專利名稱：一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測方法及試劑盒制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種馬泰勒氏蟲病(馬巴貝斯蟲病)免疫印跡檢測方法及試劑盒制備 方法，特別涉及一種采用免疫印跡試驗檢測馬泰勒氏蟲病血清抗體的方法以及及其診斷試 劑盒的制備方法，屬于動物疫病檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬泰勒氏蟲病(Theileria equi or Babesia equi)是由寄生于馬屬動物的紅細(xì) 胞內(nèi)的馬泰勒氏蟲所引起的血液原蟲病，經(jīng)硬蜱傳播。感染后主要寄生在動物血液細(xì)胞中。 臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿、脾大等癥狀，發(fā)現(xiàn)時病馬已死亡或瀕死。馬泰勒氏蟲病分布世界各地，它的流行直接與有傳播能力的蜱的分布有關(guān)。南非 的馬泰勒氏蟲病年發(fā)病率為1. 88%，致死率均在10%以上，有時接近50%。在歐洲以及俄羅 斯南部和東部大部分地區(qū)都有馬泰勒氏蟲的分布。非洲和馬達(dá)加斯加都呈地方性流行，美 洲、亞洲也都有病例報告。巴西馬泰勒氏蟲病血清學(xué)調(diào)查陽性率高達(dá)90. 6%，蘇丹馬泰勒氏 蟲病血清學(xué)調(diào)查陽性動物高達(dá)63. 5%，蒙古馬泰勒氏蟲血清學(xué)陽性動物達(dá)72. 8%。我國馬泰 勒氏蟲病主要流行于新疆、內(nèi)蒙古西部及南方各省，吉林省、青海省也是馬泰勒氏蟲病流行 地區(qū)，有的地區(qū)陽性感染率達(dá)到30%以上。據(jù)報道，在我國有14個省區(qū)都曾有該病散發(fā)或 地方性流行，發(fā)病較重的省區(qū)，平均死亡率為11. 9%。馬泰勒氏蟲病帶蟲免疫可長達(dá)7年。疫區(qū)的馬匹由于經(jīng)常遭受蜱的叮咬，反復(fù)感 染，因此一般不發(fā)病或只表現(xiàn)輕微癥狀而耐過，但由外地進(jìn)入疫區(qū)的新馬及新生的幼駒由 于沒有這種免疫性，容易發(fā)病。在沒有疫情但有蜱類活動的地區(qū)，對外來馬匹要嚴(yán)格進(jìn)行馬 泰勒氏蟲病的檢疫，防止帶蟲馬進(jìn)入。該病在世界范圍內(nèi)分布廣泛，為嚴(yán)重傳播性疾病，難以根除，因此各國均把該病列 為重要監(jiān)測的馬病之一，由于該病對國際貿(mào)易產(chǎn)生重要影響，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該 病列為對國際貿(mào)易產(chǎn)生重要影響的疾病。我國農(nóng)業(yè)部將其列為二類動物傳染病。在國際貿(mào) 易中，大多數(shù)國家簽署的雙邊檢疫協(xié)定中，將該病列為法檢項目。由于該病感染動物后，常不表現(xiàn)為明顯的臨床癥狀，因此很難從癥狀上診斷。 該病主要是通過實驗室檢驗方法進(jìn)行確診。實驗室檢驗方法常采用血清學(xué)檢測方法，主要 有間接熒光抗體試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗。間接熒光抗體試驗的缺點在于 敏感性不強(qiáng)，且容易受操作者主觀因素影響結(jié)果判斷。補(bǔ)體結(jié)合試驗的缺點是敏感性低，當(dāng) 血清中含有抗補(bǔ)體抗體或抗紅細(xì)胞抗體時都不能通過補(bǔ)體結(jié)合試驗檢測，補(bǔ)體結(jié)合試驗因 不能檢測IgG(T)亞型抗體，因此會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗雖然操作簡 便，敏感性較強(qiáng)，比補(bǔ)體結(jié)合試驗和免疫熒光抗體試驗在敏感性上有提高，但仍然容易出現(xiàn) 假陽性結(jié)果。探討研究新的檢測方法是科學(xué)技術(shù)發(fā)展的必由之路，也是疾病檢測技術(shù)發(fā)展 的要求。免疫印跡法是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方 法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋 白分析的一種常規(guī)技術(shù)，但多用于鑒定某種蛋白。