一種特異定量檢測葡萄球菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特異定量檢測葡萄球菌的方法。本發(fā)明公開的一種重組溶葡球菌酶，為如下1）或2）所示：1）SEQ?ID?No.2中自N端起第13位至第258位氨基酸所示的蛋白；2）將1）的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開的一種特異定量檢測葡萄球菌的方法是結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP生物發(fā)光法。本發(fā)明的方法操作快捷簡單，對現(xiàn)場或臨床定性定量檢測葡萄球菌提供了理論支持，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種特異定量檢測葡萄球菌的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種特異定量檢測葡萄球菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄球菌是人類皮膚表面常見菌群，但它同時也是一種非常重要的致病菌，能夠引起小到皮膚病大到肺炎及菌血癥的威脅人類生命的疾病。不僅僅是人類，家畜也容易感染葡萄球菌，葡萄球菌的感染能夠?qū)е履膛Ｈ橄傺准半u傳染性關(guān)節(jié)炎，這嚴(yán)重威脅了食品健康，導(dǎo)致食品污染，帶來重大經(jīng)濟損失。值得注意的是，耐藥金黃色葡萄球菌的感染不斷增加，例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)，已成為一個主要關(guān)注，因為金黃色葡萄球菌是醫(yī)院感染最常見的原因。因此，建立快速檢測葡萄球菌的方法，對于防治葡萄球菌感染，進行早期治療減少損失是非常必要的。
[0003]溶葡球菌酶(Iysostaphin)是從模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)中分離出來的一種含鋅的金屬蛋白酶，具有內(nèi)切酶活性，能夠特異性水解革蘭氏陽性菌細胞壁肽聚糖而產(chǎn)生破壁溶菌作用，溶葡球菌酶對金黃色葡萄球菌顯示了強大的溶菌作用。
[0004]ATP是所有生物，包括細菌的細胞中均有的能量分子。測定出樣品中細菌細胞的ATP含量，即可得知細菌數(shù)。在Mg2+存在下，螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase),以D-熒光素、ATP、O2為底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，發(fā)出熒光。根據(jù)ATP與熒光素反應(yīng)產(chǎn)生熒光的原理，可對微生物細胞內(nèi)的ATP進行測定，從而定量檢測細菌數(shù)(I)。1.Elroy, ff., Crystalline firefly luciferase:LH2+ATP ^ LH2AMP+PPLH2AMP+02 — L-AMP+light+H20.Methods in enzymology, 1963.6:p.445-448.
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種特異定量檢測葡萄球菌的方法。
[0006]本發(fā)明提供的一種重組溶葡球菌酶，為如下I) -2)中任一所示:
[0007]I) SEQ ID N0.2中自N端起第13位至第258位氨基酸所示的蛋白；
[0008]2) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0009]3)將I)或2)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
[0010]上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0011]上述基因中，所述編碼基因為如下中至少一種:
[0012]I) SEQ ID N0.1中自5’末端起第37位至第777位核苷酸所示的DNA分子；
[0013]2) SEQ ID N0.1中自5’末端起第I位至第777位核苷酸所示的DNA分子；
[0014]3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0015]4)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0016]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017]一種定量檢測能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍，該方法是結(jié)合上述蛋白的ATP生物發(fā)光法，包括如下步驟:
[0018](I)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0019]I)用PBS制備不同濃度的葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液，將50ul標(biāo)準(zhǔn)液中的細菌總數(shù)，記作A，得到不同濃度的葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的IgA ；
[0020]2)取50 μ 11)中制備的不同濃度的葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液分別加入比色杯中；
