專利名稱：使用米糠麩皮復(fù)合原料和灰樹花誘變菌株生產(chǎn)多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及使用一株適合在米糠和麩皮復(fù)合 物為碳源和氮源的培養(yǎng)基上生長的灰樹花誘變菌株，發(fā)酵并高產(chǎn)多糖的方法。
背景技術(shù)：
國內(nèi)外科學(xué)研究和國內(nèi)市場表明食用菌多糖能增強(qiáng)人體免疫力，輔助治療腫瘤 等疾病，已成為腫瘤生物療法選用的輔助用品。國內(nèi)由食用菌子實(shí)體制成的藥字號產(chǎn)品 有安徽蕪湖的靈芝膠囊、浙江慶元的灰樹花膠囊等，由食用菌提取物制成的非藥字號保健 品也有銷售。國際上新西蘭產(chǎn)有“GanoPoly”(甘諾寶力)多糖提取物系列產(chǎn)品，銷往美 國、澳大利亞、中國(包括香港和臺灣)等地方。該產(chǎn)品的發(fā)明人高益槐是國際知名食用 菌產(chǎn)品開發(fā)專家，曾經(jīng)獲得愛因斯坦發(fā)明獎。高益槐發(fā)明的“GanoPoly”系列產(chǎn)品主要由 靈芝、云芝、猴頭等提取的多糖與殼聚糖一道復(fù)合構(gòu)成，用于提高免疫力、輔助抗腫瘤治療 等。新西蘭安發(fā)保健品有限公司現(xiàn)在中國福建泉州建有食用菌多糖的生產(chǎn)基地。在各種 食用菌多糖的研究中，現(xiàn)在已有研究說明，藥食兩用食用菌灰樹花的多糖也具有較好的提 高免疫力、輔助抗腫瘤治療等的功效，值得引起足夠的重視，例如Ohno Naohito、Suzuki Iwao等從灰樹花菌體中提取灰樹花多糖的藥效試驗(yàn)表明，灰樹花多糖具有抗腫瘤作用和 免疫調(diào)節(jié)作用(參考文獻(xiàn)見① Ohno N, Lino K, Suzuki I et al. Neutral and acidic antitumor polysaccharides extracted from cultured fruit bodies of Grifola Frondosa [J]. Chem. Pharm. Bull, 1985，33(3):1181-1186 ；② Naohito Ohno, Yoshiyuki Adachi, Iwao Suzuki,et al. characterization of the antiumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa [J].Chem. pharm. Bull. 1986, 34(4):1709 ； ③Iwao Suzuki,Koichi Hashimoto, Shozo Oikawa, et al. Antiumor and immunmodulating activity of a β -glucan obtained from liquid-cultureed Grifola frondosa [J]. chem. Pharm Bull, 1986，37(2) :410.)?；覙浠?fri/bh /ro/^om)是一種藥食兩用的食用菌，屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，無 隔擔(dān)子菌亞綱，非褶菌目，多孔菌科，樹花(或稱奇果菌)屬?；覙浠ㄓ卸喾N名稱，如奇果菌、 貝葉多孔菌、千佛菌、栗子蘑、蓮花菌、舞茸等。野生灰樹花分布于日本、歐洲、北美和我國 許多地區(qū)，如黑龍江、吉林、河北、四川、云南、廣西、福建等省區(qū)。近年來，國內(nèi)灰樹花已在一 些省份如河北、浙江、福建等省獲得栽培，用于鮮食或提取功能成分?；覙浠ㄔ耘嗟娜秉c(diǎn)是 占用土地，生產(chǎn)周期相對較長。為高效生產(chǎn)灰樹花多糖，研究人員對能工廠化生產(chǎn)的液體培 養(yǎng)方法的研究十分重視，形成多種研究成果。1986年Ohno N等報(bào)道了灰樹花液態(tài)培養(yǎng)的 研究。國內(nèi)江南大學(xué)陳石良的博士論文研究了灰樹花深層發(fā)酵技術(shù)及灰樹花的抗腫瘤多糖 (參考文獻(xiàn)見陳石良.藥用真菌灰樹花深層發(fā)酵技術(shù)及其抗腫瘤多糖的研究[D].博士學(xué) 位論文.無錫江南大學(xué)，2000.)。這類研究的內(nèi)容主要涉及培養(yǎng)基研制、培養(yǎng)工藝、適宜 菌種選育等。研究的重點(diǎn)是降低生產(chǎn)成本和提高多糖產(chǎn)量。多數(shù)工藝采用葡萄糖、糧食類 原料如淀粉、馬鈴薯等作為培養(yǎng)基，即使用到農(nóng)產(chǎn)品加工的副產(chǎn)品如米糠或麩皮，也是作為次要成分加入，一般還需要大量使用葡萄糖或其他糧食類原料?，F(xiàn)有的灰樹花菌種難以在 不添加葡萄糖或其他糧食類原料的米糠或麩皮的培養(yǎng)基上生長。