專利名稱：新型甲型h1n1流感病毒熒光定量rt-pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型甲型Hmi流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。背景技術(shù)：
2009年4月，在墨西哥爆發(fā)的新型Hmi流感是由A型流感病毒引起的豬呼吸道傳 染病，初步研究檢測(cè)出這種病毒是A型流感病毒，攜帶有Hmi亞型豬流感病毒毒株，包含有 禽流感、豬流感和人流感三種流感病毒的脫氧核糖核酸基因片斷，同時(shí)擁有亞洲豬流感和 非洲豬流感病毒特征。截止到2010年7月30日，全球214個(gè)國家有Hmi感染病例報(bào)告， 造成18398人死亡。2010年6月3日，世界衛(wèi)生組織應(yīng)急委員會(huì)在對(duì)Hmi全球流行趨勢(shì) 進(jìn)行評(píng)估之后指出，HlNl人類大流行并沒有結(jié)束，并呼吁對(duì)于這一流感病毒繼續(xù)進(jìn)行全球 性的監(jiān)測(cè)。2010年8月10日，WHO宣布novel HlNl influenza大流行疫情已告結(jié)束，全球 進(jìn)入了“后流感大流行時(shí)期”(post-pandemic period)。但同時(shí)強(qiáng)調(diào)，即使進(jìn)入了后流行時(shí) 期，并不意味著novel HlNl inf luenzavirus (novel HlNl IV)已經(jīng)消失。根據(jù)其它傳染病 的流行經(jīng)驗(yàn)WHO預(yù)期，novel HlNl IV會(huì)像其它的季節(jié)性流感一樣，將持續(xù)傳播多年，各國 仍應(yīng)密切注意防范。目前在全球的一些國家或地區(qū)該疫病仍在流行，該病毒的感染和死亡 仍在繼續(xù)。2010年6月18日，中國香港研究人員發(fā)現(xiàn)，該病毒在過去的一年半的時(shí)間里在 豬體內(nèi)發(fā)生了重組。Cassio Pontes Octaviani (2010年8月)指出，甲型Hmi流感病毒具 有易與H5W型禽流感病毒雜交的特性，有可能誕生傳染性更強(qiáng)的新病毒。這一發(fā)現(xiàn)更加令 人擔(dān)憂。所以必須繼續(xù)加強(qiáng)該疫情的監(jiān)視。甲型Hmi流感傳播快，危害大，因此早期快速診斷就成為預(yù)防和控制該病的重要 條件?；诜肿由飳W(xué)技術(shù)的熒光定量RT-PCR方法，能夠快速準(zhǔn)確的對(duì)該病毒進(jìn)行實(shí) 時(shí)定量監(jiān)測(cè)，及時(shí)捕獲病原流行信息，對(duì)疫情予以評(píng)估和預(yù)報(bào)非常必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明建立了靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性良好、操作簡單、快速的新型Hmi流感 病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該方法速度快、高通量，能大大縮短檢測(cè)周期，為疾病的治 療和疫情的控制提供保障，并能避免檢測(cè)過程中可能造成的生物污染。本發(fā)明的具體步驟是1、引物設(shè)計(jì)參照GenBank中公開發(fā)表的新型Hmi流感病毒HA基因序列(CY045143. 1)，應(yīng)用 PrimerPremier 5. 0軟件設(shè)計(jì)了特異性引物、Hl-probe探針序列
權(quán)利要求
1.一種新型Hmi流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1)參照新型Hmi流感病毒HA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物；(2)取備檢樣品提取病毒RNA；(3)RT-PCR 擴(kuò)增①反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括10 X RT mix 2 μ 1,2. 5mM dNTPs 2μ1，2μ1 Random, Quant Reverse Transcriptase 1 μ 1，5 μ 1 已制備的 RNA, DEPC /K 8 μ 1 ；37°C作用 lh，即反轉(zhuǎn)錄完成；②PCR 擴(kuò)增PCR 總體系為 25 μ 1，其中 IOXBuffer 2. 5 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ 1,2. 5mM dNTPs 2 μ 1，上游引物HlF-I和下游引物HlR-I各0.5 μ 1，Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，模板 1μ 1，余下用滅菌ddH20補(bǔ)足；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，然后94°C 30s,45°C 30s, 72 °C 30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸6min ；反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ 1 PCR產(chǎn)物于1 %瓊脂凝 膠中電泳；(4)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備①確定陽性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物于瓊脂凝膠中電泳后，用膠回收試劑盒提取DNA，按照常 規(guī)方法將目的片段與PMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，于氨芐青霉素酶培養(yǎng) 基37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化長出的菌落進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，菌液PCR鑒定挑取的陽性質(zhì)粒，并 通過序列測(cè)定進(jìn)行分析，測(cè)定的序列與Genebank上的標(biāo)準(zhǔn)毒株序列對(duì)比分析，確定陽性質(zhì) 粒；②陽性質(zhì)粒濃度的測(cè)定將質(zhì)粒提取物用超純水IOX稀釋后，在^Onm與^Onm波長 下測(cè)定液體中質(zhì)粒的含量，并計(jì)算每微升液體中質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)；(5)結(jié)果分析，通過ABI7500SystemSDS Software Version 1. 2軟件分析收集的熒光 曲線判定結(jié)果提取上述陽性質(zhì)粒DNA做熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋(IO7 IO1c0Pies/μ L)用于熒 光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μ 1，其中2. 5XrealMasterMix 8 μ 1，上下游引 物(H1F-2 和 H1R-2)各 0. 6μ 1，探針 0. 3μ l，20XProbe Enhancer solution 1·0μ1，模板 2 μ 1，超純水 7. 5μ 1 ；反應(yīng)條件為95°C Imin ； 95 °C 10s，60°C 15s, 68 °C :34s，40 個(gè)循環(huán)；通 過倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度檢測(cè)可知檢測(cè)到最低濃度為lOOOcopies/reaction。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型Hmi流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于 所述的特異性引物、Hl-probe探針序列如下HlF-I TACCCAGGAGATTTCATCGAHlR-I GAGGACTTCTTTCCCTTTATH1F-2 :5’ -AGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGG-3’H1R-2 :5’ -TGAGGACATGCTGCCGTTAC-3’Hl-probe :5’ -FAM-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-Eclipse-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型Hmi流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于 所述的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品為新型Hmi流感病毒HA基因CY045143. 1上335 586之間、大小 為252bp的基因片段的質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型甲型H1N1流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法是采用熒光探針技術(shù)，設(shè)計(jì)一組僅在新型H1N1流感病毒血凝素基因間保守的特異性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針，具體包括以下步驟(1)參照新型H1N1流感病毒HA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物；(2)取備檢樣品提取病毒RNA；(3)RT-PCR擴(kuò)增；(4)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備；(5)對(duì)收集的熒光曲線進(jìn)行結(jié)果分析。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，并具有良好的重復(fù)性，操作簡單快速，能大大縮短檢測(cè)周期，并能避免檢測(cè)過程中可能造成的生物污染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102127594SQ20101057932
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者李慶雷, 柴同杰 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)