[0021]3)在比色杯中加入100μ I含4.5ug上述蛋白的PBS，靜置2min，使葡萄球菌充分
裂解；
[0022]4)吸取50ul熒光酶溶液加入到比色杯中，混勻；
[0023]5)測定比色杯中溶液的熒光值，記作B，得到50ul各濃度的葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的 IgB ；
[0024]6)以IgA為X軸，以IgB為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程；
[0025](2)測定待測葡萄球菌的活菌個數(shù)
[0026]進行所述步驟(1)的操作，與所述步驟(1)唯一不同的是，將50μ I葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液替換成50 μ I待測葡萄球菌液，得到50ul待測葡萄球菌液對應(yīng)的IgM ；
[0027](3)將IgM帶入線性回歸方 程，計算IgM對應(yīng)的細菌總數(shù)的Ig值，記作lgX，X即為50ul待測葡萄球菌液的活菌個數(shù)；
[0028]所述能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌為葡萄球菌；
[0029]所述PBS 為 0.01mol/L ρΗ7.2 的 PBS ；
[0030]所述比色杯為過濾比色杯；
[0031]所述步驟(1)和步驟(2)的葡萄球菌為同一種葡萄球菌；
[0032]所述方法為非疾病診斷或治療方法，具體可應(yīng)用于科研用途。
[0033]上述方法中，所述步驟(1)的2)還包括如下步驟:向比色杯中滴加非細菌細胞釋放液，用壓力器將比色杯中的液體壓出，重復(fù)該步驟一次；
[0034]上述任一所述的方法中，所述非細菌細胞釋放液和熒光酶購自北京浩正智信科技有限公司。
[0035]上述任一所述的方法中，所述葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液中的細菌總數(shù)分別為2239666、223966、22396、2259、186 和 26cfu。
[0036]所述熒光值的測定原理為:在Mg2+存在下，螢火蟲熒光素酶以D-熒光素、ATP、O2為底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，發(fā)出熒光；
[0037]上述任一所述的方法中，所述熒光值的測定是在Profile-13560 (IOX)ATP微生物快速檢測系統(tǒng)上進行的。
[0038]上述任一所述的方法中，所述葡萄球菌為金黃色葡萄球菌。
[0039]上述蛋白在定量檢測能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0040]和/或，上述蛋白在制備定量檢測能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0041]和/ 或，[0042]上述任一所述的方法在定量檢測能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；所述應(yīng)用為非疾病診斷或治療方法，具體可應(yīng)用于科研用途。
[0043]上述應(yīng)用中，所述能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌為葡萄球菌。
[0044]上述任一所述的應(yīng)用中，所述葡萄球菌為金黃色葡萄球菌。
[0045]實施例所用的純化得到的重組溶葡球菌酶帶有His標(biāo)簽，此標(biāo)簽不影響重組溶葡球菌酶的活性。
[0046]本發(fā)明建立的結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP生物發(fā)光法操作快捷簡單，對現(xiàn)場或臨床定性定量檢測葡萄球菌提供了理論支持，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0047]圖1為上清I和對照上清的SDS-PAGE檢測。
[0048]圖2為上清I和鎳柱純化獲得的重組溶葡球菌酶的SDS-PAGE檢測。
[0049]圖3為點滴法檢測重組溶葡球菌酶體外殺菌活性。
[0050]圖4為結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP發(fā)光法與平板計數(shù)法相關(guān)性分析。
[0051]圖5為結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP發(fā)光法檢測葡萄球菌的特異性。
【具體實施方式】
[0052]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0053]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
`[0054]pQE30質(zhì)粒在文獻“范公忍，et al.，乙型肝炎病毒聚合酶片段的表達及其在血清學(xué)檢測中的應(yīng)用.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010.2:p.015.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0055]克隆菌株E.coli Transl-Tl購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為D501-02。