本專利設(shè)計(jì)人劉偉民、楊 鎖華、顧慧敏曾對原有的灰樹花菌種在米糠培養(yǎng)基上液體發(fā)酵產(chǎn)灰樹花多糖的可能性進(jìn)行 過研究，發(fā)現(xiàn)盡管對菌株也進(jìn)行過初步紫外誘變的處理，如不添加較大量的葡萄糖，灰樹花 在米糠培養(yǎng)基上發(fā)酵不理想，所以楊鎖華和顧慧敏的碩士論文研究中，仍添加了較多的葡 萄糖，故而只以農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)品為原料生產(chǎn)灰樹花多糖以降低成本的設(shè)想并沒有能得到 真正的實(shí)現(xiàn)(參考文獻(xiàn)見楊鎖華.灰樹花發(fā)酵米糠制備多糖D)].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江江 蘇大學(xué).2006 ；顧慧敏.灰樹花在米糠培養(yǎng)基中液態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)多糖和富集有機(jī)硒的研究[D]. 碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江江蘇大學(xué).2009.)。中國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)副產(chǎn)品來源豐富。米糠、麩皮作為稻谷和小麥加工的副產(chǎn)物， 不但其營養(yǎng)成分豐富，而且價格低廉。米糠中富含淀粉、纖維素等物質(zhì)，而麩皮富含蛋白、纖 維素等物質(zhì)。從理論上講，米糠和麩皮復(fù)合已經(jīng)具備了灰樹花生長所需要的碳源和氮源的 原始物質(zhì)。在灰樹花自身纖維素酶及其他酶的作用下，灰樹花可將米糠和麩皮轉(zhuǎn)化成自身 的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長，生產(chǎn)灰樹花多糖。因此，運(yùn)用米糠、麩皮等廉價農(nóng)副產(chǎn)品，作為完全的 碳源和氮源，而不添加其他碳源和氮源，提供灰樹花液體發(fā)酵所需的碳源和氮源營養(yǎng)物質(zhì)， 生產(chǎn)具有輔助腫瘤治療的灰樹花多糖，將具有經(jīng)濟(jì)價值。本發(fā)明將得到實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的一 種有效方法。特別說明本發(fā)明所述的米糠麩皮培養(yǎng)基特指只以米糠和麩皮復(fù)合物為碳源 和氮源物質(zhì)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中不再添加其他碳源和氮源物質(zhì)。發(fā)明的關(guān)鍵問題之一為必須得到適宜在米糠和麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上生長的灰樹花 菌株，所以必須對已有菌株進(jìn)行誘變篩選，因?yàn)楝F(xiàn)有的灰樹花菌株在米糠麩皮培養(yǎng)基上生 長情況不理想，如能篩選出適宜的灰樹花菌株，則研究和生產(chǎn)將有可能取得突破。目前微 生物的物理選育方法主要有紫外誘變、離子束誘變、微波誘變等。為了誘變篩選出適合在米 糠和麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)多糖的灰樹花菌株，有必要將紫外誘變與微波誘變進(jìn)行復(fù) 合，強(qiáng)化誘變的極端環(huán)境，擴(kuò)大被試灰樹花出發(fā)菌株突變的位點(diǎn)范圍，提高得到正突變菌株 的可能性。本發(fā)明所采用的紫外誘變與微波誘變進(jìn)行復(fù)合，誘變得到適合在米糠和麩皮培 養(yǎng)基上生長并產(chǎn)灰樹花多糖的高效菌株的思路還未見有同類報(bào)道，所得菌株也為首次發(fā)明 得到。本發(fā)明的另一關(guān)鍵問題為必須得到使用誘變菌株在米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵 高產(chǎn)灰樹花多糖的工藝方法，這種研究也未見報(bào)道。綜上所述，本發(fā)明的灰樹花多糖的生產(chǎn) 方法具有鮮明的創(chuàng)新特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決前述現(xiàn)有灰樹花多糖研究和生產(chǎn)技術(shù)中的不足，為了降低生產(chǎn)成本， 考慮采用大宗農(nóng)產(chǎn)品稻谷和小麥等加工的副產(chǎn)品米糠和麩皮作為培養(yǎng)基的碳源和氮源，不 再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，進(jìn)行液體發(fā)酵，以節(jié)約原料成本、減少使用土地和降低生 產(chǎn)周期，但這需要誘變篩選出在米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上適宜生長的灰樹花菌株和選擇適宜 的生產(chǎn)工藝方法。