1997年美國I^atricia J. Holman對馬泰勒氏蟲補(bǔ)體結(jié)合試驗陽性的血清用免疫 印跡法進(jìn)行石角認(rèn)(Patricia J. Holman, et al. Case report:Field-acquired subclinical babesia equi infection confirmed by in vitro culture.Journal of clinical micr obiology, 1997，35(2) :474-476. )0Patricia J. Holman所采用的免疫印跡方法是用化學(xué)顯 色底物DAB染色，化學(xué)顯色底物使用方便，但底物有毒、靈敏度較低。目前國內(nèi)，用免疫印跡法檢測動物疫病的研究較少，國內(nèi)無馬泰勒氏蟲病免疫印 跡雜交檢測方法及診斷試劑盒的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人進(jìn)行了大量的實驗工作，終于建立了一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡診斷試 劑盒的制備方法，本發(fā)明采集健康小型馬紅細(xì)胞體外培養(yǎng)馬泰勒氏蟲，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，將獲 得的培養(yǎng)物制成免疫印跡診斷抗原，并經(jīng)實驗室感染馬匹獲得馬泰勒氏蟲抗體陽性對照血 清。同時，在獲得診斷抗原和陽性對照血清的基礎(chǔ)上建立了馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測方 法。本發(fā)明目的是提供一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡診斷試劑盒及其制備方法，本發(fā)明 目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
(1)制備蟲體培養(yǎng)用紅細(xì)胞
無菌采集健康馬血，離心處理后用VYM’ s緩沖液洗滌、懸浮得到； 離心條件4°C -8°C低速30士5 min ；
(2)建立及擴(kuò)大馬泰勒氏蟲體外培養(yǎng)
無菌采集感染馬泰勒氏蟲病馬的抗凝血，經(jīng)離心處理，用3x VYM’s緩沖液洗滌、懸浮獲 得染蟲紅細(xì)胞后，采用HL2A-FBS組織培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)染蟲率達(dá)到1. 5%-2%時即進(jìn)行分代培 養(yǎng)；當(dāng)分代培養(yǎng)物染蟲率超過愧時進(jìn)行第一次擴(kuò)大培養(yǎng)；之后每當(dāng)染蟲率達(dá)到3%或以上 時即再次擴(kuò)大培養(yǎng)；
培養(yǎng)環(huán)境為90%N2，5%02，5%0)2 ；—個培養(yǎng)周期為24小時；
(3)制備馬泰勒氏蟲病免疫印跡雜交診斷抗原
當(dāng)步驟(2)培養(yǎng)物的染蟲率超過5%時，收集培養(yǎng)物，經(jīng)離心、洗滌，最后以PI buffer+l%NP40 溶解至清亮，再力口入 LDSsample buffer (4x) 、sample Reducing Agent (10x)，充分混勻。煮沸，迅速冷卻，獲得馬泰勒氏蟲病免疫印跡診斷抗原。(4)制備陽性對照血清
將25mL用等量10%常規(guī)異源馬血清磷酸鹽緩沖液混合的馬泰勒氏蟲紅細(xì)胞培養(yǎng)物，靜 脈注射至脾未切除的小型馬體內(nèi)，3天后用大約10000個蜱(約0. 5克)未飼喂的蜱幼蟲，裝 在一個布袋中，放置在小型馬上。13天后拿走已變成飽滿的蛹的蜱，蜱養(yǎng)6天，第6天將蜱 放到實驗用小型馬匹上8天，兩個星期后采集血清，補(bǔ)體結(jié)合試驗可檢測到馬泰勒氏蟲抗 體，即獲得陽性對照血清。取(1)馬泰勒氏蟲病免疫印跡診斷抗原、(2)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的 羊抗馬結(jié)合物、(3)陽性對照血清、陰性對照血清、(4)底物(peroxide solution+Luminolenhancer solution)、(5)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物(Marker)、(6)4 -12 % Bis-Tris 膠、(7) 硝酸纖維膜、(8)M0PS SDS Running Buffer (20x)、(9) NuPAGE Antioxidant、(10)轉(zhuǎn)印緩 沖液、(11)磷酸鹽緩沖液(pH7. 3)、(12)封閉液、(13)洗液、(14)感光膠片、(15)使用說明 書
