專利名稱：鑒別葡萄球菌并檢測其耐藥性的多重pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種試劑盒，尤其涉及一種快速鑒別感染性標(biāo)本中的葡萄球胃(Staphylococcus) ^ W ^ IlJ ^ ft W ^ S PCR (multiplex polymerase chain reaction)試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，革蘭陽性球菌感染有上升趨勢，約占醫(yī)院感染的40%。已經(jīng)重新成為醫(yī)院感染的主要病原菌，與20世紀(jì)五六十年代不同的是出現(xiàn)了耐藥革蘭陽性球菌的廣泛傳播和流行，甚至是爆發(fā)流行。其中最主要的是葡萄球菌的感染，金黃色葡萄球菌占所有革蘭陽性球菌感染的第一位。金黃色葡萄球菌的流行。美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)報告，美國本土MRSA占臨床分離的金葡菌菌株的16 % 22 %，現(xiàn)已高達50 %，因感染MRSA而沒有得到及時治療的死亡病例數(shù)也逐年增加。在我國上海地區(qū)70年代葡萄球菌中MRAS分離率為5 %，1985-1986 為M%，1989年則升至60%，2001年已達44% 77% [何述祥.金黃色葡萄球菌耐藥性的變遷和耐藥機理.[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2001 ;33(4) :342-345汪復(fù)，朱德妹，胡付品， 等.上海地區(qū)細菌耐藥性監(jiān)測分析.[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2001 ;81(1) :17-19] 0 1995 1999年在大連、北京、南京等9大城市13家醫(yī)院的細菌耐藥檢測調(diào)查中MRAS的檢出率為 27. 55%，院內(nèi)感染患者中MRSA檢出率為81. 82% [李家泰，AnnaJJeinsetni.中國細菌耐藥監(jiān)測研究.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001 81 (1) :8-16.]。中南地區(qū)2006年6月-2007年6月臨床分離菌株中兒童組(< 14歲)和成人組(> 15歲)耐甲氧西林金葡菌(MRSA)分離率分別為14. 8%禾口 51. 2%0非ICU中MRSA和MRSCN的分離率分別為45. 2%禾口 66. 3%, ICU 中MRSA分離率為77. 6% [簡翠，葉濤，張蓓，等。Mohnarin2006-2007年度報告中南地區(qū)細菌耐藥監(jiān)測[J]中國抗生素雜志2008,33(10) :608-615]。葡萄球菌常見的金葡菌對青霉素的耐藥率為85. 11% [陳翠卿羅立曠陳作嚴(yán)，醫(yī)院細菌耐藥性監(jiān)測及抗菌藥物應(yīng)用對策[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報2008，14(21) :81-83]，其中大部分MRSA同時對喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類耐藥。凝固酶陰性葡萄球菌的流行。20世紀(jì)70年代開始，凝固酶陰性葡萄球菌的致病性也得到了認識，近年來由于診療設(shè)備的不斷增多，免疫抑制劑、皮質(zhì)類激素與放射治療以及抗生素的廣泛應(yīng)用，致使表皮葡萄球菌等血漿凝固酶陰性葡萄球菌引起的感染日益增多。美國國家醫(yī)院感染檢測系統(tǒng)提供的數(shù)據(jù)顯示，自1990年1月至1999年5月患者血培養(yǎng)分離的病原菌中凝固酶陰性和凝固酶陽性葡萄球菌所占比例分別為37.3%、 12. 6% [von Eiff，C.，G. Peters，and C. Heilmann. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. [J]Lancet Infect· 2002· 2 :677-685.]。凝固酶陰性葡萄球菌的致病性不容忽視。耐藥葡萄球菌。金黃色葡萄球菌，尤其是甲氧西林或苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌(MRSA)是引起院內(nèi)感染的多重耐藥菌。在第一個耐青霉素酶的內(nèi)酰胺類抗生素甲氧西林用于臨床治療葡萄球菌感染不久，1961年在英國發(fā)現(xiàn)了世界首例MRSA。從此， MRSA逐漸成為全世界院內(nèi)感染的主要病原菌。