因此，為實(shí)現(xiàn)上述目的，需要在自然選育之外，通過生物技術(shù)手段對灰樹 花菌株進(jìn)行誘變，篩選出適宜在米糠麩皮培養(yǎng)基上高產(chǎn)多糖的灰樹花菌株，并研究得到適 宜于該誘變菌株的發(fā)酵工藝方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下利用誘變得到的灰樹花菌株，發(fā)酵只以米糠和麩皮復(fù)合原料為碳源和氮源的培養(yǎng)基，生產(chǎn)灰樹花多糖按照下述步驟進(jìn)行(1)采用植物水 解酶對米糠和麩皮進(jìn)行處理，按:34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1 :15-1 :25，酶解時間 為12-1 ； (2)將得到處理液作為培養(yǎng)基用于搖瓶發(fā)酵，米糠使用量為3-llg/100mL培養(yǎng) 基，麩皮的使用量為3-llg/100mL培養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫酸鎂0. 75 g/L，pH自 然，裝樣量40%，接種量10%，培養(yǎng)溫度oC,轉(zhuǎn)速150-180r/min，培養(yǎng)時間7_9d ； (3)將 液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，用蒸餾水清洗滌，干燥至恒重得菌絲體；(4)將上述 菌絲體經(jīng)常規(guī)水提取、脫蛋白及乙醇沉淀即可得胞內(nèi)多糖；(5)發(fā)酵液離心后的上清液脫 蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。其中所述的植物水解酶為Viscozyme L。在本發(fā)明的一個方面中，利用誘變得到的灰樹花菌株，在生產(chǎn)型的發(fā)酵罐中按照 發(fā)酵罐80%的容積裝入米糠和麩皮復(fù)合原料為碳源和氮源的培養(yǎng)基，生產(chǎn)灰樹花多糖。(1) 使用植物水解酶，按:34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1 :15-1 :25，酶解時間為12-1 對米糠和麩皮進(jìn)行處理，(2)將得到處理液作為培養(yǎng)基用于在發(fā)酵罐中發(fā)酵，米糠的使用量 為8-llg/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為8_llg/100mL培養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫 酸鎂0.75 g/L，pH自然，裝樣量為發(fā)酵罐容積的80%，接種量8-10%，培養(yǎng)溫度^°C48°G，通 無菌空氣量為1 0. 6-1 0. 9v/v/min，攪拌速度為150_180r/min，罐表壓為50kPa，培養(yǎng)時 間2. 5-4d ； (3)將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，用蒸餾水清洗滌，干燥至恒重得菌 絲體；(4)將上述菌絲體經(jīng)常規(guī)水提取、脫蛋白及乙醇沉淀即可得胞內(nèi)多糖；(5)發(fā)酵液離 心后的上清液脫蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。其中所述的植物水解酶為Viscozyme L0本發(fā)明中使用的灰樹花菌株JSUlO已經(jīng)于2010年10月8日保藏在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏編號為CGMCC No. 4179，經(jīng)鑒定為奇 果菌((JriiWa sp.)。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明采用發(fā)明人在同時申請的另一個發(fā)明專利中公布的灰樹花誘變菌株JSU10，在 不加其他碳源和氮源的米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)灰樹花多糖，與原始菌株相比產(chǎn)量 更高，菌絲干重和菌絲多糖分別提高了 39. 24%和42. 58%。本發(fā)明融合三種創(chuàng)新不加其 他碳源和氮源的米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基技術(shù)；采用新獲得的在不加其他碳源和氮源的米糠麩 皮復(fù)合培養(yǎng)基上生長速度更快、多糖產(chǎn)量更高的誘變菌株JSUlO作為發(fā)酵菌株；得到誘變 菌株JSUlO在米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上生長生產(chǎn)灰樹花多糖的工藝方法。這三種創(chuàng)新使得 本發(fā)明具有明顯的有益效果，可以降低生產(chǎn)成本，節(jié)約原料成本、減少使用土地和降低生產(chǎn) 周期，生產(chǎn)出高價值的具有輔助抗腫瘤治療效果的灰樹花多糖。