專利名稱：微生物發(fā)酵生產(chǎn)脂質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)脂質(zhì)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及培養(yǎng)產(chǎn)脂質(zhì)微生物以生產(chǎn)脂質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
一些微生物能夠生產(chǎn)多不飽和脂肪酸脂肪酸(PUFA)，例如一些含多不飽和脂肪酸(PUFA)多酮合成酶系統(tǒng)(PKS)的微生物，諸如真核Stramenopiles界Heterokonta門 Labytinthulida綱破囊壺菌目破囊壺菌科的Schizochytrium sp.菌產(chǎn)DHA和ω-6 DPA及同屬的Ulkenia菌產(chǎn)DHA ；細(xì)菌變形菌門、-proteobacteria綱交替單胞菌目希萬氏菌科 Shewanella sp.產(chǎn) EPA 及同目的 Moritellaceae 科Moritella marina 產(chǎn) DHA ；細(xì)菌變形菌 Π y -proteobacteria目 Μ 禾斗的 Photobacterium profundum f EPA
專利W02005/098033(中國專利200580018877)所描述的具有PUFA PKS特異的氨基酸序列 LGISAIKRVEIL 的微生物。DHA的普遍商業(yè)來源是深海魚油和海洋微藻。其中利用發(fā)酵技術(shù)異養(yǎng)培養(yǎng)海洋微藻具有很好的商業(yè)前景。在眾多的海洋微藻中，Schizochytrium sp.的發(fā)酵特性和菌油脂質(zhì)組成比較突出。目前的科學(xué)研究已經(jīng)證實Schizochytrium發(fā)酵生成DHA和ω -6 DPA是PUFA PKS 系統(tǒng)作用的結(jié)果。該系統(tǒng)區(qū)別于動植物和多數(shù)微生物中PUFA生成路徑。PUFA PKS系統(tǒng)在PUFA碳鏈延長的過程中，并不全部還原中間產(chǎn)物多烯酰ACP，而是通過2-反式3-順式異構(gòu)酶保留一些不飽和雙鍵，因而PUFA積累過程中對氧的依賴比傳統(tǒng)PUFA合成系統(tǒng)小。 Schizochytrium PUFA PKS的菌株，可在極低溶氧(小于5%)條件下大量生成DHA和ω-6 DPA。ZL 01806451. 5公開了通過在發(fā)酵罐中高密度培養(yǎng)真核微生物來增加含有多烯脂肪酸的脂質(zhì)的產(chǎn)生的方法。該專利實施例2說明搖瓶培養(yǎng)基中低溶氧水平對最終產(chǎn)物DHA 的影響結(jié)論是隨著溶氧水平的降低，產(chǎn)物DHA隨之相應(yīng)提高，從而可在發(fā)酵后期實施低溶氧以獲得更高的DHA產(chǎn)量。然而，本領(lǐng)域仍需要新的發(fā)酵方法，以在低溶氧條件下促使PUFA PKS系統(tǒng)合成更多的PUFA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物必須在低溶氧條件下、在特定碳源濃度范圍(碳源濃度< 15g/L)的前提下。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源濃度超出該范圍，這時實施低氧則無法顯著提高DHA產(chǎn)量。本申請第一方面提供一種培養(yǎng)生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物的方法，所述的脂質(zhì)為含有多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)，所述方法包括在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為低于或等于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于15g/L。
在一具體實施例中，所述的微生物為含有多不飽和脂肪酸的多酮合成酶系統(tǒng)、且可以利用該系統(tǒng)來生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物。 在一具體實施例中，所述微生物選自破囊壺菌目、交替單胞菌目和弧菌目。在一具體實施例中，所述微生物選自破囊壺菌科、希萬氏菌科、Moritellaceae科和弧菌科。在一具體實施例中，所述的多不飽和脂肪酸選自ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸。在一具體實施例中，所述的ω-3多不飽和脂肪酸選自DHA、DPA和EPA。在一具體實施例中，在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為低于或等于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于10g/L。在一具體實施例中，在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到90g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為低于或等于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于10g/L。