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      減毒的sars以及作為疫苗的用途的制作方法

      文檔序號:432398閱讀:767來源:國知局
      專利名稱:減毒的sars以及作為疫苗的用途的制作方法
      減毒的SARS以及作為疫苗的用途本發(fā)明涉及編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸,當(dāng)與相同細(xì)胞培 養(yǎng)物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時,所述減毒的 SARS-CoV病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的最大病毒滴度降低。技術(shù)背景涉及功能基因向細(xì)胞中的插入以實(shí)現(xiàn)治療效果的治療方法也被稱 為基因治療方法,因?yàn)榛虺洚?dāng)藥物?;蛑委熓且环N主要用于矯正 對疾病發(fā)展負(fù)責(zé)的缺陷基因的技術(shù)。也稱為載體的運(yùn)載分子被用于遞送治療基因到患者的目標(biāo)細(xì)胞。 當(dāng)前,最常見的載體是病毒,其已經(jīng)被遺傳地改變來攜帶人類或動物a,、病毒是天然地進(jìn):的。然而r與此同時科i家利用了這種能力并操作病毒基因組來除去致病基因并插入治療基因。用病毒栽體感染目標(biāo)細(xì)胞例如患者的肝臟或肺細(xì)胞。然后載體將 它含有治療基因的遺傳物質(zhì)卸載到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。來自治療基因的功能 性蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生使目標(biāo)細(xì)胞恢復(fù)到標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)。在可選擇的方法中,這些病毒載體被用于表達(dá)異源基因,所述異 源基因在接受該載體的受試者中引起免疫原性反應(yīng)并因而免疫該受試 者。在這種情況下,病毒載體充當(dāng)疫苗。自從引起SARS的致病病原體被鑒定為新的冠狀病毒以來 (SARS-CoV;參見Drosten et al., 2003; Holmes and Enjuanes, 2003; Marraetal.,2003; Rota et al., 2003 ),冠狀病毒分子生物學(xué)的研究已經(jīng) 被給予了非常高的優(yōu)先級,以開發(fā)預(yù)防和控制冠狀病毒感染的有效策 略。冠狀病毒是ssRNA ( + )病毒,其具有迄今為止在RNA病毒中中 發(fā)現(xiàn)的最大基因組,長度在25和31千堿基之間(kb,參見Siddell S.G., 1995, The Coronavindae )。當(dāng)冠狀病毒感染細(xì)胞時,基因組RNA( gRNA ) 在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制,產(chǎn)生正極性和負(fù)極性的一組亞基因組RNA ( sgRNA ) (Sethna et al., 1989; Sawicki & Sawicki, 1990s Van der Most & Spaan,1995;和Enjuanes, 2005 )。由于冠狀病毒在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的事實(shí),暗示了冠狀病毒作為栽體 用于基因治療和疫苗接種的用途。特別地,可以產(chǎn)生冠狀病毒的缺陷 性干擾(DI)基因組。這些DI基因組是缺失突變,其需要補(bǔ)充病毒或 輔助病毒的存在用于復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄(參見Chang et al., 1994; WO97/34008;西班牙專利申請P9600620; Izeta et al., 1999;和S 4 nchez etal., 1999 )。本領(lǐng)域使用各種系統(tǒng)來在接受組合物的動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng),所 述組合物含有DI基因組,所述基因組除其他之外含有編碼異源報(bào)告基 因或來自不同傳染原的基因的序列(豬生殖和呼吸道疾病病毒, PRRSV;參見,Alonsoetal.,2002a,2002b)。