目前在許多國家仍在增長，MRSA幾乎對所有 β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，甚至累及到紅霉素，環(huán)丙沙星和慶大霉素。1996年在日本首次發(fā)現(xiàn)了 MRSA對萬古霉素敏感性下降的菌株，即萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌(VISA)。VISA 的出現(xiàn)預(yù)示著萬古霉素治療葡萄球菌感染的臨床療效下降，隨之萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(VRSA)臨床株是否會分離到，成為人們監(jiān)測和關(guān)注的熱點。如果葡萄球菌一旦對萬古霉素耐藥，臨床將如何治療？所以連續(xù)監(jiān)測金黃色葡萄球菌的耐藥現(xiàn)狀，了解葡萄球菌的耐藥機制，感染的危險因素及其治療對策具有重要的臨床意義。葡萄球菌的耐藥率是呈上升趨勢的，該菌感染已成為當(dāng)今世界范圍內(nèi)醫(yī)務(wù)界面臨的嚴(yán)重問題，已經(jīng)被列為“超級細菌”之首。國際上將MRSA感染作為世界上三大感染之一。 MRSA和MRCNS對β -內(nèi)酸胺類與氨基糖甙類抗生素幾乎均有耐藥性，對氟哇諾酮類抗生素的耐藥性亦呈上升趨勢。因此尋找一種快速檢測MRS的方法已成當(dāng)務(wù)之急，可使我們及時使用糖肽類抗生素，迅速控制耐甲氧西林葡萄球菌造成的感染，限制其播散，同時也可以減少糖肽類抗生素的濫用，減緩對糖肽類抗生素耐藥的葡萄球菌的出現(xiàn)。瓊脂稀釋法是CLSI0/NCCL S推薦的檢測MRSA的經(jīng)典方法。M IC法費力、耗時、成本較高，臨床上不宜作為常規(guī)方法開展。目前，m ecA基因的分子檢測已取代了該法成為鑒定 MRSA 的“金標(biāo)準(zhǔn)” [B row η D F,Edw ardsD I,Haw key PM, et al. Guidelines for the Iabo rato ry diagno sis and suscep t ibility testing of methicillin2resistant Sta hylococcus aureus (MRSA)[J]. JA nt im icrob Chem other,2005,56 (6) :1000]o

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的是解決上述問題而提供一種結(jié)構(gòu)簡單，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的同時又有高通量的優(yōu)勢，更加省時省力，降低成本的快速鑒別感染性標(biāo)本中的葡萄球菌并同時檢測其耐藥性的多重PCR試劑盒。本實用新型解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是它包括殼體，殼體上設(shè)有溶葡萄球菌素放置倉、NaOH溶液放置倉、多重PCR反應(yīng)液放置倉、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板放置倉、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品放置倉和％ NaCl溶液放置倉。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型取得了以下的技術(shù)效果1、此實用新型結(jié)構(gòu)簡單，與臨床檢測上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比多重PCR方法跟單一 PCR方法比較起來，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的同時又有高通量的優(yōu)勢，更加省時省力，降低成本；2、特異性好，靈敏度高，步驟簡單，可重復(fù)性高，可同時進行高通量的樣品檢測，檢測速度快，加上樣品DNA的提取制備，5小時內(nèi)可以完成。