本申請第二方面提供一種生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，所述方法包括(1)在適宜產(chǎn)脂質(zhì)微生物生長的條件下培養(yǎng)該產(chǎn)脂質(zhì)微生物；和(2)在培養(yǎng)的產(chǎn)脂質(zhì)微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為低于或等于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于 15g/L ；從而進(jìn)行脂質(zhì)生產(chǎn)。 在一具體實施例中，所述微生物選自破囊壺菌目、交替單胞菌目和弧菌目。在一具體實施例中，在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為等于或低于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于10g/L。在一具體實施例中，在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到90g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為等于或低于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于10g/L。在一具體實施例中，所述脂質(zhì)是含有多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。在一具體實施例中，所述的多不飽和脂肪酸選自ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸。在其它實施例中，所述的ω-3多不飽和脂肪酸選自DHA、DPA和EPA。本發(fā)明的實施對實際生產(chǎn)中提高DHA產(chǎn)量將有重要的商業(yè)意義。按照本發(fā)明，在發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng)含PUFA PKS菌株時，罐內(nèi)殘?zhí)菨舛戎挥斜３衷?lt; 15g/L，同時在發(fā)酵后期實施低溶氧，可有效提高DHA產(chǎn)量。
具體實施例方式本發(fā)明的產(chǎn)脂質(zhì)微生物包括但不限于(1)破囊壺菌目微生物，優(yōu)選破囊壺菌科的微生物，更優(yōu)選裂殖壺菌 (Schizochytrium sp.)(產(chǎn) DHA 和 ω-6 DPA)和吾肯氏壺菌 Ulkenia(產(chǎn) DHA)；(2)交替單胞菌目微生物，優(yōu)選希萬氏菌科和Moritellaceae科，更優(yōu)選Shewanella sp.(產(chǎn) EPA)及 Moritella marina(產(chǎn) DHA)；(3)弧菌目微生物，優(yōu)選弧菌科，更優(yōu)選Photobacterium profundum(產(chǎn)EPA)；和(4)其他符合專利W02005/098033 (中國專利200580018877)所描述的具有PUFA PKS特異的氨基酸序列LGISAIKRVEIL的微生物。在一優(yōu)選實施例中，所述產(chǎn)脂質(zhì)微生物是含PUFA PKS的微生物。在一優(yōu)選實施例中，所述產(chǎn)脂質(zhì)微生物選自Schizochytrium sp.、Shewanella sp. 、Moritella marina> Photobacterium profundum R^^M W02005/098033 (
利200580018877)所描述的具有PUFA PKS特異的氨基酸序列LGISAIKRVEIL的微生物。在更優(yōu)選的實施例中，用于實施本發(fā)明方法的微生物是Schizochytrium sp.菌。在其它實施例中，用于實施本發(fā)明方法的微生物是Ulkenia菌。本申請的方法用于生產(chǎn)脂質(zhì)。“脂質(zhì)”在本文中指含有多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。多不飽和脂肪酸(PUFA)指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18 22個碳原子的直鏈脂肪酸。多不飽和脂肪酸通常分為ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸。在多不飽和脂肪酸分子中，距羧基最遠(yuǎn)端的雙鍵在倒數(shù)第3個碳原子上的稱為ω-3多不飽和脂肪酸；在第六個碳原子上的，則稱為ω-6多不飽和脂肪酸。ω-3不飽和脂肪酸中對人體最重要的兩種不飽和脂肪酸是DHA和EPA。EPA是二十碳五烯酸的英文縮寫，DHA是二十二碳六烯酸的英文縮寫。因此，在一個具體實施例中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)ω -3多不飽和脂肪酸的方法，更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及DHA和/或EPA的生產(chǎn)方法。所述方法包括在適宜產(chǎn)脂質(zhì)微生物生長的條件下培養(yǎng)所述產(chǎn)脂質(zhì)微生物，以及在培養(yǎng)的產(chǎn)脂質(zhì)微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為等于或低于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于15g/L。本發(fā)明產(chǎn)脂質(zhì)微生物的培養(yǎng)可大致分為兩個階段。