本發(fā)明使用了經(jīng)紫外-微 波復(fù)合誘變法誘變并篩選出的灰樹花新菌株，即具有高生長速率和高多糖產(chǎn)量的突變菌株 JSU10，所得菌株適合在米糠和麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上生長快并高產(chǎn)灰樹花多糖，其液體發(fā)酵的 菌絲干重和多糖較出發(fā)菌株分別提高了 39. 24%和42. 58%?；覙浠ǘ嗵蔷哂休o助抗腫瘤治 療的價值，使得灰樹花已經(jīng)成為一種重要的藥用真菌，但灰樹花多糖大規(guī)模生產(chǎn)依然要面 對成本高、產(chǎn)量低等一系列問題。基于此，本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供在不加其他碳源 和氮源的米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上生長速度更快、多糖產(chǎn)量更高的灰樹花誘變菌株JSUlO發(fā) 酵生產(chǎn)灰樹花多糖的工藝方法。所述工藝方法為灰樹花誘變菌株JSUlO在米糠麩皮復(fù)合培 養(yǎng)基上發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的工藝方法，該方法較現(xiàn)有的其他灰樹花多糖的生產(chǎn)方法產(chǎn)生了有益的效果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種灰樹花菌株變株JSUlO (已經(jīng)同時另行申請專利)，可以在不加其 他碳源和氮源的米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上相對于原有的灰樹花菌株具有高生長速率和高多 糖產(chǎn)量；該灰樹花菌株JSUio已經(jīng)于2010年10月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏菌株編號為CGMCC No. 4179，經(jīng)鑒定為奇果菌(Cri/bh sp.)。本發(fā)明提供了采用誘變得到的菌株JSUlO生產(chǎn)灰樹花多糖的生產(chǎn)工藝方法。在具體實(shí)施方式
中，使用丹麥諾維信公司生產(chǎn)的酶活為1590. 41IU/mL(FPU酶活) 的植物水解酶Viscozyme L，按34_38FPU/g原料添加酶，固液比采用1 :20，酶解時間為1 對米糠和麩皮進(jìn)行處理，得到處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵。實(shí)施例一
灰樹花菌株采用誘變得到的JSUlO菌株。使用丹麥諾維信公司生產(chǎn)的酶活為 1590. 41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按34U/g原料添加酶，固液比采用 ι :15，酶解時間為1 對米糠和麩皮進(jìn)行處理，得到處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，米糠使用 量為3g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為3g/100mL培養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫酸鎂 0. 75 g/L，pH自然，搖瓶的裝樣量為40%容積，接種量10%，培養(yǎng)溫度^°C，轉(zhuǎn)速150r/min， 培養(yǎng)時間7d。將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，再用蒸餾水洗滌3次，以除去菌絲 體表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風(fēng)干燥箱中，在60°C條件下干燥至恒重，經(jīng)稱量即得菌絲干 重。向烘干的菌絲中加入一定體積蒸餾水，經(jīng)研磨后，在80°C水浴中浸提;3h，3000r/min離 心取上清液，kvage法脫蛋白后，再用3倍體積的95%的乙醇溶液醇沉提取胞內(nèi)多糖。在 4°C的冰箱中醇沉Mh，經(jīng)離心、冷凍干燥，用苯酚-硫酸法測定多糖含量。發(fā)酵液離心后的 上清液適當(dāng)濃縮到原來的1/5的體積，Sevage法脫蛋白后用3倍體積的95%的乙醇提取胞 外多糖，并且在4°C的冰箱中醇析M小時，離心即得到胞外粗多糖的沉淀。將此沉淀物用丙 酮、乙醚依次洗滌后，干燥，稱量得到胞外多糖的質(zhì)量。得到菌絲干重為0. 547g/100mL,胞外 多糖為0. 036g/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為0. 104g/100mL培養(yǎng)液。實(shí)施例二