圖1為本實用新型俯視圖。其中1-殼體、2-溶葡萄球菌素放置倉、3-NaOH溶液放置倉、4-多重PCR反應(yīng)液放置倉、5-標(biāo)準(zhǔn)陽性模板放置倉、6-陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品放置倉、7-NaCl溶液放置倉。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖進一步說明本實用新型的實施例。實施例1參見圖1，一種鑒別葡萄球菌并檢測其耐藥性的多重PCR試劑盒，它包括殼體1，殼體上設(shè)有溶葡萄球菌素放置倉2、4% NaOH溶液放置倉3、多重PCR反應(yīng)液放置倉4、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板放置倉5、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品放置倉6和0. 9% NaCl溶液放置倉7。多重PCR反應(yīng)液含有3對引物，引物分為正向引物和反向引物，分別為；mecA 5' -GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ΑΤΑ A-3'5' -CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A-3'；femB 5’ -TTA CAG AGT TAA CTG TTA CC-3’5' -ATA CAA ATC CAG CAC GCT CT-3'；16SrDNA5' -AAC TCT GTT ATT AGG GAA GAA CA-3’5' -CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC-3'；標(biāo)準(zhǔn)陽性模板從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌組DNA。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株先用無菌TE緩沖液配制成細菌懸液，經(jīng)過平板計數(shù)法及用定量接種環(huán)確定所配制的菌液濃度為108CFU/ml，經(jīng)過熱裂解提取細菌基因組DNA，具體地說a)標(biāo)本DNA提取液包括20U/ml溶葡萄球菌素、4% NaOH溶液、0. 9% NaCl溶液b)多重PCR反應(yīng)液 多重PCR反應(yīng)液是由正向引物和反向引物3對，TaqDNA聚合酶，dNTPMixture，Mg2+， 10Xbuffer和無菌雙蒸水組成。在本發(fā)明的一個具體方案中，多重PCR反應(yīng)液由IOymol/ L的引物，各引物量分別為mecA正負向引物各0. 6 μ 1，femB正負向引物各1. 9 μ 1，16SrRNA 正負向引物各 0. 6 μ 1，10Xbuffer3y 1，dNTP Mixture3 μ 1，Mg2+2. 5 μ 1，無菌雙蒸水 4. 3 μ 1，反應(yīng)液總體積22 μ 1。其中引物為所示的核苷酸序列。c)標(biāo)準(zhǔn)陽性模板標(biāo)準(zhǔn)陽性模板從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌組DNA。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC43300)菌落，溶于2ml的無菌TE緩沖液中配成細菌懸液，經(jīng)平板計數(shù)法以及用定量接種環(huán)確定所配制的菌液濃度為10!^^/1111，取40(^1經(jīng)過熱裂解提取細菌基因組 DNA, -20°C保存，做為陽性模板備用。d)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。本實用新型的使用方法包括下列步驟a)按陽性標(biāo)本處理方法提取送檢標(biāo)本細菌DNA用于多重PCR反應(yīng)；b)將標(biāo)準(zhǔn)陽性模板從-20°C冰箱取出，平衡至室溫待用；c)分別取等量的a)步中的標(biāo)本中的細菌組DNA和b)步中標(biāo)準(zhǔn)陽性模板加入到多重PCR反應(yīng)液(正向引物和反向引物3對，TaqDNA聚合酶，dNTPMi xtur e, Mg2+，IOXbuffer和無菌雙蒸水)中，用PCR擴增儀進行擴增；d)將擴增后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。本方法可對臨床分離的可疑葡萄球菌進行快速鑒定，并同時檢測其耐藥性，縮短一直沿用的傳統(tǒng)培養(yǎng)藥敏法的診斷時。實施例1 快速鑒定葡萄球菌及檢測耐藥基因的多重PCR試劑盒組成與配制。試劑組成a、標(biāo)本 DNA 提取液al_20U/ml 溶葡萄球菌素、a2~4% NaOH 溶液、a3-0. 9% NaCl 溶液b、多重PCR反應(yīng)液正向引物和反向引物3對(ΙΟμπιοΙ/L)，其中引物量分別為 mecA正負向引物各0. 6μ 1，femB正負向引物各1. 9 μ 1，16SrRNA正負向引物各0. 