置紙質(zhì)盒中，得到馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測試劑盒。本技術(shù)方案的優(yōu)點和特點
抗原制備用蟲體的染蟲率達(dá)到5%時即可用于制備免疫印跡診斷抗原，抗原制備周期 短，大大縮短了生產(chǎn)試劑盒的周期。本發(fā)明的另一個目的是提供一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測方法，本方法是以辣 根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗馬二抗結(jié)合物、化學(xué)發(fā)光底物在獲得診斷抗原和陽性對照血清的 基礎(chǔ)上建立的。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
(1)取4 12% Bis-Tris膠板，洗滌干凈；
(2)以SDSRunning Buffer和NuPAGE Antioxidant為溶劑，采用電泳法分離抗原蛋 白得到含有抗原蛋白的膠板；
(3)用冷藏的轉(zhuǎn)印緩沖液將抗原蛋白轉(zhuǎn)移至纖維膜；
(4)血清與抗原孵育
將轉(zhuǎn)印有抗原蛋白的膜置于封閉液中在搖床上孵育；之后將膜取出再置于以封閉液按 1:100 1:500稀釋的血清樣品中，振蕩感作；
(5)酶結(jié)合物孵育
將膜轉(zhuǎn)置于以封閉液按1:5000 1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗馬二抗 結(jié)合物，振蕩感作；
(6)底物孵育將膜移置于底物中，避光感作；得含底物孵育物的膜；
(7)曝光，顯影
吸干膜上的水，用保鮮膜將膜包好，置暗夾中，紅燈下，取感光膠片放在膜上，扣上暗 夾，曝光；在紅燈下取出膠片，放入顯影機(jī)中顯影；得顯影感光膠片；
(8)結(jié)果判斷:
當(dāng)陽性血清對照在25kDa和37kDa間出現(xiàn)兩條帶，位置約在34kDa和^kDa處時，陽 性對照成立；當(dāng)陰性血清對照無條帶出現(xiàn)時，陰性對照成立；這時可進(jìn)行檢測樣品的判定 當(dāng)在25kDa和37kDa間出現(xiàn)兩條帶，條帶位置與陽性對照相同時，可判定為陽性樣品；當(dāng)在 25kDa和37kDa間無條帶出現(xiàn)時，可判定為陰性樣品。所述底物是 peroxide solution+Luminol enhancer solution。為了獲得更好的效果，抗原蛋白工作濃度優(yōu)選1:5000。本技術(shù)方案的優(yōu)點和特點是 1、試劑用量少、成本低
本發(fā)明所用的二抗工作濃度為1:5000 1:10000，二抗的用量少，節(jié)省了試劑的消耗， 節(jié)約了成本。2、本發(fā)明方法特異性高、靈敏度高，操作更快捷
被檢血清樣品在1:500稀釋時即有很好的免疫印跡反應(yīng)，且無毒無害、特異性高；所需
6的時間短，整個試驗在4 h內(nèi)完成。3、試驗所需的條件低、試驗結(jié)果易判定和長期保存.
本發(fā)明建立的免疫印跡試驗在常溫下即可完成。由于是將反應(yīng)條帶曝光于膠片上，結(jié) 果易判定且可長期保存，不存在褪色的問題。4、本發(fā)明方法不僅能夠?qū)︸R泰勒氏蟲病血清抗體進(jìn)行檢測，更能夠?qū)ζ渌鍖W(xué) 方法如IFA、CFT、ELISA檢測為陽性的結(jié)果進(jìn)行確證，特異性比ELISA更強(qiáng)。5、用本發(fā)明檢測方法檢測馬群血清，檢測結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果。


免疫印跡法檢測馬泰勒氏蟲病陰性和陽性結(jié)果。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 1:馬泰勒氏蟲病陰性對照血清；
1.2:馬泰勒氏蟲病陰性對照血清；2.1:馬泰勒氏蟲病陽性對照血清； 2.2:馬泰勒氏蟲病陽性對照血清。
具體實施例方式為了理解本發(fā)明，下面以實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明,實施例1 制備馬泰勒氏蟲病免疫印跡診斷試劑盒
配制試劑Ulx VYM' s緩沖液CaCl2. 2H200.016 gKCl0.400 gKH2PO41.415 gMgSO4. 7H200. 154 gNa2HPO40.077 gNaCl7.077 gGlucose20.500 g(MH2O1 L攪拌溶解后，加入Adenine
0.0423 g、Guanosine 0. 0708 g，調(diào) pH 值至 7. 0-7. 2，真
空抽濾(0.22 Mm)，4°C保存?zhèn)溆谩?