使用丹麥諾維信公司生產(chǎn)的酶活為1590. 41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按38FPU/g原料添加酶，固液比采用1 :25，酶解時間為1 對米糠和麩皮進(jìn)行處理，得到 處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，米糠使用量為llg/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為llg/100mL 培養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫酸鎂0. 75 g/L，pH自然，搖瓶的裝樣量為40%容積，接種 量10%，培養(yǎng)溫度28 °G，轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時間9d。將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離 后，再用蒸餾水洗滌3次，以除去菌絲體表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風(fēng)干燥箱中，在60°C 條件下干燥至恒重，經(jīng)稱量即得菌絲干重。向烘干的菌絲中加入一定體積蒸餾水，經(jīng)研磨 后，在80°C水浴中浸提;3h，3000r/min離心取上清液，Sevage法脫蛋白后，再用3倍體積的 95%的乙醇溶液醇沉提取胞內(nèi)多糖。在4°C的冰箱中醇沉Mh，經(jīng)離心、冷凍干燥，用苯酚-硫 酸法測定多糖含量。發(fā)酵液離心后的上清液適當(dāng)濃縮到原來的1/5的體積，Sevage法脫蛋 白后用3倍體積的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4°C的冰箱中醇析M小時，離心即得 到胞外粗多糖的沉淀。將此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗滌后，干燥，稱量得到胞外多糖的質(zhì)量。得到菌絲干重為1.236g/100mL，胞外多糖為0.089g/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為0. 187 g/IOOmL培養(yǎng)液。實(shí)施例三
使用丹麥諾維信公司生產(chǎn)的酶活為1590. 41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按35FPU/g原料添加酶，固液比采用1 :18，酶解時間為14h對米糠和麩皮進(jìn)行處理，得到 處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，米糠使用量為9g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為5g/100mL培 養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫酸鎂0. 75 g/L，pH自然，搖瓶的裝樣量為40%容積，接種量 10%，培養(yǎng)溫度觀°G，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時間7d。將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后， 再用蒸餾水洗滌3次，以除去菌絲體表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風(fēng)干燥箱中，在60°C條 件下干燥至恒重，經(jīng)稱量即得菌絲干重。向烘干的菌絲中加入一定體積蒸餾水，經(jīng)研磨后， 在80°C水浴中浸提池，3000r/min離心取上清液，Sevage法脫蛋白后，再用3倍體積的95% 的乙醇溶液醇沉提取胞內(nèi)多糖。在4°C的冰箱中醇沉Mh，經(jīng)離心、冷凍干燥，用苯酚-硫酸 法測定多糖含量。發(fā)酵液離心后的上清液適當(dāng)濃縮到原來的1/5的體積，Sevage法脫蛋白 后用3倍體積的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4°C的冰箱中醇析M小時，離心即得到胞 外粗多糖的沉淀。將此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗滌后，干燥，稱量得到胞外多糖的質(zhì)量。得 到菌絲干重為0. 851g/100mL，胞外多糖為0. 07g/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為0. 130 g/IOOmL 培養(yǎng)液。實(shí)施例四