冠狀病毒全長cDNA克隆的構(gòu)建(Almaz d n et al., 2000; Casais et al.,2001; Thiel et al., 2001; Yount et al., 2000; Yount et al., 2002; Yount et al., 2003 )提供了基因操作冠狀病毒基因組來研究基本病毒過程和開 發(fā)表達(dá)栽體的機(jī)會。雖然SARS-CoV僅在2002年才出現(xiàn),SARS-CoV分離物的基因組 序列近來已經(jīng)公開,并提供了關(guān)于SARS-CoV基因組的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā) 育和變異性的重要信息(Marraetal.,2003; Rota et al., 2003 ) 。 29.7-kb Urbam抹基因組的約三分之二編碼復(fù)制酶基因,其包含開放閱讀框Rep la和Rep lb,后一個通過核糖體的移碼來表達(dá)(Thiel et al., 2003 )。 兩個ORF的翻譯引起兩個大的聚合蛋白的合成,其由病毒蛋白酶加工 來產(chǎn)生復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物(Ziebuhretal., 2000)。另三分之一基因組包括編碼結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的基因組,順序是 5'-S-3a-3b-E-M-6-7a-7b-8a-8b-9b-N-3'。這些蛋白由不連續(xù)的轉(zhuǎn)錄過程 來表達(dá),其最可能在負(fù)鏈的合成期間發(fā)生,引起亞基因組mRNA的3' 共末端嵌套集的產(chǎn)生,每一個mRNA在其5'末端具有來自基因組5'端 的脫帽的前導(dǎo)序列(Sawicki and Sawicki, 1998; Z她ga et al., 2004 )。 亞基因組反義RNA物質(zhì)的合成由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(TRS)來調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)序列包括在每個基因之前以及在前導(dǎo)序列的3'末端發(fā)現(xiàn)的高度保 守的核心序列(Thieleta1.,2003 )。早先已經(jīng)描述了 SARS-CoV Urbani抹的全長cDNA的制備(Yount et al., 2003 ),其中它顯示了重組病毒復(fù)制與野生型病毒一樣有效。還描述了在桿狀病毒系統(tǒng)中通過病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)M、 E和S的表達(dá), SARS-CoV樣粒子的產(chǎn)生(Mortola & Roy, 2004)。顯示的是,S、 E 和M由單個重組病毒的高水平表達(dá)容許病毒顆粒樣粒子(VLP)的組 裝和釋放。在SARS-CoV病毒顆粒包膜中,四種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),S、 E、 M和3a 被包埋到膜中。M和E蛋白是病毒組裝和發(fā)芽的關(guān)鍵因素(Fischer et al., 1998 )。實(shí)際上,這些蛋白在細(xì)胞系中的表達(dá)引起病毒樣粒子的產(chǎn)生(Baudoux et al., 1998; Ho et al., 2004; Huang et al., 2004; Mortola & Roy, 2004; Vennema et al., 1996 )。早先已經(jīng)研究了在不同的冠狀病毒中刪除群特定基因的效果。使 用鼠肝炎病毒(MHV)作為模型的報(bào)告顯示了, ORF4、 5a、 2a和HE 的刪除在天然宿主中是減毒性的(de Haan et al., 2002 )。類似地,刪 除TGEV的ORF 7 ( Ortego et al., 2002 )以及貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)的ORF3abc和7ab (Haijemaeta1.,2004 )的研究引起病毒減 毒。