2、HL2A-FBS 培養(yǎng)液
HL-I培養(yǎng)基35 mL
胎牛血清10 mL
HBlOl supplement1 mL
Hepes0.238 g
L-glutamine(IOOx)1 mL
Hypoxanthine(20mmol)0. 5 mL
Gentamicin1 mL
Antibiotic-antimycotic (IOOx) 1 mL 磁力攪拌5 min，調(diào)pH至7. 2，真空抽濾(0. 22 Mm)，4°C保存?zhèn)溆?
3、PI buffer Tris 3. 03 g
去離子水 500mL 磁力攪拌器攪拌lh，調(diào)pH 8. 0，加
EDTA (SIGMA)0. 93g
IODAOACETAMIDE(C2H4INO)(SIGMA) 0. 46g 磁力攪拌過夜，力口
TLCK (C14H22C12N2O3S)18.45 mg
制備診斷用抗原 (1)制備蟲體培養(yǎng)用紅細(xì)胞
無菌采集600 mL健康馬血至已滅菌的裝有玻璃珠的真空三角瓶中，旋轉(zhuǎn)三角瓶直至出 現(xiàn)白色凝塊。在超凈臺內(nèi)，將馬血倒入離心管中，4°C 800 xg離心30 min，吸棄血漿層和白 細(xì)胞層。用VYM’s緩沖液洗三次，每次盡可能將血漿層和白細(xì)胞層吸棄。之后加入2倍體 積的VYM’ s緩沖液，用移液器輕輕懸浮紅細(xì)胞泥，4°C 800 xg離心30 min。吸棄血漿層和 白細(xì)胞層后再加入2倍體積的VYM’ s緩沖液至紅細(xì)胞泥中，用移液器輕輕懸浮，得蟲體培養(yǎng) 用紅細(xì)胞，置聚丙烯管中，4 °C保存，備用。(2)建立馬泰勒氏蟲體外培養(yǎng)
采集感染馬泰勒氏蟲病馬的抗凝血，4°C 800 xg離心30 min，用移液器吸棄血漿層和 白細(xì)胞層。用3xVYM’s緩沖液洗三次，每次盡可能吸棄上清液和白細(xì)胞層，最后4°C 800 xg 離心30 min，得染蟲紅細(xì)胞。將1 mL HL2A-FBS培養(yǎng)液加入至M孔細(xì)胞組織培養(yǎng)板內(nèi)，吸取50μ 染蟲紅細(xì)胞 至細(xì)胞孔內(nèi)，再吸取所得蟲體培養(yǎng)用紅細(xì)胞150 μ 。將細(xì)胞組織培養(yǎng)板置37 ！培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境為93% ，2. 0%02，5%C02。每天換1次培養(yǎng)液，方法是不攪動細(xì)胞層吸棄約ImL培養(yǎng)液，再加入ImL新的 HL2A-FBS培養(yǎng)液。將板重新置前述培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)染蟲率達(dá)到1.5%- 時，進(jìn)行分代培養(yǎng)。方法是將板取出，吸棄ImL培養(yǎng)液， 再加入ImL新的HL2A-FBS培養(yǎng)液，用移液器輕輕懸浮培養(yǎng)物，得第一代培養(yǎng)物。在新的細(xì) 胞孔內(nèi)加入600 μ HL2A-FBS培養(yǎng)液，并取600 μ 第一代培養(yǎng)物至新的細(xì)胞孔內(nèi)，輕輕混 勻。另取600 μ HL2A-FBS培養(yǎng)液加入至舊的細(xì)胞孔內(nèi)。在新、舊細(xì)胞孔內(nèi)各加入100 μ 蟲體培養(yǎng)用紅細(xì)胞。將板置前述培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至染蟲率超過1。(3)馬泰勒氏蟲體外擴(kuò)大培養(yǎng)
首先將蟲體培養(yǎng)擴(kuò)大至4個細(xì)胞孔。方法是在組織細(xì)胞培養(yǎng)板中，向新的細(xì)胞孔中加 入600 PLHL2A-FBS培養(yǎng)液，取100 PL蟲體培養(yǎng)用紅細(xì)胞至新的細(xì)胞孔中；從舊的細(xì)胞孔中 吸棄約1.2 mL舊培養(yǎng)液，加入約1.2 mL新的培養(yǎng)液至舊的細(xì)胞孔內(nèi)，并吸取600 μ 培養(yǎng) 物至新的細(xì)胞孔內(nèi)。置前述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時。制備血涂片，進(jìn)行染蟲率檢測。當(dāng)染蟲率超過3%時向三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，方法是取滅菌的三角瓶Α，向其中加入 10 mL HL2A-FBS培養(yǎng)液、1 mL蟲體培養(yǎng)用紅細(xì)胞及3個細(xì)胞孔的培養(yǎng)物后，置前述培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)M小時；之后，將三角瓶A取出，從中吸棄7 mL-10 mL舊培養(yǎng)液，用新的HL-I組織 培養(yǎng)液補(bǔ)足吸棄的量，繼續(xù)置前述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時。