第一階段是提高微生物生物量密度的階段。第二階段是脂質(zhì)快速、大量積累階段(生產(chǎn)階段)。在生物量密度的提高階段，發(fā)酵過程的主要目的是提高發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物量密度以得到所需的生物量密度。可采用本領(lǐng)域周知的技術(shù)來培養(yǎng)產(chǎn)脂質(zhì)微生物，以提高微生物生物量密度。例如，可采用ZL 01806451. 5所公開的方法實施第一階段的培養(yǎng)。因此，本申請所述的“適宜產(chǎn)脂質(zhì)微生物生長的條件”包括ZL 01806451. 5所公開的方法以及現(xiàn)有技術(shù)已知的其它各種培養(yǎng)產(chǎn)脂質(zhì)微生物的方法。應(yīng)理解，不同的產(chǎn)脂質(zhì)微生物的培養(yǎng)條件可能有些差異，但這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的技術(shù)知識范圍之內(nèi)。本發(fā)明的碳源優(yōu)選碳水化合物，包括但不限于果糖，葡萄糖，蔗糖，糖蜜，和淀粉。 但是典型地，碳水化合物，優(yōu)選葡萄糖用作主要的碳源。脂肪酸，羥基形式的脂肪酸，三酸甘油酯，和雙-和單-酸甘油酯也可用作碳源。本發(fā)明的碳源可以選擇醇碳源。所述的醇碳源是指能夠作為碳源用于本發(fā)明的微生物生產(chǎn)脂質(zhì)方法的醇，例如甲醇，乙醇，異丙醇和甘油，但是為了本發(fā)明的目的，所述醇碳源不包括羥基有機酸如乳酸和類似的化合物。本發(fā)明優(yōu)選的氮源是酵母提取物，尿素，硝酸鹽，亞硝酸鹽，大豆蛋白，氨基酸，蛋白質(zhì)，玉米漿，動物性副產(chǎn)物，無機銨鹽。其它營養(yǎng)源包括磷酸鹽，維生素(如維生素B12，硫胺素)，痕量金屬(如鋅，銅，鈷，鎳，鐵，錳，鉬)，主要金屬(如鎂，鈣，鈉，鉀)。痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(例如MgSO4 · 7H20 ；MnCl2 · 4H20 ；ZnSO4 · 7H20 ；CoCl2 · 6H20 ；Na2MoO4 · 2H20 ；CuSO4 · 5H20 ；NiSO4 · 6H20 ；FeSO4 · 7H20 ；CaCl2 ；K2SO4 ；KCl ；和 Na2SO4)。通常，培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到至少85g/L時，可進(jìn)行第二階段的培養(yǎng)。本申請中，通過離心收集的菌體，去離子水洗滌兩次后干燥至恒重、稱重，即可計算得到相應(yīng)的生物量干重，以g/L發(fā)酵液計。在一個優(yōu)選實施方式中，當(dāng)生物量干重達(dá)到90g/L時，開始進(jìn)行第二階段的培養(yǎng)。 在其它優(yōu)選實施方式中，當(dāng)生物量干重達(dá)到90_120g/L時，開始進(jìn)行第二階段的培養(yǎng)。在此階段，微生物利用底物的主要用途不是提高生物量密度，而是利用該底物生產(chǎn)脂質(zhì)。應(yīng)理解地是在生物量密度提高階段微生物也產(chǎn)生脂質(zhì)；但是，如上所述，在生物量密度提高階段的主要目的是提高生物量密度?？赏ㄟ^控制發(fā)酵罐頂部空間中的氧量來控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量，或優(yōu)選通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基的搖動(或攪拌)速度來控制。在發(fā)酵開始時，使用高的攪拌速度和通氣量，使DO值接近飽和，在生物量提高階段，發(fā)酵罐中的溶氧控制在至少10%。到在生產(chǎn)階段，需要在控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧濃度< 3.0%的同時，控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度 ^ 15g/L發(fā)酵液。生產(chǎn)階段的碳源與第一階段的碳源可以相同，可來自各種碳水化合物，包括，但不限于果糖，葡萄糖，蔗糖，糖蜜，和淀粉。當(dāng)使用這些碳水化合物作為碳源時，“碳源濃度”通常也稱為“殘?zhí)菨舛取薄？刹捎帽绢I(lǐng)域周知的技術(shù)來控制碳源濃度，通過監(jiān)控殘?zhí)紳舛?實時或階段性監(jiān)控碳源濃度)，并根據(jù)監(jiān)控到的碳源濃度對補充碳源的流加速度進(jìn)行調(diào)整，從而控制發(fā)酵罐中碳源的濃度。在優(yōu)選的實施例中，生產(chǎn)階段的碳源濃度較佳控制在< 10g/L的水平。在其它優(yōu)選的實施例中，生產(chǎn)階段的碳源濃度較佳控制在5 10g/L的水平。本發(fā)明在5L發(fā)酵罐的應(yīng)用實驗，低殘?zhí)堑脱跽{(diào)控下，DHA的產(chǎn)率可以達(dá)到5. 98g/ L每天，5. 32g/L每天以及5. 57g/L每天，高于高殘?zhí)堑腿苎醯?. 44g/L每天，4. 06g/L每天以及4. 44g/L每天。顯然控制低殘?zhí)堑臈l件下，進(jìn)行低溶氧調(diào)控，DHA的產(chǎn)率更高。脂質(zhì)的提取和分析方法是本領(lǐng)域周知的。例如，可按照國標(biāo)GBT22223-2008的方法進(jìn)行破壁、脂質(zhì)提取和脂肪酸組分檢測。