然而,其中一次一個地刪除ORF 3a、3b、6、7a和7b的其他SARS-CoV 缺失突變林不顯示體外復(fù)制(在組織培養(yǎng)中滴度不降低)和小鼠模型 中的體內(nèi)復(fù)制(沒有病毒的減毒)效力的顯著改變(Yount et 2005 )。 這些缺失突變抹還沒有在其他動物模型中關(guān)于減毒表型的存在進(jìn)行評 估。KUOET AL. ( 2003 )報(bào)道了,缺乏整個基因4、 5a和E的4小鼠 肝炎病毒(MHV)的E基因突變能夠組裝冠狀病毒樣粒子。然而,突 變體中病毒顆粒組裝以比野生型中的病毒顆粒組裝數(shù)量級上更低的效 率發(fā)生,結(jié)論是這種病毒突變體不是作為疫苗有用的。另一個團(tuán)隊(duì), Huang et al. ( 2004 ),通過檢查僅由少數(shù)SARS-CoV病毒基因但沒有 遺傳物質(zhì)構(gòu)成的非傳染性VLP的形成,檢查了特定SARS-CoV基因?qū)?于病毒組裝的作用。根據(jù)他們的實(shí)驗(yàn),作者斷定,只要存在M和N蛋 白,基因E對于VLP形成不是必需的。WO 04/092360公開了來自SARS冠狀病毒的核酸和蛋白,其可以 用于疫苗制劑、診斷試劑和試劑盒的設(shè)備和制造。SARS-CoV在2002年晚期在人類中爆發(fā),并在數(shù)月內(nèi)從其在廣東 (中國)的起源傳播到超過30個國家??焖賯鞑ズ透咚劳雎适沟?SARS-CoV成為全球性威脅,對于它沒有有效的治療。因而本發(fā)明的難題在于提供具有良好安全性和免疫原性的用于保護(hù)對抗SARS-CoV 的疫苗。發(fā)明概述這個難題現(xiàn)在通過編碼減毒SARS-CoV病毒的核酸解決了。根據(jù) 本發(fā)明的一個方面,當(dāng)與相同細(xì)胞培養(yǎng)物中的野生型SARS-CoV病毒 的最大病毒滴度相比時,所述減毒病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的最 大病毒滴度降Y氐至少2的因數(shù)(reduced at least by a factor of 2 )。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及編碼SARS-CoV病毒的核酸,其 是通過包括步驟的方法可獲得的,其中SARS-CoV病毒的基因組通過 修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列來修飾,使得該核酸不能表 達(dá)功能性E蛋白。在本發(fā)明的上下文中,功能性E蛋白是一種蛋白, 其-由SEQIDNO: 6編碼,或由與SEQIDNO: 6的序列具有至少 70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源性的基因編碼;和 -能夠與其他SARS-CoV蛋白締合進(jìn)入病毒包膜中。 編碼如上所述修飾的E蛋白的核酸將產(chǎn)生在其包膜中不含有E蛋白的病毒顆粒。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼SARS-CoV病毒的核酸,其中所述核酸不 編碼如上所迷的SARS-CoV病毒的功能性蛋白E的序列。根據(jù)這個實(shí) 施方式,所述核酸可以編碼減毒的SARS-CoV病毒,并包含編碼病毒 蛋白復(fù)制酶和S和M和N的序列。所述核酸可以含有其他SARS衍生 的蛋白,例如3a蛋白。在本發(fā)明的一個方面,如上定義的核酸不含有任何其他SARS衍 生的蛋白。所迷核酸優(yōu)選地不能表達(dá)蛋白,所述蛋白由以下的編碼-SEQIDNO: 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19的任一個;或-與SEQ ID NO: 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19的序列具有至少 70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源性的^[壬何序列。在可選擇的實(shí)施方式中,所述核酸優(yōu)選的不能表達(dá)蛋白,所述蛋 白由以下的編碼-SEQIDNO: 12、 13、 14、5、 16、 17、 18、 19的任一個;或-與SEQ ID NO: 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源性的任何序列。