[0056]表達菌株E.coli M15購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為CC0901。
[0057]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC),ATCC 編號為 25923。
[0058]大腸桿菌(E.coli)在文獻“徐焰，et al.，I株寬宿主譜大腸桿菌噬菌體的生物學(xué)特性觀察[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003.25(23):p.2106-2108.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0059]沙門氏菌(salmonella)在文獻“黃金林，et al.，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測沙門氏菌.揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2002.23 (3): p.5-7.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0060]嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)在文獻“陳晨，et al.,嗜麥芽窄食單胞菌肺部感染模型的建立與評估.軍事醫(yī)學(xué)ISTIC，2013.37 (3).”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0061]糞腸球菌(Enterococcus faecalis)在文獻“張文惠，et al., 一株糞腸球菌卩遼菌體的分離及其生物學(xué)特性研究.生物技術(shù)通訊，2013.4:p.008.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。[0062]鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)在文獻“王金良，密切注視鮑曼不動桿菌的耐藥發(fā)展趨勢.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2005.28(4):p.355-356.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0063]大腸埃希菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)在文獻“孔海深and汪寶貫，超廣譜β_內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的耐藥性.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2000.23(1):ρ.23-25.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0064]LB液體培養(yǎng)基的制備:Tryptonl%，Yeast Extract0.5%，NaCll%，pH7.0,121°C高壓滅菌20min ；
[0065]制作LB固體平板時在LB液體培養(yǎng)基中再加入1.5%瓊脂粉，121°C高壓滅菌20min ；
[0066]制作LB半固體平板時在LB液體培養(yǎng)基中再加入0.75%瓊脂粉，121°C高壓滅菌20min ；
[0067]上述％表示質(zhì)量體積百分數(shù)，g/100mL.[0068]限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自NEB公司。
[0069]鎳柱預(yù)裝柱購自上海生工生物工程有限公司。
[0070]Profile-13560 (IOX)ATP微生物快速檢測系統(tǒng)購自北京浩正智信科技有限公司。
[0071]SRA試劑購自北京浩正智信科技有限公司，Profile-13560 (10X) ATP微生物快速檢測系統(tǒng)自帶。
[0072]熒光酶購自北京浩正智信科技有限公司，Profile-13560 (10X)ATP微生物快速檢測系統(tǒng)自帶。
`[0073]實施例中所用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0074]實施例1、重組溶葡球菌酶的獲得
[0075]一、表達載體的構(gòu)建
[0076](一)在NCBI 上 BLAST 得到溶葡球菌酶 Lysostaphin (Staphylococcus simulansby stashylolyticus) (Gene ID:8864975)的基因序列，對其進行優(yōu)化設(shè)計,合成SEQ IDN0.1所示的序列，其中溶葡球菌酶的基因為SEQ ID N0.1中自5’末端起第37位至第777位核苷酸所示的DNA分子，溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2自N端起第13位至第258位氨基酸所示。優(yōu)化后的序列使溶葡球菌酶更易于在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中進行可溶性表達。
