專利名稱：一種檢測(cè)人細(xì)胞色素p450 cyp2c19基因突變的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)人細(xì)胞色素P450CYP2C19基因突 變的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素P450CYP2C19基因編碼S-美芬妥英羥化酶，主要存在于人類肝臟細(xì)胞， 催化羥化、氧化、環(huán)化等I相代謝反應(yīng)，參與多種藥物的代謝。CYP2C19酶活性在人群中存 在遺傳差異，以美芬妥英或類似底物作為表型探針，可將CYP2C19分為不同表型羥化反應(yīng) 速度快者為強(qiáng)代謝表型(Extensive MetabolisnuEM)，羥化反應(yīng)速度慢者為弱代謝型(Poor MetabolisnuPM)。白種人PM的發(fā)生率較低(1_2% )，而亞洲人群中PM表型頻率較高，中國(guó) 漢族人群的PM的發(fā)生率為13 18%，維吾爾族人群PM頻率則低于漢族。CYP2C19基因含9個(gè)外顯子，全長(zhǎng)約55kb。cDNA全長(zhǎng)1940bp，編碼區(qū)1473bp共編 碼490個(gè)氨基酸，第421至432位氨基酸是血紅素結(jié)合位點(diǎn)。系列研究發(fā)現(xiàn)代謝表型差異 源于CYP2C19基因突變，最主要為Ml和M2兩種單核苷酸多態(tài)性突變。Ml突變?yōu)橥怙@子5上第681位堿基G — A突變，產(chǎn)生異常拼接位點(diǎn)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過 程中外顯子5，端40bp (643-682bp)缺失，翻譯過程中丟失215-227位氨基酸，并從215位 氨基酸處發(fā)生移碼，在其下游第20個(gè)氨基酸處產(chǎn)生異常終止密碼，蛋白合成過早被終止， 合成僅含234個(gè)氨基酸的截短蛋白，為缺失血紅素結(jié)合區(qū)的無功能蛋白。Ml突變決定是PM 表型的最主要基因型，73-83%的PM表型個(gè)體攜帶Ml突變。M2突變是外顯子4第636位堿基G — A突變，編碼色氨酸的密碼子突變?yōu)榻K止密 碼子，導(dǎo)致蛋白合成提前終止，形成無血紅素及底物結(jié)合區(qū)的無功能蛋白。在中國(guó)人群中， M2突變的發(fā)生頻率為Ml突變的1/9 1/10，M1和M2突變幾乎可以解釋所有的PM表型。CYP2C19等位基因呈獨(dú)立遺傳特性，在Ml純合基因型個(gè)體，未發(fā)現(xiàn)M2突變等位基 因；同樣在M2純合基因型個(gè)體，也不含有Ml突變等位基因。就是說，Ml和M2等位基因在 同一基因位點(diǎn)上可獨(dú)立地進(jìn)行分離，并遺傳給下一代，在同一條染色體上尚未發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突 變等位基因同時(shí)存在的狀況。質(zhì)子泵抑制劑是目前臨床最常用的抑酸藥物，包括奧美拉唑、蘭索拉唑、潘托拉 唑、埃索美拉唑和雷貝拉唑等。主用于治療消化道潰瘍、食管反流癥等疾病。此類藥物化 學(xué)結(jié)構(gòu)相似，均包含有非對(duì)稱性硫原子和苯并咪唑主鏈，并主要經(jīng)肝臟CYP2C19酶代謝。 CYP2C19基因多態(tài)性分析有助于預(yù)測(cè)質(zhì)子泵抑制劑藥物的療效，臨床醫(yī)師據(jù)此可決定適合 患者的藥物、劑量及經(jīng)濟(jì)的治療方案，為臨床合理用藥、個(gè)體化用藥和治療提供指導(dǎo)。以奧美拉唑?yàn)槔?。奧美拉唑是目前應(yīng)用最多的質(zhì)子泵抑制劑藥物，也最先被證實(shí) 為CYP2C19代謝底物。奧美拉唑主要代謝途徑是5-甲基經(jīng)CYP2C19羥化，再經(jīng)CYP3A硫化 氧化生成奧美拉唑砜。次要代謝途徑包括CYP3A催化3-羥化反應(yīng)和CYP2C19催化5_0_脫 甲基化，代謝產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)CYP3A和CYP2C19代謝生成羥基砜衍生物。
臨床研究發(fā)現(xiàn)PM表型個(gè)體服用奧美拉唑后的血漿藥物濃度-時(shí)間曲線下面積 (AUC)比EM表型個(gè)體高5倍。長(zhǎng)期服用奧美拉唑等質(zhì)子泵抑制劑藥物，高胃泌素血癥副作 用多數(shù)發(fā)生于PM表型患者，EM表型患者則很少發(fā)生。長(zhǎng)期持續(xù)用質(zhì)子泵抑制劑藥物治療 致^)11丨叫吐411化011綜合征，血漿維生素B12濃度降低，PM表型患者血漿維生素B12降 低程度較EM表型患者更為嚴(yán)重。以奧美拉唑?yàn)榛A(chǔ)的胃、十二指腸潰瘍聯(lián)合治療及幽門螺 桿菌根治的臨床研究發(fā)現(xiàn)在相同用藥劑量和給藥方案時(shí)，PM表型患者治愈率顯著優(yōu)于EM 表型患者，EM表型患者需增大藥物劑量方可達(dá)到相同療效。除質(zhì)子泵抑制劑外，CYP2C19還參與多種藥物的代謝。