根據(jù)本發(fā)明的這個方面,在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述核酸僅 編碼病毒蛋白復(fù)制酶和S和M和N。根據(jù)進(jìn)一步的方面,本發(fā)明的核酸編碼SARS-CoV病毒,其中所 述核酸包含病毒蛋白復(fù)制酶和S和M和N和/或E的序列。再一次, 所述核酸可以含有其他SARS衍生的蛋白,例如,病毒蛋白3a的序列, 但是優(yōu)選的不含有以上定義的任何其他SARS衍生的蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述SARS-CoV病毒的核酸不編 碼病毒蛋白6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b。所述核酸可以是RNA或DNA。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含上述核酸之一的宿主細(xì)胞和SARS-CoV病 毒顆粒。例如,SARS-CoV病毒顆??梢酝ㄟ^將上述核酸之一導(dǎo)入宿 主細(xì)胞中來獲得。本發(fā)明進(jìn)一步涉及疫苗,所述疫苗包含相應(yīng)的SARS-CoV病毒顆 粒或相應(yīng)的核酸或相應(yīng)的宿主細(xì)胞。在所述疫苗中,所述病毒顆???以以減毒的形式存在,即,復(fù)制感受態(tài)的和傳染性的形式,但也可以 以鈍化的形式存在。根據(jù)病毒鈍化的公知方法使用熱或化學(xué)物質(zhì)鈍化 減毒病毒將進(jìn)一步提高疫苗使用的安全性。所述疫苗可以進(jìn)一步包含 藥學(xué)上可接受的佐劑、載體或賦形劑。所述疫苗優(yōu)選的用于接種哺乳 動物,優(yōu)選的人類,并產(chǎn)生免疫反應(yīng),所述免疫反應(yīng)降低或消除由 SARS-CoV病毒感染引起的疾病癥狀。在本發(fā)明的另一個方面中涉及制備SARS-CoV疫苗的方法,包括 通過修改編碼SARS-CoV蛋白的核酸來修飾包含SARS-CoV病毒基因 組的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述制備SARS-CoV疫苗的方法,包括通 過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列使得該基因不表達(dá)功能性 E蛋白來修飾包含SARS-CoV病毒基因組的核酸。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述方法進(jìn)一步包括修改SARS-CoV 基因組的序列,使得所述核酸表達(dá)病毒蛋白復(fù)制酶、S、 M和N,并進(jìn) 一步表達(dá)或不表達(dá)編碼蛋白3a的序列。在另 一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述方法進(jìn)一步包括修改SARS-CoV 基因組的序列,使得所述核酸不能表達(dá)與SARS-CoV基因E、 6、 7a、7b、 8a、 8b和9b (相應(yīng)于SEQIDNO: 6、 14到19 )編碼的蛋白質(zhì)具 有至少80%的同源性、優(yōu)選的至少90%的同源性或至少95%的同源性的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的又一個實(shí)施方式中,所述方法進(jìn)一步包括修改 SARS-CoV基因組的序列,使得所述核酸不能表達(dá)與SARS-CoV基因 3a、 3b、 6、 7a、 7b、 8a和8b (相應(yīng)于SEQ ID NO: 12到19)編碼的 蛋白質(zhì)具有至少80%的同源性、優(yōu)選的至少90%的同源性或至少95% 的同源性的蛋白質(zhì)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述方法進(jìn)一步包括修改SARS-CoV 基因組的序列,使得所述核酸表達(dá)病毒蛋白復(fù)制酶、S、 M、 N和E, 并進(jìn)一步表達(dá)或不表達(dá)編碼蛋白3a的序列。