[0077](二)用BamHI和HindIII雙酶切SEQ ID N0.1所示的DNA分子，得到基因片段；用BamHI和HindIII雙酶切表達載體pQE30，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒pQE30-Lys ;將重組質(zhì)粒pQE30_Lys轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transl-Tl,挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pQE30-Lys經(jīng)酶切鑒定正確后進行測序，測序結(jié)果正確。
[0078]二、重組溶葡球菌酶的誘導(dǎo)表達與純化
[0079](一 )將重組質(zhì)粒pQE30_Lys轉(zhuǎn)化至表達菌株E.coli M15中，將重組菌涂于含有氨芐抗生素(終濃度100μ g/ml)的固體LB培養(yǎng)基平板中，倒置平板，37°C過夜培養(yǎng)。
[0080](二)挑取單克隆至含有氨芐抗生素(終濃度100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖過夜，次日按1: 100的體積比轉(zhuǎn)接至500ml新鮮的含有氨芐抗生素(終濃度100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約0.6-0.8。
[0081](三)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0mmoI/L, 37°C繼續(xù)振搖，6_8h后收集菌液。
[0082](四)將菌液10，000X8離心101^11，棄掉上清，用0.0111101/1pH7.2的PBS重懸菌體，制成菌懸液。
[0083](五)將菌懸液超聲波破碎處理，10，000Xg離心lOmin，收集上清，記作上清I。
[0084]將空載體pQE30轉(zhuǎn)化至表達菌株E.coli M15中，將所得重組菌涂于含有氨芐抗生素(終濃度100μ g/ml)的固體LB培養(yǎng)基平板中，倒置平板，37°C過夜培養(yǎng)。重復(fù)步驟(二)至(五)，得到對照上清。
[0085]將上清I和對照上清進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖1所示。
[0086]圖1中，M:蛋白Marker ；1~2:對照上清；3:上清I。
[0087]圖1表明，對照上清不含有27kD的目的條帶(即重組溶葡球菌酶)，上清I含有含有27kD的目的條帶。
[0088](六)將上清I經(jīng)0.45 μ m濾膜過濾后采用鎳柱預(yù)裝柱回收目的蛋白。
[0089]1、將鎳柱預(yù)裝柱柱內(nèi)的乙醇沖洗干凈；
[0090]2、用5-10倍柱體積(I柱體積=5ml, Iml樹脂可結(jié)合6mg蛋白)的N1-Native-O緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，pH8.0)平衡柱子，控制流速在 lml/min ；
[0091]3、將上清I上樣，控制流速為0.5-lml/min，收集過柱液；
[0092]4、將步驟3的過柱液重復(fù)步驟3 —次，收集過柱液；
[0093]5、用 5 倍柱體積的 N1-Native-O 緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,pH8.0)過柱，直至在0D=280nm檢測時沒有蛋白洗出；
[0094]6、用 5-10 倍柱體積的 N1-Native-20 緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mMImidazole, pH8.0)過柱并收集過柱液,控制流速在lml/min ；
[0095]7、用 5-10 倍柱體積的 N1-Native-50 緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,50mMImidazole, pH8.0)過柱并收集過柱液,控制流速在lml/min ；
[0096]8、用 5-10 倍柱體積的 N1-Native-100 緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOOmMImidazole, pH8.0)過柱并收集過柱液,控制流速在lml/min ；
[0097]9、用 5-10 倍柱體積的 N1-Native-250 緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250mMImidazole, pH8.0)過柱并收集過柱液,控制流速在lml/min ；
[0098]10、用 5-10 倍柱體積的 N1-Native-500 緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,500mMImidazole, pH8.0)過柱并收集過柱液,控制流速在lml/min ；
[0099]11、用 5-10 倍柱體積的 N1-Native-O 緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH8.0)平衡柱子，最終將鎳柱保存在體積百分含量為30%的乙醇中；
[0100](七)將步驟(五)得到的上清I及步驟(六)鎳柱純化得到的各過柱液進行SDS-PAGE檢測。
[0101]結(jié)果如圖2所示。
[0102]圖2中，M:蛋白Marker ；1:上清液I ;2_9:鎳柱純化過程中的各過柱液。
[0103]其中泳道2為步驟3的過柱液,3為步驟4的過柱液,4-9依次為N1-Native-0/20/50/100/250/500 的過柱液
[0104]圖2表明，經(jīng)過鎳柱純化后，N1-Native-250過柱液中含有高濃度的目的蛋白(重組溶葡球菌酶)。