6 μ 1， 10 X buffer3 μ 1，dNTPMixture3 μ 1，Mg2+2. 5 μ 1，無菌雙蒸水 4. 3 μ 1，反應(yīng)液總體積 22μ 1 ；C、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板標(biāo)準(zhǔn)陽性模板從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌組DNA ；d、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。實施實例2 用快速鑒定葡萄球菌及檢測耐藥基因的多重PCR試劑盒檢測標(biāo)本中的葡萄球菌。 1、臨床標(biāo)本DNA的提取膿液取Iml于無菌瓶中，加入4倍體積4% NaOH溶液，室溫放置，液化30min， 充分振蕩，取Iml液化后液體于無菌EP管中，12000rpm離心lOmin，棄上清；加Iml生理鹽水于沉淀中，打勻，12000rpm離心lOmin，棄上清；重復(fù)一次；收集沉淀，將沉淀溶于 300 μ ITE (ΡΗ8. 0)的EP管中；加入20U/ml溶葡萄球菌素20 μ 1，放入37°C恒溫水浴箱作用30min ；金屬浴100°C加熱IOmin ；不等冷卻，4°C低溫離心機12000gX lOmin，取上清液 50 μ 1即得細菌總DNA。血液取陽性報警血培養(yǎng)瓶中血液Iml于無菌EP管中，3000rpm離心5min，取血清于另一 EP管，12000rpm離心lOmin，棄上清；用生理鹽水洗2 3次后收集最終沉淀，采用上述方法提取DNA。體液包括腦脊液、胸腹腔液、前列腺液等，可直接離心沉淀用生理鹽水洗2 3次后收集最后沉淀，采用1.所述方法提取DNA;成分粘稠同膿液處理方法，加入4倍體積4% NaOH溶液，室溫放置，液化30min，充分振蕩，取Iml液化后液體于無菌EP管中，12000rpm 離心lOmin，棄上清；加Iml生理鹽水于沉淀中，打勻，12000rpm離心lOmin，棄上清；重復(fù)一次；收集沉淀，采用上述方法提取DNA。2、將標(biāo)準(zhǔn)陽性模板從-20°C冰箱取出，平衡至室溫待用；3、分別取等量的細菌組DNA和標(biāo)準(zhǔn)陽性模板(3 μ 1)加入到多重PCR反應(yīng)液 22μ 1(正向引物和反向引物3對，TaqDNA聚合酶，dNTP Mixture，Mg2+，IOXbuffer和無菌雙蒸水)中，用PCR擴增儀進行擴增；擴增條件為94°C 3min預(yù)變性，94°C 40s 58°C 40s 72°C Imin 20cycles, 94°C Imin 50°C Imin 72°C 2min 25cycles ；72°C IOmin 延伸；4、將擴增后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件100v 80mA 50min凝膠濃度
61. 5%電泳結(jié)束后紫外燈下觀察結(jié)果；5、結(jié)果的判讀
權(quán)利要求1.鑒別葡萄球菌并檢測其耐藥性的多重PCR試劑盒，其特征在于它包括殼體(1)，殼體上設(shè)有溶葡萄球菌素放置倉O)、Na0H溶液放置倉(3)、多重PCR反應(yīng)液放置倉、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板放置倉(5)、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品放置倉(6)和NaCl溶液放置倉(7)。
專利摘要本實用新型涉及鑒別葡萄球菌并檢測其耐藥性的多重PCR試劑盒，它包括殼體，殼體上設(shè)有溶葡萄球菌素放置倉、NaOH溶液放置倉、多重PCR反應(yīng)液放置倉、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板放置倉、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品放置倉和NaCl溶液放置倉。本實用新型結(jié)構(gòu)簡單，與臨床檢測上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比多重PCR方法跟單一PCR方法比較起來，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的同時又有高通量的優(yōu)勢，更加省時省力，降低成本。
文檔編號C12Q1/14GK201952436SQ2010205545
公開日2011年8月31日 申請日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者李艷, 汪明, 胡慧霞 申請人:李艷, 汪明, 胡慧霞