例如新型抗抑郁藥 西酞普蘭(Citalopram，CIT)主要在肝臟中經(jīng)N位去甲基化，轉(zhuǎn)化成去甲西酞普蘭 (desmethylcitalopram, DCIT)和去二甲西酞普蘭(didesmethylcitalopram, DDCIT)。 CYP2C 19、CYP3A4和CYP2D6三種酶參與N位去甲基化反應(yīng)，CYP2C19是催化CIT體內(nèi)N位 去甲基代謝的主要酶，對(duì)西酞普蘭代謝起決定作用。鎮(zhèn)靜催眠抗驚厥地西泮主要有兩條代 謝途徑N-位去甲基化生成去甲地西泮和G3位羥化生成羥地西泮。CYP2C19和CYP3A參與 N-位去甲基化代謝，CYP2C19與底物親和力高，在治療劑量下起主要作用。研究發(fā)現(xiàn)Ml/Ml 純合基因型患者對(duì)地西泮代謝速度顯著低于M1/W1雜合和W1/W1純合基因型患者。治療抑郁癥以及強(qiáng)迫觀念行為的首選藥物氟西汀，通過選擇性抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng) 5-羥色胺重?cái)z取而發(fā)揮藥理作用。CYP2CI9參與氟西汀N-去甲基和0-脫烷基兩條主要代 謝途徑，CYP2C 19活性差異導(dǎo)致個(gè)體間氟西汀和去氧氟四汀血藥濃度差異，CYP2C19對(duì)氟 西汀的去甲基代謝呈基因-劑量依賴性。因此專家建議在臨床應(yīng)用氟四汀時(shí)，應(yīng)根據(jù)個(gè)體 CYP2CI9的基因型調(diào)整給藥劑量。CYP2C19功能狀態(tài)對(duì)于聯(lián)合用藥也十分重要。例如抗癲癇藥苯妥英(PHT)與丙戊 酸(VPA)均經(jīng)CYP2C19代謝，大部分PM表型患者給予較小劑量的VPA，即可達(dá)到有效血藥 濃度并控制癥狀。既可減少藥品資源浪費(fèi)，又可降低藥品不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。由于PM表型患 者對(duì)藥物敏感，即便增加很小的劑量，都可能引起血藥濃度的較大變化，甚至?xí)?dǎo)致藥物中 毒。因此，PM型患者在服用VPA時(shí)，應(yīng)從比低于常規(guī)劑量的更小劑量開始，同時(shí)密切觀察癥 狀及血藥濃度變化。VPA和PHT間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，由于VPA與CYP2C19的親和力高于PHT， 可取代PHT的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而首先經(jīng)CYP2C19酶代謝，同時(shí)抑制了 PHT的代謝而增加游 離PHT水平。而PHT又是肝臟酶表達(dá)的誘導(dǎo)劑，可刺激CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5及 CYP2C19等多種酶合成，增高酶水平促進(jìn)VPA的代謝，進(jìn)一步降低VPA血藥濃度。PM表型患 者對(duì)PHT的酶活性誘導(dǎo)作用不敏感，穩(wěn)態(tài)后VPA血藥濃度與單用VPA的血藥濃度接近。聯(lián) 合用藥時(shí)PM表型患者VPA血藥濃度變化較為理想，不易產(chǎn)生因VPA血藥濃度過高而引起的 藥物毒副作用。而EM型患者受PHT酶活性誘導(dǎo)作用較強(qiáng)，穩(wěn)態(tài)后血藥濃度約為單用VPA正 常代謝者的3/5，使得VPA與PHT聯(lián)合用藥時(shí)，EM者的血藥濃度顯著低于PM者，達(dá)不到有效 血藥濃度。相反服用同等劑量VPA時(shí)，PM表型患者血藥濃度卻異常增高，易出現(xiàn)藥物副作 用。因而PM表型患者應(yīng)減少VPA的劑量，避免毒副作用發(fā)生。CYP2C19基因除參與代謝藥物外，也參與多種致癌物清除代謝或前致癌物活化代 謝等生物轉(zhuǎn)化過程激活。因而CYP2C19基因多態(tài)性也與癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。例如CYP2C19 基因多態(tài)性與膀胱癌、乳腺癌、急性白血病、肺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝硬化及肝癌等 腫瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在人群中進(jìn)行人細(xì)胞色素P450CYP2C19基因突變檢測(cè)，進(jìn)行CYP2C19基因分型，提高對(duì)某些腫瘤易感性的預(yù)測(cè)水平，有助于腫瘤的預(yù)防。