使用丹麥諾維信公司生產(chǎn)的酶活為1590. 41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按35FPU/g原料添加酶，固液比采用1 :17，酶解時間為IMi對米糠和麩皮進(jìn)行處理，得到 處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，米糠使用量為5g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為4g/100mL培 養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.75 g/L，pH自然，搖瓶的裝樣量為40%容積，接種 量10%，培養(yǎng)溫度28 °G，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時間7d。將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離 后，再用蒸餾水洗滌3次，以除去菌絲體表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風(fēng)干燥箱中，在60°C 條件下干燥至恒重，經(jīng)稱量即得菌絲干重。向烘干的菌絲中加入一定體積蒸餾水，經(jīng)研磨 后，在80°C水浴中浸提;3h，3000r/min離心取上清液，Sevage法脫蛋白后，再用3倍體積的 95%的乙醇溶液醇沉提取胞內(nèi)多糖。在4°C的冰箱中醇沉Mh，經(jīng)離心、冷凍干燥，用苯酚-硫 酸法測定多糖含量。發(fā)酵液離心后的上清液適當(dāng)濃縮到原來的1/5的體積，Sevage法脫蛋 白后用3倍體積的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4°C的冰箱中醇析M小時，離心即得 到胞外粗多糖的沉淀。將此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗滌后，干燥，稱量得到胞外多糖的質(zhì) 量。得到菌絲干重為0. 547g/100mL,胞外多糖為0. 052g/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為0. 141 g/IOOmL培養(yǎng)液。實(shí)施例五
利用誘變得到的灰樹花菌株JSU10，在生產(chǎn)型的發(fā)酵罐中按照發(fā)酵罐80%的容積裝入 米糠和麩皮復(fù)合原料為碳源和氮源的培養(yǎng)基，生產(chǎn)灰樹花多糖。使用丹麥諾維信公司生產(chǎn) 的酶活為1590. 41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按34FPU/g原料添加酶， 固液比采用1 :15，酶解時間為1 對米糠和麩皮進(jìn)行處理，得到處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā) 酵，米糠的使用量為8g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為8g/100mL培養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀 1.5g/L，硫酸鎂0.75 g/L, pH自然，接種量8%，培養(yǎng)溫度^°C，通無菌空氣量為1 0. 6v/v/min，攪拌速度為150r/min，罐表壓為50kPa，培養(yǎng)時間2. 5d。將液體培養(yǎng)所得的菌絲體 經(jīng)離心分離后，再用蒸餾水洗滌3次，以除去菌絲體表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風(fēng)干燥箱 中，在60°C條件下干燥至恒重，經(jīng)稱量即得菌絲干重。向烘干的菌絲中加入一定體積蒸餾 水，經(jīng)研磨后，在80°C水浴中浸提;3h，3000r/min離心取上清液，Sevage法脫蛋白后，再用 3倍體積的95%的乙醇溶液醇沉提取胞內(nèi)多糖。在4°C的冰箱中醇沉Mh，經(jīng)離心、冷凍干 燥，用苯酚-硫酸法測定多糖含量。發(fā)酵液離心后的上清液適當(dāng)濃縮到原來的1/5的體積， Sevage法脫蛋白后用3倍體積的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4°C的冰箱中醇析M小 時，離心即得到胞外粗多糖的沉淀。將此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗滌后，干燥，稱量得到胞 外多糖的質(zhì)量。得到菌絲干重為7. Og/L，胞內(nèi)多糖為0. 8g/L培養(yǎng)液。實(shí)施例六