根據(jù)另 一個優(yōu)選的實(shí)施方式,所述方法進(jìn)一步包括修改SARS-CoV 基因組的序列,使得所述核酸不能表達(dá)與SARS-CoV基因6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b (相應(yīng)于SEQ ID NO: 14到19 )編碼的蛋白質(zhì)具有至少 80%的同源性、優(yōu)選的至少90%的同源性或至少95%的同源性的蛋白 質(zhì)。在又一個實(shí)施方式中,所述方法進(jìn)一步包括修改SARS-CoV的基 因組的序列,使得所迷核酸不能表達(dá)除了復(fù)制酶S、 M、 N和/或E以 外的任何SARS-CoV衍生的蛋白質(zhì)編碼序列,并且進(jìn)一步表達(dá)或不表 達(dá)編碼蛋白3a的序列。對于制備SARS-CoV疫苗,所述方法進(jìn)一步包括向宿主細(xì)胞中導(dǎo) 入所述修飾的核酸,并分離編碼所述修改的基因組的核酸或包含所述 修飾的核酸的SARS-CoV病毒顆粒。所述制備SARS-CoV疫苗的方法進(jìn)一步包括與藥學(xué)上可接受的佐 劑、載體或賦形劑混合所述核酸的混合物或所迷SARS-CoV病毒顆粒 的混合物在以下的詳細(xì)說明中,在實(shí)施例中和在權(quán)利要求中描述了本發(fā)明 的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式。發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸和相應(yīng)的病毒以及 它們的醫(yī)學(xué)用途。所迷減毒病毒優(yōu)選的能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生最大病毒滴度,當(dāng)與相同細(xì)胞培養(yǎng)物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病 毒滴度相比時,所述最大病毒滴度降低至少2的因數(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述減毒病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生最 大病毒滴度,所述最大病毒滴度降低至少5的因數(shù)、優(yōu)選的至少10或20的因數(shù)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,所述減毒的SARS-CoV病毒能夠在細(xì)胞 培養(yǎng)物中產(chǎn)生最大病毒滴度,所述最大病毒滴度優(yōu)選的降低2到100 之間的因數(shù)、更優(yōu)選的5到50之間的因數(shù)、以及最優(yōu)選的10到25之間的因數(shù)。根椐本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方式,所迷核酸不編碼SARS-CoV病 毒的功能性蛋白E的序列。所述核酸例如可通過包括步驟的方法獲得, 其中SARS-CoV病毒的基因組通過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因 的序列來修飾,使得該核酸不能表達(dá)功能性E蛋白。所述修飾可以包 括編碼序列的刪除和/或替換,或調(diào)節(jié)序列的刪除和/或替換。例如可能 的是,但非必需的是除去E蛋白的整個編碼序列。術(shù)語"修改序列"被用于指出使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)修飾核酸序 列。當(dāng)"修改序列"時,通過應(yīng)用包括但不限于核苷酸或序列刪除、 核苷酸替換或核苷酸添加的技術(shù),所述序列被修飾,使得它不同于野 生型序列。Sambrook & Russel ( 2001 )描迷了這些和進(jìn)一步的技術(shù)。術(shù)語"E-"或"AE"將在本申請中可互換地使用,來指代(至少) 缺少基因E的減毒的SARS-CoV病毒,或指代編碼(至少)缺少基因 E的減毒的SARS-CoV病毒的核酸等等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方面,E基因的修飾包括在BAC中SARS-CoV 復(fù)制子或SARS-CoV的全長cDNA克隆的制備和隨后該BAC的修飾。 這具有特別的益處,SARS-CoV基因組的修飾可以非常方便地進(jìn)行。本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn),包含本發(fā)明的核酸的疫苗是安全的, 并且可以啟動對抗SARS-CoV病毒的免疫反應(yīng)。