[0105]將N1-Native-250過柱液超濾，得到重組溶葡球菌酶，再將其溶于0.01mol/LpH7.2的PBS緩沖液中，制得重組溶葡球菌酶液。
[0106]實施例2、點滴法檢測重組溶葡球菌酶體外殺菌活性
[0107]將I株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和173株臨床分離的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)期，各取500ul鋪雙層LB平板，室溫靜置lOmin。吸取Iul重組溶葡球菌酶液滴于平板上，同時以0.01mol/L pH7.2的PBS做空白對照，每組三個平行。將平板37°C倒置培養(yǎng)3-4h，觀察結(jié)果，結(jié)果均如圖3所示。
[0108]圖3A為重組溶葡球菌酶組，圖3B為PBS (空白對照)組。
[0109]圖3表明，滴有重組溶葡球菌酶區(qū)域出現(xiàn)透亮的圓形裂解斑，PBS (空白對照)組則沒有裂解斑，說明重組溶葡球菌酶對金黃色葡萄球菌具有體外殺菌活性。
[0110]純化得到的重組溶葡球菌酶帶有的His標(biāo)簽不影響重組溶葡球菌酶的活性。
[0111]實施例3、平板計數(shù)受試菌
[0112]一、將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌各菌培養(yǎng)到對數(shù)期。
[0113]二、將步驟一得到的各菌液離心收集并用0.01mol/L pH7.2的PBS重懸，重復(fù)兩次，然后用0.01mol/L pH7.2的PBS做10倍梯度稀釋，分別吸取各菌各濃度的菌液的稀釋液50 μ I涂布于固體LB平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜，每個梯度做三個重復(fù)，結(jié)果取平均值，同時取0.01mol/L pH7.2的PBS50 μ I涂布于固體LB平板，作為空白對照。
[0114]三、次日選擇各濃度菌液的稀釋液菌落數(shù)在30-300范圍內(nèi)的平板稀釋度為合適稀釋度，平板計數(shù)計算對應(yīng)濃度菌液的50ul體積中的cfu，其中金黃色葡萄球菌的計數(shù)結(jié)果如表1所示。
[0115]實施例4、結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP發(fā)光法特異定量檢測葡萄球菌
[0116]按照Profile-13560 (10X) ATP微生物快速檢測系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作進行如下實驗:
[0117]一、分別取50 μ I實施例3制備的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)培養(yǎng)到對數(shù)期的的原液、以及用0.01mol/L ρΗ7.2的PBS稀釋10、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍的稀釋液加入到專用的過濾比色杯中，比色杯下鋪一層濾紙。向比色杯中滴加4滴SRA試劑 (非細菌細胞釋放液)，用壓力器對準(zhǔn)比色杯頂端，按下壓力器把液體壓出至濾紙，重復(fù)該步驟一次。
[0118]二、將比色杯放入Profile-13560 (10X) ATP微生物快速檢測系統(tǒng)的抽屜中，在比色杯中加入100 μ I (約4.5ug)用0.01mol/L pH7.2的PBS溶解的重組溶葡球菌酶液，靜置2min,使金黃色葡萄球菌充分被裂解。
[0119]三、吸取50ul熒光酶溶液加入到各比色杯中，吹吸混勻3次。
[0120]四、將比色杯推回抽屜，記錄儀器讀數(shù)。
[0121]每個濃度的金黃色葡萄球菌液做三組重復(fù)，計算結(jié)果取平均值，結(jié)果如表1所示。
[0122]表1平板計數(shù)法與ATP發(fā)光法測定葡萄球菌總數(shù)結(jié)果比較
[0123][0124]表1中的細菌總數(shù)為50ul體積菌液中的細菌總數(shù)。
[0125]五、結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP發(fā)光法與平板計數(shù)法相關(guān)性分析
[0126]根據(jù)表1，采用10_4及以上濃度各組的數(shù)據(jù)，以lg50 μ I菌液中細菌總數(shù)為X軸，以ATP發(fā)光法的Ig光值為Y軸，做Χ、Υ散點圖描繪關(guān)系曲線，結(jié)果如圖4所示，線性回歸方程為:y=0.9458x-0.5837，R2=0.9947。
[0127]圖4表明，平板計數(shù)法的Ig細菌總數(shù)與ATP發(fā)光法的Ig光值呈顯著的線性相關(guān)性。
[0128]由表1可知，結(jié)合重組溶葡球菌酶的此種ATP發(fā)光法最少可檢測出50 μ I葡萄球菌液中的約186個菌落，由表1和圖4表明，當(dāng)菌數(shù)在186cfu以上時，Ig光值與Ig細菌總數(shù)呈顯著的線性相關(guān)。`
[0129]六、結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP發(fā)光法檢測葡萄球菌的特異性
[0130]各取實施例3確定的50 μ I體積中細菌總數(shù)均約2Χ IO6Cfu的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌進行步驟一至步驟四的操作，結(jié)果如圖5所示。