本申請也包括采用本申請方法獲得的脂質(zhì)，其中，與采用其它方法相比，采用本發(fā)明方法對促進(jìn)脂質(zhì)中DHA含量效果更好。下文將以具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。應(yīng)理解，本申請并不限于這些具體的實施例。實施例1利用搖瓶培養(yǎng)，分析溶氧和非醇碳源葡萄糖的濃度水平對裂壺藻藻油中DHA含量及DHA產(chǎn)量的影響。培養(yǎng)步驟如下(1)將保藏于超低溫冰箱中的甘油管菌種劃線接種到斜面培養(yǎng)活化，活化培養(yǎng)基為葡萄糖5g/L，蛋白胨lg/L，酵母粉lg/L，瓊脂粉18g/L，海鹽30g/L。28°C培養(yǎng)40小時。(2)挑活化后的單菌落，接種到種子液培養(yǎng)基(配方見表1)中，液裝量 50ml/250ml三角瓶，28°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)48小時。種子液濃度約干重15_20g/L。表1種子培養(yǎng)基配方(g/L)
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物的方法，所述的脂質(zhì)為含有多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)，所述方法包括在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為低于或等于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于15g/L。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物為含有多不飽和脂肪酸的多酮合成酶系統(tǒng)、且可以利用該系統(tǒng)來生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物選自破囊壺菌目、交替單胞菌目和弧菌目。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多不飽和脂肪酸選自ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的ω-3多不飽和脂肪酸選自DHA、DPA 禾P EPA0
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為低于或等于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于10g/L。
7.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到90g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為低于或等于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于10g/L。
8.—種生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在適宜產(chǎn)脂質(zhì)微生物生長的條件下培養(yǎng)該產(chǎn)脂質(zhì)微生物；和(2)在培養(yǎng)的產(chǎn)脂質(zhì)微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為低于或等于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于15g/ L ；從而進(jìn)行脂質(zhì)生產(chǎn)。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到85g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為等于或低于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于10g/L。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)的微生物的生物量干重達(dá)到90g/L或以上之后，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平維持為等于或低于3%，同時使發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度維持為低于或等于10g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)脂質(zhì)的方法。具體而言，本發(fā)明涉及培養(yǎng)生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物的方法以及生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，所述脂質(zhì)為含多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。本發(fā)明的方法包括在發(fā)酵的特定時期保持低溶氧水平，且同時保持低碳源濃度水平。
文檔編號C12P7/64GK102485898SQ20101056998
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者吳清杭, 常桂芳, 戴小軍, 田桂尾 申請人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司