所迷疫苗包^l舌核酸或 減毒病毒顆粒,其含有感染人類或動物細(xì)胞必需的所有元件并且其可 以是鈍化或非鈍化的。 .使用減毒病毒作為疫苗,細(xì)胞的感染將導(dǎo)致病毒的復(fù)制和進(jìn)一步 的傳染性病毒顆粒的產(chǎn)生。然而,與野生型SARS病毒相比,減毒病 毒的滴度將顯著更低。換句話說,所述疫苗菌抹將僅能在接種的宿主中生長到降低的最大滴度。宿主的免疫系統(tǒng)將產(chǎn)生針對病毒的免疫反應(yīng),其降低或消除了由野生型SARS-CoV感染引起的疾病癥狀。已經(jīng)產(chǎn)生了能夠在培養(yǎng)的細(xì)胞中和在體內(nèi)復(fù)制和增殖的、基于 SARS-CoV缺陷性病毒的許多重組疫苗。核酸編碼SARS-CoV復(fù)制酶 和某些、但不是全部的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。SARS-CoV工程化疫苗 病毒的一個主要特征是它們在體內(nèi)是傳染性的但是高度減毒的。在可選擇的實(shí)施方式中,通過表達(dá)本發(fā)明的核酸以及隨后使用病 毒鈍化的公知方法例如化學(xué)或熱處理來鈍化,獲得減毒的病毒。這個 實(shí)施方式具有特別的益處,病毒被解除武裝兩次,并因而比本領(lǐng)域中早先提示的疫苗更安全。在本申請中,術(shù)語"減毒的"被用于指代復(fù)制感受態(tài)的和傳染性 的病毒,在哺乳動物或在細(xì)胞培養(yǎng)物中,與在相同條件下在哺乳動物 中或在相同細(xì)胞的培養(yǎng)物中野生型SARS-CoV病毒產(chǎn)生的最大病毒滴 度相比,所述病毒產(chǎn)生降低的最大病毒滴度。因而這種評估步驟可以 基于細(xì)胞培養(yǎng)物或非人類哺乳動物,優(yōu)選的鳥類或倉鼠(例如,實(shí)施 例15中使用的Golden Syrian倉鼠)。在減毒病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長速度太低的情況下,細(xì)胞培養(yǎng) 物中減毒的SARS-CoV病毒用于疫苗生產(chǎn)的用途是受限的或甚至不可 能的。然而,通過使病毒與培養(yǎng)基適應(yīng),減毒的SARS-CoV病毒在細(xì)的丄大滴度甚至更高的i大病毒^度。由于病^毒能夠適應(yīng)改變的環(huán)境,病毒重復(fù)傳代的長期培養(yǎng)將改善減毒病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長速 度。然而,這種方法是非常費(fèi)時的。改善減毒病毒的體外生長的另一種方法是使用用于感染的宿主細(xì) 胞,其反過來提供了不由減毒的SARS-CoV的核酸編碼的必需 SARS-CoV蛋白。進(jìn)一步的,在反過來提供這種因子的稍微不同的方 法中,宿主細(xì)胞可以被減毒的SARS-CoV病毒和輔助病毒感染、或表 達(dá)必需的SARS-CoV蛋白的其他核酸。明顯地,這方法可以產(chǎn)生能在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長到最大病毒滴度 的SARS-CoV病毒,其超過相同培養(yǎng)物中野生型病毒的最大病毒滴度, 但仍然是在體內(nèi)以最大滴度生長的減毒病毒,該最大滴度與野生型 SARS相比顯著降低,但仍足以誘導(dǎo)針對SARS-CoV的全身性免疫反應(yīng)和粘液性免疫反應(yīng)。術(shù)^吾"復(fù)制感受態(tài)病毒斗亥酸(replication competent viral nucleic acid)"被用于指代一種核酸,其包含編碼病毒復(fù)制酶的序列和代表復(fù) 制起點(diǎn)的序列,即,觸發(fā)復(fù)制酶的核酸復(fù)制的序列。術(shù)語"傳染性"被用于指代一種病毒,其能夠通過感染細(xì)胞、復(fù) 制病毒核酸、表病毒蛋白、將病毒核酸與病毒蛋白組裝成病毒顆粒并 通過新產(chǎn)生的病毒顆粒感染進(jìn)一步的細(xì)胞來生長。術(shù)語"編碼減毒的病毒的核酸"被用于指代編碼減毒病毒的所有 序列的核酸。相應(yīng)的核酸可以用于通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物獲得病毒顆粒, 其將引起減毒病毒在所迷培養(yǎng)物中的生長。