所述種曲或權(quán)利要求5所述發(fā)酵液在醬油生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，是將所述種曲或發(fā)酵液應(yīng)用于提高醬油成曲孢子發(fā)芽率、蛋白 酶活和/或發(fā)酵醬油產(chǎn)量質(zhì)量方面。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103834576SQ201410036062
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】吳惠玲, 胡文鋒, 袁國(guó)新, 顏喆, 林康藝, 孔德華, 李萌 申請(qǐng)人:廣東珠江橋生物科技股份有限公司