當(dāng)染蟲率超過3%時，再次擴(kuò)大培養(yǎng)，方法是另取2個三角瓶，向其中各加入6 mL 新的培養(yǎng)液及1 mL蟲體培養(yǎng)用紅細(xì)胞；吸棄三角瓶A中的培養(yǎng)液并加入等量的新培養(yǎng)液， 輕輕混勻后，分別吸取7 mL至2個新的三角瓶中，將它們置前述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時。按 照此法，當(dāng)染蟲率超過3%時即擴(kuò)大培養(yǎng)，從2個三角瓶至4個再至8個三角瓶。當(dāng)8個三角瓶中的染蟲率超過5%時，染蟲紅細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)完成。收集其中7個三角瓶中的培養(yǎng)物至2個50 mL離心管中，1500 rpm 4°C離心30 min ；吸棄上清液，獲得感染有馬泰勒氏蟲的紅細(xì)胞。再置1.5mL離心管中，3000 rpm 4 V 離心2 min;吸棄上清液，取750 PL細(xì)胞泥至新的離心管中，加入750 PL雙蒸水，渦旋振蕩 輕輕混勻，臺式離心機(jī)14000 rpm離心3 min。吸棄上清液，加入1. 0 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)，用移液器吹吸
輕輕混勻，再14000 rpm離心3 min ；吸棄上清液，加入1. 0 mL雙蒸水，仍用移液器吹 吸輕輕混勻，再以14000 rpm離心5 min ；吸棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液，混勻，14000 rpm 離心10 min，重復(fù)1次。吸棄上清液，加入200 μ PI buffer+l%NP40，重新溶解至清亮。取溶解物200 μ 至1支新的離心管中，加入50 μ LDS sample buffer(4x)、25 PLsample Reducing Agent (10x)，充分混勻。煮沸10分鐘，迅速放入冰盒中冷卻，即得診 斷用抗原，-20°C保存，備用。制備診斷用陽性對照血清
經(jīng)帶蟲蜱Boophilus microplus實驗室感染小型馬獲得陽性對照血清 將25mL用等量10%常規(guī)異源馬血清磷酸鹽緩沖液混合的馬泰勒氏蟲紅細(xì)胞培養(yǎng)物，靜 脈注射至脾未切除的小型馬體內(nèi)，3天后用大約10000個蜱(約0. 5克)未飼喂的蜱幼蟲，裝 在一個布袋中，放置在小型馬上。13天后拿走已變成飽滿的蛹的蜱，蜱養(yǎng)6天，第6天將蜱 放到實驗用小型馬匹上8天，兩個星期后采集血清，補(bǔ)體結(jié)合試驗可檢測到馬泰勒氏蟲抗 體，獲得馬泰勒氏蟲病免疫印跡雜交診斷陽性對照血清。封裝，-20°C保存，備用。取(1)封裝診斷用抗原、(2)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗馬結(jié)合物；(3)、 封裝陽性對照血清、陰性對照血清、(4)底物(peroxide solution+Luminol enhancer solution)、(5)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物(Marker)、(6) 4 12 % Bis-Tris膠、(7)硝酸纖 維膜、(8) MOPS SDS Running Buffer (20x)、(9) NuPAGE Antioxidant、(10)轉(zhuǎn)印緩沖 液、(11)磷酸鹽緩沖液(PH7. 3)、(12)封閉液、(13)洗液、(14)感光膠片、(15)使用說明書 置紙質(zhì)盒中，冷藏保存。實施例2 馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測 試劑配制 UlOx電泳緩沖液 Tris 121. 1 g
甘氨酸570 g 蒸餾水 4 L
2、轉(zhuǎn)印緩沖液
IOx電泳緩沖液 甲醇 蒸餾水
100 mL 200 mL 700 mL3、封閉液含0.2% Tween-20U0 %脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液