利用誘變得到的灰樹花菌株JSU10，在生產(chǎn)型的發(fā)酵罐中按照發(fā)酵罐80%的容積裝入 米糠和麩皮復(fù)合原料為碳源和氮源的培養(yǎng)基，生產(chǎn)灰樹花多糖。使用丹麥諾維信公司生產(chǎn) 的酶活為1590. 41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按38FPU/g原料添加酶，固 液比采用1 :25，酶解時間為1 對米糠和麩皮進(jìn)行處理，得到處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵， 米糠的使用量為llg/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為llg/100mL培養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀 1. 5g/L，硫酸鎂0. 75 g/L，pH自然，接種量10%，培養(yǎng)溫度28 °G，通無菌空氣量為1 :0. 9v/v/ min，攪拌速度為180r/min，罐表壓為50kPa，培養(yǎng)時間4d。將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離 心分離后，再用蒸餾水洗滌3次，以除去菌絲體表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風(fēng)干燥箱中， 在60°C條件下干燥至恒重，經(jīng)稱量即得菌絲干重。向烘干的菌絲中加入一定體積蒸餾水，經(jīng) 研磨后，在80°C水浴中浸提;3h，3000r/min離心取上清液，Sevage法脫蛋白后，再用3倍體 積的95%的乙醇溶液醇沉提取胞內(nèi)多糖。在4°C的冰箱中醇沉Mh，經(jīng)離心、冷凍干燥，用苯 酚-硫酸法測定多糖含量。發(fā)酵液離心后的上清液適當(dāng)濃縮到原來的1/5的體積，Sevage 法脫蛋白后用3倍體積的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4°C的冰箱中醇析M小時，離心 即得到胞外粗多糖的沉淀。將此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗滌后，干燥，稱量得到胞外多糖 的質(zhì)量。得到菌絲干重為11.5g/L，胞內(nèi)多糖為1. lg/L培養(yǎng)液。實(shí)施例七
利用誘變得到的灰樹花菌株JSUio和誘變前的實(shí)驗(yàn)室保存的出發(fā)灰樹花菌株，在生產(chǎn) 型的發(fā)酵罐中按照發(fā)酵罐80%的容積裝入米糠和麩皮復(fù)合原料為碳源和氮源的培養(yǎng)基，生 產(chǎn)灰樹花多糖。使用丹麥諾維信公司生產(chǎn)的酶活為1590. 41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶 Viscozyme L，按36FPU/g原料添加酶，固液比采用1 15，酶解時間為1 對米糠和麩皮進(jìn) 行處理，得到處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵。裝樣量為發(fā)酵罐容積的80%，培養(yǎng)溫度為^°C， 通風(fēng)量1 :0. 8v/v/mim,攪拌速度150r/min，罐表壓0. 05MPa,接種量8%，培養(yǎng)時間4d，發(fā)酵 培養(yǎng)基為米糠100g/L，麩皮110g/L，磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫酸鎂0. 75g/L，pH自然。稱重法 測定菌絲干重，苯酚硫酸法測定菌絲多糖。將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，再用蒸 餾水洗滌3次，以除去菌絲體表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風(fēng)干燥箱中，在60°C條件下干 燥至恒重，經(jīng)稱量即得菌絲干重。向烘干的菌絲中加入一定體積蒸餾水，經(jīng)研磨后，在80°C 水浴中浸提3h，3000r/min離心取上清液，Sevage法脫蛋白后，再用3倍體積的95%的乙醇 溶液醇沉提取胞內(nèi)多糖。在4°C的冰箱中醇沉Mh，經(jīng)離心、冷凍干燥，用苯酚-硫酸法測定 多糖含量。發(fā)酵液離心后的上清液適當(dāng)濃縮到原來的1/5的體積，Sevage法脫蛋白后用3倍體積的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4°C的冰箱中醇析M小時，離心即得到胞外粗多 糖的沉淀。將此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗滌后，干燥，稱量得到胞外多糖的質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié) 果為(1)突變菌株JSUlO和出發(fā)菌株在相同條件和培養(yǎng)基中發(fā)酵，菌絲干重分別為10. Og/ L和7. 21g/L，突變菌株JSUlO的菌絲干重較出發(fā)菌株提高了 39. 24%. (2)突變菌株JSUlO 和出發(fā)菌株在相同條件和培養(yǎng)基中發(fā)酵，菌絲多糖兩者分別為1.02g/L和0.718g/L，突變 菌株JSUlO的菌絲多糖較出發(fā)菌株提高了 42. 58%。發(fā)酵試驗(yàn)表明，JSUlO和原始菌株相比， 發(fā)酵性能發(fā)生了變化。
權(quán)利要求