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)人細(xì)胞色素P450CYP2C19基因突變的方法，包 含以下步驟用引物對(duì)樣品基因組進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物包含檢測(cè)Ml突變的上下游引物，其核 苷酸分別如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2所示；以及檢測(cè)M2突變的上下游引物，其核苷酸分 別如 SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 6 所示；設(shè)立質(zhì)控參照，取擴(kuò)增產(chǎn)物用核苷酸如SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 10所示的測(cè)序引 物進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明所述人細(xì)胞色素P450CYP2C 19基因突變方法檢測(cè)CYP2C19的Ml和M2突 變野生型及變異性等位基因的外顯子及突變位點(diǎn)序列分別為Ml突變外顯子5第681位堿基G — AWl等位基因序列(Exon5)atatgcaataattttcccactatcattgattatttccc |g] ggaacccataacaaattacttaaaaacc ttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggac tttattgattgcttcctgatcaaaatggagaagMl等位基因序列(Exon5)atatgcaataattttcccactatcattgattatttccc |a] ggaacccataacaaattacttaaaaacc ttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggac tttattgattgcttcctgatcaaaatggagaagM2突變外顯子4第636位堿基G — AW2等位基因序列(Exon4)cttcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttc cagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaa
gcaccccctg |g] atccagM2等位基因序列(Exon4)Cttcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttc cagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaa
gcaccccctg |a]； atccag所述檢測(cè)Ml、M2突變的上下游引物指擴(kuò)增Ml和M2突變所在區(qū)域的上游和下游 引物。所述測(cè)序引物為識(shí)別PCR產(chǎn)物并通過DNA測(cè)序反應(yīng)檢測(cè)Ml和M2突變的通用測(cè)序引 物。所述檢測(cè)Ml、M2突變的上下游引物，與其他人所有的序列不同，為了方便測(cè)序，在 所述引物的末端添加了便于測(cè)序反應(yīng)的特殊序列，簡(jiǎn)化了后續(xù)的測(cè)序反應(yīng)，增加了通用性 和標(biāo)準(zhǔn)化，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其特異性強(qiáng)。作為優(yōu)選，所述質(zhì)控參照包含W1/W1純合基因型質(zhì)控參照、Ml/Ml純合基因型質(zhì)控 參照、W1/M1雜合基因型質(zhì)控參照、M2/M2純合基因型質(zhì)控參照、W2/W2純合基因型質(zhì)控參照、W2/M2雜合基因型質(zhì)控參照。作為優(yōu)選，所述質(zhì)控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質(zhì)粒的一種，分別作為W1/W1純合基因型質(zhì)控參 照、Ml/Ml純合基因型質(zhì)控參照、W2/W2純合基因型質(zhì)控參照、M2/M2純合基因型質(zhì)控參照。更優(yōu)選地，所述質(zhì)控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4的重 組質(zhì)粒的混合物、分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質(zhì)粒 的混合物，分別作為W1/M1雜合基因型質(zhì)控參照、W2/M2雜合基因型質(zhì)控參照。本發(fā)明還提供一種人細(xì)胞色素P450CYP2C19基因突變的試劑盒，包含PCR擴(kuò)增試 劑、PCR產(chǎn)物純化試劑、DNA測(cè)序反應(yīng)試劑、質(zhì)控參照品和測(cè)序產(chǎn)物純化試劑，其特征在于， PCR擴(kuò)增引物為檢測(cè)Ml突變引物和檢測(cè)M2突變引物，所述檢測(cè)Ml突變引物核苷酸分別如 SEQ ID No. USEQ ID No. 2所示，所述檢測(cè)M2突變引物核苷酸分別如SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6所示；測(cè)序引物核苷酸如SEQ IDNo. 9、SEQ ID No. 10所示。作為優(yōu)選，所述質(zhì)控參照品包含W1/W1純合基因型質(zhì)控參照、Ml/Ml純合基因型質(zhì) 控參照、W1/M1雜合基因型質(zhì)控參照、M2/M2純合基因型質(zhì)控參照、W2/W2純合基因型質(zhì)控參 照、W2/M2雜合基因型質(zhì)控參照。