4、洗液含0.2 % Tween-20的磷酸鹽緩沖液
取 NuPAGE 4%-12% Bis-Tris 膠板，用 1 χ SDS Running Buffer 洗膠孔三次；將膠板 正面朝前放在Mini-Cell垂直電泳儀核心架內(nèi)，鎖緊。在電泳槽內(nèi)加入200 mL 1 χ SDS Running Buffer 和 500 μ NuPAGE Antioxidant，混合均勻。下槽內(nèi)加入 600 mL 1 χ SDS Running Buffer。向膠孔內(nèi)加入7μ ΙΟμ 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物(Marker)和實施例1 所得抗原樣品，抗原蛋白的工作濃度是1:5000，200V 350mA跑膠1小時，得到含有抗原蛋 白的膠板。之后將抗原蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜
先將膠、硝酸纖維膜、轉(zhuǎn)印夾、濾紙、纖維墊用轉(zhuǎn)印緩沖液浸泡，然后在轉(zhuǎn)印夾的黑面 上，依次放上纖維墊、濾紙、膠塊、纖維膜、濾紙、纖維墊，壓走氣泡，扣緊轉(zhuǎn)印夾。將轉(zhuǎn)印夾裝 在轉(zhuǎn)印槽內(nèi)，向槽內(nèi)倒入先前置于冰箱中冷藏的轉(zhuǎn)印緩沖液，將槽放于磁力攪拌器上，150 V 350 mA轉(zhuǎn)印1小時。將轉(zhuǎn)印有抗原蛋白的膜在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.3)中沖洗，然后放在含有封閉 液的容器中，置搖床上孵育1小時。將膜取出剪成若干條，正面朝下，放在裝有用封閉液按 1 500稀釋好的血清樣品的容器中，在振蕩器上振蕩感作30分鐘。結(jié)束后用洗液洗3次，每 次5分鐘。倒掉洗液，然后加入用封閉液按1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗馬二 抗結(jié)合物中，振蕩感作30分鐘。用洗液洗3次，每次5分鐘。倒掉洗液，力口入peroxide solution+Luminol enhancer solution底物，避光感作 5分鐘。用吸水紙吸干膜上的水，用保鮮膜將膜包好，將膜正面朝上擺好放在暗夾中置暗 室中，紅燈下，取1張感光膠片，放在膜上，扣上暗夾，曝光30s-60秒。在紅燈下取出膠片，放入顯影機(jī)中顯影。得顯影感光膠片。應(yīng)用例 結(jié)果判定
取實施例2所得顯影感光膠片，顯示陽性血清對照在25kDa和37kDa間出現(xiàn)兩條帶，位 置約在34kDa和^kDa處，與陽性對照相同，判定為陽性樣品。
權(quán)利要求
1.一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測試劑盒，其特征在于包括(1)馬泰勒氏蟲病免疫印跡診斷抗原(2)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗馬結(jié)合物；(3)陽性對照血清、陰性對照血清；(4)底物(5)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物；(6)4 12 % Bis-Tris 膠(7)硝酸纖維膜(8)MOPS SDS Running Buffer(9)NuPAGE Antioxidant(10)轉(zhuǎn)印緩沖液(11)磷酸鹽緩沖液(12)封閉液(13)洗液(14)感光膠片(15)使用說明書所述底物是 peroxide solution+Luminol enhancer solution。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測試劑盒，其特征在于試劑盒中 的馬泰勒氏蟲病免疫印跡診斷抗原通過下述方法制備(1)制備蟲體培養(yǎng)用紅細(xì)胞無菌采集健康馬血，離心處理后用VYM’ s緩沖液洗滌、懸浮得到； 離心條件4°C -8°C低速30士5 min ；(2)建立及擴(kuò)大馬泰勒氏蟲體外培養(yǎng)無菌采集感染馬泰勒氏蟲病馬的抗凝血，經(jīng)離心處理，用3x VYM’s緩沖液洗滌、懸浮獲 得染蟲紅細(xì)胞后，采用HL2A-FBS組織培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)染蟲率達(dá)到1. 