1.使用米糠麩皮復(fù)合原料和灰樹花誘變菌株生產(chǎn)多糖的方法，利用誘變得到的灰樹花 菌株，發(fā)酵只以米糠和麩皮復(fù)合原料為碳源和氮源的培養(yǎng)基，按照下述步驟進(jìn)行(1)采用 植物水解酶對米糠和麩皮進(jìn)行處理，按34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1 :15-1 :25，酶 解時間為12-1 ； (2)將得到處理液作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，米糠使用量為3-llg/100mL培 養(yǎng)基，麩皮的使用量為3-llg/100mL培養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫酸鎂0. 75 g/L，pH 自然，裝樣量40%，接種量10%，培養(yǎng)溫度°G，轉(zhuǎn)速150-180r/min，培養(yǎng)時間7_9d ； (3) 將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，用蒸餾水清洗滌，干燥至恒重得菌絲體；(4)將上 述菌絲體經(jīng)常規(guī)水提取、脫蛋白及乙醇沉淀即可得胞內(nèi)多糖；(5)發(fā)酵液離心后的上清液 脫蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。
2.使用米糠麩皮復(fù)合原料和灰樹花誘變菌株生產(chǎn)多糖的方法，其特征在于在利用誘 變得到的灰樹花菌株，生產(chǎn)型的發(fā)酵罐中按照發(fā)酵罐80%的容積裝入米糠和麩皮復(fù)合原 料為碳源和氮源的培養(yǎng)基，生產(chǎn)灰樹花多糖，按照下述步驟進(jìn)行(1)使用植物水解酶，按 34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1 :15-1 :25，酶解時間為12-1 對米糠和麩皮進(jìn)行處 理，(2)將得到處理液作為培養(yǎng)基用于在發(fā)酵罐中發(fā)酵，米糠的使用量為8-llg/100mL培 養(yǎng)基，麩皮的使用量為8-llg/100mL培養(yǎng)基，添加磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫酸鎂0. 75 g/L, pH 自然，裝樣量為發(fā)酵罐容積的80%，接種量8-10%，培養(yǎng)溫度°G，通無菌空氣量為1 0. 6-1 0. 9v/v/min，攪拌速度為 150_180r/min，罐表壓為 50kPa，培養(yǎng)時間 2. 5_4d ;(3)將 液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，用蒸餾水清洗滌，干燥至恒重得菌絲體；(4)將上述 菌絲體經(jīng)常規(guī)水提取、脫蛋白及乙醇沉淀即可得胞內(nèi)多糖；(5)發(fā)酵液離心后的上清液脫 蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。
3.權(quán)利要求1或2所述的使用米糠麩皮復(fù)合原料和灰樹花誘變菌株生產(chǎn)多糖的方法， 其特征在于其中所述的植物水解酶為Viscozyme L。
4.權(quán)利要求1或2所述的使用米糠麩皮復(fù)合原料和灰樹花誘變菌株生產(chǎn)多糖的方法， 其特征在于其中所述的誘變得到的灰樹花菌株其菌株保藏編號為CGMCC No. 4179。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用技術(shù)和食品生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了使用米糠麩皮復(fù)合原料和灰樹花誘變菌株生產(chǎn)多糖的方法。按照下述步驟進(jìn)行(1)采用植物水解酶對米糠和麩皮進(jìn)行處理；(2)將得到處理液作為培養(yǎng)基使用誘變得到的灰樹花菌株發(fā)酵，菌株保藏編號為CGMCCNo.4179；(3)將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，用蒸餾水清洗滌，干燥至恒重得菌絲體；(4)將上述菌絲體經(jīng)常規(guī)水提取、脫蛋白及乙醇沉淀即可得胞內(nèi)多糖；(5)發(fā)酵液離心后的上清液脫蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。本發(fā)明可以降低生產(chǎn)成本，節(jié)約原料成本、減少使用土地和降低生產(chǎn)周期，生產(chǎn)出高價值的具有輔助抗腫瘤治療效果的灰樹花多糖。
文檔編號C12P19/04GK102080113SQ201010579048
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者任曉鋒, 劉偉民, 張建, 張志才, 徐立平, 楊鎖華, 趙杰文, 郭春梅, 顧慧敏 申請人:江蘇大學(xué)