作為優(yōu)選，所述質(zhì)控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4的重 組質(zhì)粒的混合物、分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質(zhì)粒 的混合物或任一種重組質(zhì)粒。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述PCR擴(kuò)增試劑含pH8. 3-8. 8的Tri s. Cl、DCl、 MgCl2、二硫蘇糖醇、Triton X_100、dNTP 混合液(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)、正向和反向引物 對(duì)、Taq DNA聚合酶、DMSO和甘油。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述PCR純化試劑包括蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述DNA測(cè)序反應(yīng)試劑包含BigDye染料、ddNTP和 dNTP混合液、測(cè)序酶、測(cè)序引物。CYP2C19為肝臟重要的I相代謝酶，催化氧化還原、羥化、等多種代謝反應(yīng)，幾十 種臨床常用藥物經(jīng)CYP2C19代謝，Ml和M2基因突變決定中國(guó)人群幾乎全部的弱代謝表型。 CYP2C19酶活性影響多種藥物的代謝，檢測(cè)Ml和M2突變型可判斷酶活性并預(yù)測(cè)相關(guān)藥物的 體內(nèi)代謝及毒副反應(yīng)。通過檢測(cè)重要的代謝酶CYP2C19基因型，推斷酶活性和藥物代謝狀 況，從而指導(dǎo)多種藥物的個(gè)體化應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明Ml突變PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
1-5 待測(cè)標(biāo)本；+ 陽性對(duì)照；-陰性對(duì)照；圖2為實(shí)施例3的Ml/Ml純合基因型測(cè)序峰圖部分截圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種檢測(cè)人體細(xì)胞色素氧化酶P4502C19基因突變的方法及試劑 盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法、產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā) 明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng) 用本發(fā)明技術(shù)。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1 本發(fā)明所述檢測(cè)人細(xì)胞色素P450CYP2C19基因突變?cè)噭┖斜景l(fā)明所述CYP2C19基因分型試劑盒包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測(cè)序反應(yīng) 和測(cè)序產(chǎn)物純合及上樣四個(gè)單元。PCR擴(kuò)增反應(yīng)單元檢測(cè)Ml和M2的PCR擴(kuò)增單元均含一管反應(yīng)試劑和一管陽性參照品。1、PCR反應(yīng)試劑由特異性引物對(duì)、PCR緩沖液、dNTP混合液和Taq DNA聚合酶等按照優(yōu)化的反應(yīng)濃 度配制而成。1)特異性引物正反向引物各50-100nmol/L。采用01igo6軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增含Ml或M2突變位點(diǎn)基因片段的特異性PCR引物，序列 分別為檢測(cè)Ml突變正向引物(Ml-F)為5，-TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGCAGGTATAAGTCTAGGA-3，，(核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示)檢測(cè)Ml突變反向引物(Ml-R)為5，-AACAGCTATGACCATGCACAAATACGCAAGCAGTC-3，(核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所 示)PCR 產(chǎn)物為 46Ibp:AAAGCAGGTATAAGTCTAGGAAATGATTATCATCTTTGATTCTCTTGTCAGAATTTTCTTTCTCAAATC TTGTATAATCAGAGAATTACTACACATGTACAATAAAAATTTCCCCATCAAGATATACAATATATTTTATTTATATT TATAGTTTTAAATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTAT TGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC[G/A]GGAACCCATAACAAATTACTT AAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCC TCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCTTAGTTATGTGACTGCTT GCGTATTTGTG(CYP2C19基因野生型、Ml突變型PCR產(chǎn)物核苷酸序列分別如SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4 所示)檢測(cè)M2突變正向引物(M2-F)為5，-TGTAAAACGACGGCCAGTAGGGAATTCATAGGTAAGATA-3，(核苷酸序列如 SEQ ID No. 5 所示) 檢測(cè)M2突變反向引物(M2-R)為5，-AACAGCTATGACCATGGAAGCCTGATCTATATTGG-3，(核苷酸序列如 SEQ ID No. 6 所 示)設(shè)計(jì)PCR產(chǎn)物為48^p AGGGAATTCATAGGTAAGATATTACTTAAAATTTCTAAACTATTATTATCTGTTAACAAATATGAAGTGTTTTATATCTAATGTTTACTCATATTTTAAAATTGTTTCCAATCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCC TGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTT AACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTG[G/A]ATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTT TGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACAT TTTTGAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCATGGGGTGAATATCTGGAAAAGATGGCAAAGTTCTTTATTTTATGC ACAGGAAATGAATATCCCAATATAGATCAGGCTTC (CYP2C 19 基因野生型、M2 突變型 PCR產(chǎn)物核苷酸 序列分別如SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8所示)2) PCR 緩沖液10-50mmol/L Tris.Cl (ρΗ8· 3—8. 8)、50mmol/L NaCl、2-5mmol/LMgC12、5mmol/ L-二硫蘇糖醇、0. 1-0. 5mmol/L Triton X_100、0. 01 % 明膠、5-10% DMSO、10%甘油等。3) dNTP 混合液4種三磷酸核苷酸dATPPI、dCTP、dGTP、dTTP等比例混合，每種dNTP終濃度為 100-200nmol/L。4) DNA 聚合酶25 μ 1反應(yīng)體系含0. 5-2. 5單位Taq DNA聚合酶。PCR產(chǎn)物純化單元PCR產(chǎn)物純化單位主要目的是清除PCR產(chǎn)物中殘余的引物和dNTP，這些可能干擾 后續(xù)DNA測(cè)序反應(yīng)的特異性和效率。主要包括兩種酶核酸外切酶將引物切割為單個(gè)堿基； 蝦堿性磷酸酶降解dNTP。核酸外切酶0. 2units/y 1，蝦堿性磷酸酶0. 05units/μ 1，用酶儲(chǔ) 存液制備成5倍濃度的純化試劑。DNA測(cè)序單元含一管DNA測(cè)序試劑和6管基因分型質(zhì)控參照品。1、DNA測(cè)序試劑包括通用測(cè)序引物、BigDye混合液、測(cè)序酶。1)通用測(cè)序引物Seq-F :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT-3，(核苷酸序列如 SEQID No. 9 所示)Seq-R :5，-AACAGCTATGACCATG-3，(核苷酸序列如 SEQ IDNo. 10 所示)濃度200-nmol/L2)、BigDye 混合液含4熒光標(biāo)記的雙脫氧三磷酸核苷酸(ddNTP)和4種脫氧三磷酸核苷酸(dNTP) 混合液。3)、測(cè)序酶上述試劑加酶穩(wěn)定劑混合為5倍濃度備用。2、質(zhì)控參照品質(zhì)控參照為含有擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的各等位基因型PCR產(chǎn)物 克隆到PMD載體(購(gòu)自北京天根公司的克隆載體，名稱pGM-T克隆試劑盒，貨號(hào)VT302-02) 中，分別構(gòu)建突變型質(zhì)粒PMD/M1和pMD/M2及野生型重組質(zhì)粒pMD/Wl和pMD/W2，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌后，采用商品化質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒質(zhì)量，紫外 分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度，用TE稀釋為2ng/y 1濃度，作為PCR擴(kuò)增的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。構(gòu)建4種質(zhì)粒說明如下