5%-2%時即進(jìn)行分代培 養(yǎng)；當(dāng)分代培養(yǎng)物染蟲率超過愧時進(jìn)行第一次擴(kuò)大培養(yǎng)；之后每當(dāng)染蟲率達(dá)到3%或以上 時即再次擴(kuò)大培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境為90%N2，5%02，5%0)2 ；—個培養(yǎng)周期為24小時；(3)制備馬泰勒氏蟲病免疫印跡雜交診斷抗原當(dāng)步驟(2)培養(yǎng)物的染蟲率超過5%時，收集培養(yǎng)物，經(jīng)離心、洗滌，最后以PI buffer+l%NP40 溶解至清亮，再力口入 LDSsample buffer (4x) 、sample Reducing Agent (10x)，充分混勻，煮沸，迅速冷卻，即得馬泰勒氏蟲病免疫印跡診斷抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測試劑盒，其特征在于底物是 peroxide solution+Luminol enhancer solution。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測試劑盒，其特征在于試劑盒中 的陽性對照血清通過下述方法制備將25mL用等量10%常規(guī)異源馬血清磷酸鹽緩沖液混合的馬泰勒氏蟲紅細(xì)胞培養(yǎng)物，靜 脈注射至脾未切除的小型馬體內(nèi)，3天后用大約10000個蜱(約0. 5克)未飼喂的蜱幼蟲，裝在一個布袋中，放置在小型馬上，13天后拿走已變成飽滿的蛹的蜱，蜱養(yǎng)6天，第6天將蜱放到實驗用小型馬匹上8天， 兩個星期后采集血清，補(bǔ)體結(jié)合試驗可檢測到馬泰勒氏蟲抗體，即獲得陽性對照血清。
5.一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測方法，是建立在權(quán)利要求1基礎(chǔ)之上的血清抗體免 疫印跡檢測方法，其特征在于包括步驟(1)取4 12% Bis-Tris膠板，洗滌干凈；(2)以SDSRunning Buffer和NuPAGE Antioxidant為溶劑，采用電泳法分離抗原蛋 白得到含有抗原蛋白的膠板；(3)用冷藏的轉(zhuǎn)印緩沖液將抗原蛋白轉(zhuǎn)移至纖維膜；(4)血清與抗原孵育將轉(zhuǎn)印有抗原蛋白的膜置于封閉液中在搖床上孵育；之后將膜取出再置于以封閉液按 1:100 1:500稀釋的血清樣品中，振蕩感作；(5)酶結(jié)合物孵育將膜轉(zhuǎn)置于以封閉液按1:5000 1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗馬二抗 結(jié)合物，振蕩感作；(6)底物孵育將膜移置于底物中，避光感作；得含底物孵育物的膜；(7)曝光，顯影吸干膜上的水，用保鮮膜將膜包好，置暗夾中，紅燈下，取感光膠片放在膜上，扣上暗 夾，曝光；在紅燈下取出膠片，放入顯影機(jī)中顯影；得顯影感光膠片；(8)結(jié)果判斷:當(dāng)陽性血清對照在25kDa和37kDa間出現(xiàn)兩條帶，位置約在34kDa和^kDa處時，陽 性對照成立；當(dāng)陰性血清對照無條帶出現(xiàn)時，陰性對照成立；這時可進(jìn)行檢測樣品的判定 當(dāng)在25kDa和37kDa間出現(xiàn)兩條帶，條帶位置與陽性對照相同時，可判定為陽性樣品；當(dāng)在 25kDa和37kDa間無條帶出現(xiàn)時，可判定為陰性樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測方法，其特征在于抗原蛋白的 工作濃度是1:5000。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測方法及試劑盒，本發(fā)明馬泰勒氏蟲病免疫印跡檢測方法，是以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗馬二抗結(jié)合物、化學(xué)發(fā)光底物在獲得診斷抗原和陽性對照血清的基礎(chǔ)上建立的；本發(fā)明方法試劑用量少成本低、特異性高、靈敏度高操作更快捷且無毒無害，所需條件低、試驗結(jié)果易判定和長期保存，特異性比ELISA更強(qiáng)，用本發(fā)明檢測均未發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果。
文檔編號G01N33/545GK102128925SQ201010591300
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者侯艷梅, 姜紅, 左鋒, 柴宏森, 柴銘駿, 王玉玲, 趙林立, 趙祥平 申請人:中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局