[0131]圖5中，1:金黃色葡萄球菌；2:大腸桿菌；3:沙門氏菌；4:嗜麥芽窄食單胞菌；5:糞腸球菌；6:鮑曼不動桿菌；7:大腸埃希菌；8:肺炎克雷伯菌。
[0132]圖5表明，同等濃度下，葡萄球菌的相對發(fā)光值與其他受試菌株存在明顯差異。說明重組溶葡球菌酶對于葡萄球菌顯示了特異的強大的殺菌能力。
[0133]將大腸桿菌、沙門氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分別進行實施例2的點滴法，以驗證重組溶葡球菌酶對于各種菌的殺傷活性。結(jié)果表明，重組溶葡球菌酶對除金黃色葡萄球菌之外的其它受試菌株均無殺菌活性，均不能觀察到透亮的裂解斑，進一步說明結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP發(fā)光法檢測葡萄球菌具有特異性。
【權(quán)利要求】
1.一種重組溶葡球菌酶，為如下I)或2)所示: 1)SEQ ID N0.2中自N端起第13位至第258位氨基酸所示的蛋白； 2)將I)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因為如下中至少一種: O SEQ ID N0.1中自5’末端起第37位至第777位核苷酸所示的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.一種定量檢測能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌的方法，該方法是結(jié)合權(quán)利要求1所述的重組溶葡球菌酶的ATP生物發(fā)光法，包括如下步驟: Cl)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
1)用PBS制備不同濃度的 葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液，將50ul標(biāo)準(zhǔn)液中的細菌總數(shù)，記作A，得到不同濃度的葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的IgA ； 2)取50μ 11)中制備的不同濃度的葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液分別加入比色杯中； 3)在比色杯中加入100μ I含4.5ug權(quán)利要求1所述重組溶葡球菌酶的PBS，靜置2min，使葡萄球菌充分裂解； 4)吸取50ul熒光酶溶液加入到比色杯中，混勻； 5)測定比色杯中溶液的熒光值，記作B，得到50ul各濃度的葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的IgB ； 6)以IgA為X軸，以IgB為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程； (2)測定待測葡萄球菌的活菌個數(shù) 進行所述步驟(1)的操作，與所述步驟(1)唯一不同的是，將50 μ I標(biāo)準(zhǔn)液替換成50 μ I待測葡萄球菌液，得到50ul待測葡萄球菌液對應(yīng)的IgM ； (3)將IgM帶入線性回歸方程，計算IgM對應(yīng)的細菌總數(shù)的Ig值，記作lgX，X即為50ul待測葡萄球菌液的活菌個數(shù)； 所述能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌為葡萄球菌；
所述 PBS 為 0.01mol/L ρΗ7.2 的 PBS ； 所述比色杯為過濾比色杯； 所述步驟(1)中葡萄球菌與步驟(2)中葡萄球菌為同一種葡萄球菌； 所述方法為非疾病診斷或治療方法，具體可應(yīng)用于科研用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)液中的細菌總數(shù)分別為 2239666、223966、22396、2259、186 和 26cfu。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述葡萄球菌為金黃色葡萄球菌。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白在定量檢測能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌中的應(yīng)用； 和/或，權(quán)利要求1所述的蛋白在制備定量檢測能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用；和/或， 權(quán)利要求5-7任一所述的方法在定量檢測能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌中的應(yīng)用；所述應(yīng)用為非疾病診斷或治療方法，具體可應(yīng)用于科研用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述能被重組溶葡球菌酶裂解的細菌為葡萄球菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述葡萄球菌為金黃色葡萄球菌。
【文檔編號】C12N15/70GK103509777SQ201310460065
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】童貽剛, 李玉元, 米志強, 安小平 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所