pMD/ffl 野生型Wl質(zhì)粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，外顯子5第 681位堿基為G (681G)pMD/Ml 變異型Ml質(zhì)粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，外顯子5第 681位堿基為A (681A)pMD/W2 野生型W2質(zhì)粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示，外顯子4第 636位堿基為G (636G)pMD/M2 變異型M2質(zhì)粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示，外顯子4第 636位堿基為A (636A)pMD/ffl質(zhì)粒作為W1/W1純合基因型的標(biāo)準(zhǔn)參照品，濃度為2ng/l·! 1。pMD/Ml質(zhì)粒作為Ml/Ml純合基因型的標(biāo)準(zhǔn)參照品，濃度為2ng/l·! 1。pMD/ffl與pMD/Ml兩種質(zhì)粒0. 5 0.5比例混合，作為W1/M1雜合基因型標(biāo)準(zhǔn)參照 品，濃度為 2ng/ μ 1 (含 pMD/ffl 與 pMD/Ml 各 lng/ μ 1)。pMD/W2質(zhì)粒作為W2/W2純合基因型的標(biāo)準(zhǔn)參照品，濃度為2ng/l·! 1。pMD/M2質(zhì)粒作為M2/M2純合基因型的標(biāo)準(zhǔn)參照品，濃度為2ng/l·! 1。pMD/W2與pMD/M2兩種質(zhì)粒0. 5 0.5比例混合，作為W2/M2雜合基因型標(biāo)準(zhǔn)參照 品，濃度為 2ng/ μ 1 (含 pMD/W2 與 pMD/M2 各 lng/ μ 1)。測(cè)序產(chǎn)物純化及上樣單元含100%乙醇1瓶、70%乙醇1瓶、HIDI上樣緩沖液1管。上述四個(gè)單元的試劑組合為完整試劑盒，另附超純滅菌的去離子水100ml，上述試 劑盒于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2 應(yīng)用本發(fā)明所述方法及試劑盒進(jìn)行CYP2C19突變檢測(cè)儀器設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀、ABI 3130遺傳分析儀，超凈工作臺(tái)、高速臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、電泳儀等。
提取基因組DNA 檸檬酸鈉或枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈血100 μ 1，加入2-5倍體積人紅細(xì)胞裂解液， 混勻后冰浴10-15分鐘，2000rmp離心5分鐘，棄上清收集淋巴細(xì)胞，用全血基因組DNA提取 試劑盒提取基因組DNA。全血基因組DNA提取可采用多種方法如堿裂解法、硅膠法、二氧化 硅吸附法、磁珠吸附法、層析柱法等，目前有多種商品化試劑盒供選擇，推薦采用柱層析試 劑盒。PCR 反應(yīng)1)從實(shí)施例1所述試劑盒中取出PCR反應(yīng)試劑和去離子水，在室溫下融化，30 μ L 反應(yīng)體系配置如下 16 μ 1基因組DNA 4μ 1ddH2010 μ 1總體積30 μ L 每批次實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陽性和陰性對(duì)照反應(yīng) 陽性對(duì)照反應(yīng)用質(zhì)控參照質(zhì)粒4 μ 1代替基因組DNA。
PCR反應(yīng)試劑(特異性引物對(duì)2對(duì)、PCR緩沖液、dNTP混合液和Taq DNA聚合酶)
陰性對(duì)照反應(yīng)用CMH2O代替基因組DNA。充分混勻，2000rpm離心IOsec，放置到PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。2) PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置95°C 5min (預(yù)變性)95 "C30sec
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人細(xì)胞色素P450 CYP2C19基因突變的方法，包含以下步驟用引物對(duì)樣品基因組進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物包含檢測(cè)Ml突變的上下游引物，其核苷酸 分別如SEQ ID No. USEQ ID No. 2所示；以及檢測(cè)M2突變的上下游引物，其核苷酸分別如 SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 6 所示；設(shè)立質(zhì)控參照，取擴(kuò)增產(chǎn)物用核苷酸如SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 10所示的測(cè)序引物進(jìn) 行測(cè)序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)控參照包含W1/W1純合基因型質(zhì) 控參照、Ml/Ml純合基因型質(zhì)控參照、W1/M1雜合基因型質(zhì)控參照、M2/M2純合基因型質(zhì)控參 照、W2/W2純合基因型質(zhì)控參照、W2/M2雜合基因型質(zhì)控參照。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 7 或 SEQ IDNo. 8 所示序列的重組質(zhì)粒的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4的重組質(zhì)粒的混合物、分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質(zhì)粒的混合物。
5.一種檢測(cè)人細(xì)胞色素P450CYP2C19基因突變的試劑盒，包含PCR擴(kuò)增試劑、PCR產(chǎn)物 純化試劑、DNA測(cè)序反應(yīng)試劑、質(zhì)控參照品和測(cè)序產(chǎn)物純化試劑，其特征在于，PCR擴(kuò)增引物 為檢測(cè)Ml突變引物和檢測(cè)M2突變引物，所述檢測(cè)Ml突變引物核苷酸分別如SEQID No. 1、 SEQ ID No. 2所示，所述檢測(cè)M2突變引物核苷酸分別如SEQID No. 5、SEQ ID No. 6所示；測(cè) 序引物核苷酸如SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 10所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述質(zhì)控參照品包含W1/W1純合基因型 質(zhì)控參照、Ml/Ml純合基因型質(zhì)控參照、W1/M1雜合基因型質(zhì)控參照、M2/M2純合基因型質(zhì)控 參照、W2/W2純合基因型質(zhì)控參照、W2/M2雜合基因型質(zhì)控參照。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述質(zhì)控參照為分別重組了核苷酸如 SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4的重組質(zhì)粒的混合物或分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質(zhì)粒的混合物或任一種重組質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增試劑含pH8.3-8. 8的 Tris. Cl、DCl、MgC12、二硫蘇糖醇、Triton X_100、dNTP混合液、正向和反向引物對(duì)、Taq DNA 聚合酶、DMSO和甘油。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR純化試劑包括蝦堿性磷酸酶和 核酸外切酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA測(cè)序反應(yīng)試劑包含BigDye染 料、ddNTP和dNTP混合液、測(cè)序酶、測(cè)序引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種檢測(cè)人細(xì)胞色素P450 CYP2C19基因突變的方法，包含用引物對(duì)樣品基因組進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物包含檢測(cè)M1突變的上下游引物，其核苷酸分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示；檢測(cè)M2突變的上下游引物，其核苷酸分別如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；設(shè)立質(zhì)控參照，取擴(kuò)增產(chǎn)物用核苷酸如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示的測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明還提供檢測(cè)人細(xì)胞色素P450 CYP2C19基因突變的試劑盒。依據(jù)本發(fā)明所述方法的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行臨床用藥方案指導(dǎo)和調(diào)整，為臨床個(gè)體化用藥提供依據(jù)，可提高療效，降低毒副作用風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102140510SQ20101060921
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者白玉杰 申請(qǐng)人:北京迪諾基因科技有限公司