所述核酸也可以用作疫苗。SARS-CoV外殼蛋白是一些蛋白,例如SARS-CoVE、 M或S(刺 突)蛋白。這些蛋白可以具有SARS-CoV分離物中觀察到的序列,或 可以通過本領(lǐng)域已知的方法衍生自這些序列。使用重組表達(dá)方法,例 如可能的是,通過添加、刪除或替換一個或幾個氨基酸來修飾蛋白序 列。因而本發(fā)明覆蓋了包含或編碼外殼蛋白的病毒,所述外殼蛋白與 野生型SARS-CoV蛋白具有至少60%、優(yōu)選的至少75%、最優(yōu)選的至 少95%的序列同源性。在所包括的序列表和附圖中,提供了一些SARS-CoV的序列SARS-CoV Repla:SEQ ID NO:lSARS-CoVReplb:SEQ ID N〇:2SARS-CoV N:SEQ ID NO:3SARS-CoV S:SEQ ID NO:4SARS-CoV M:SEQ ID NO:5SARS-CoV E:SEQ ID NO:6SARS-CoV全長克隆SEQ ID NO11Fig. 18SARS-CoV ORF 3a:SEQ ID NO12Fig. 19基因3b的ORF:SEQ ID NO13Fig. 20基因6的ORF:SEQ ID NOMFig. 21基因7a的ORF:SEQ ID NO15Fig. 22基因7b的ORF:SEQ ID NO16Fig. 23基因8a的ORF:SEQ ID NO17Fig. 24基因8b的0RF: SEQIDNO:18 Fig. 25基因9b的ORF: SEQ ID NO: 19 Fig. 26N蛋白的序列也稱為序列9a。 9b序列通過讀碼框移動被包括在9a 序列中。應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地進(jìn)行9b序列的任何修該,從而9a的序列基本上 不被修改,即,以仍然容許功能性9a或N蛋白的表達(dá)的方式。SARS-CoV序列可以基于Urbam林基因組(Genebank,登記號碼 AY278741 )。在全長cDNA中,在位置10338 (C〉T)和11163 ( T>A ) 引入兩個沉默遺傳標(biāo)志。以上列出的基因的命名不同于GeneBank中保 藏的序列中使用的命名。對等物是基因3a等同于XI基因3b等同于X2基因6等同于X3基因7a等同于X4基因8b等同于X5SARS基因的序列和SARS-CoV的特征 5' UTR 1-264 RF la (Rep la) 264-13413 ORF lb (Rep lb) 13398-214855 (刺突蛋白)21492-25259 3a 25268-260923b 25689-26153E (包膜蛋白)261 17-26347M (膜蛋白)26398-270636 27074-27265 7a 27273-27641 7b 27638-27772 8a 27779-27898 8b 27864-281 18 9b 28130-28426N (核蛋白)28120-293883' UTR 29389-29727;其中UTR是指"非翻譯序列"。為了當(dāng)前應(yīng)用的目的,除非另有說明,使用可從歐洲生物信息學(xué)學(xué)會(EBI)獲得的Clustal計(jì)算機(jī)程序確定序列同源性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中,由SARS-CoV是上述序列編碼 的以下蛋白特征在于功能性特征。Repla和lb序列編碼病毒復(fù)制酶, 其特征在于它容許病毒RNA的復(fù)制。M蛋白是膜蛋白,特征在于它與 其他蛋白締合到病毒顆粒的包膜上。N蛋白是核殼蛋白,特征在于它 與病毒RNA締合到病毒顆粒的核殼上。S或刺突蛋白特征在于它與細(xì) 胞受體結(jié)合。3a的蛋白特征在于它也在病毒膜上存在。在本發(fā)明進(jìn)一步可選擇的實(shí)施方式中,編碼減毒的SARS-CoV的 核酸可以進(jìn)一步包括不來自SARS-CoV的核酸序列,例如外源基因所 述外源基因可以是任何來源的。例如,本發(fā)明的核酸可以用作栽體用 于其他病原微生物,例如病毒、細(xì)菌、支原體等等的外源基因的表達(dá)。 具有由此編碼的相應(yīng)核酸或SARS-CoV的疫苗接種因而可以提供針對 SARS-CoV和進(jìn)一步的病原微生物的保護(hù)。本發(fā)明的疫苗中的病毒顆粒優(yōu)選的從SARS-CoV復(fù)制子開始制 備。制備本發(fā)明的核酸和病毒顆粒的方法可以包4舌在細(xì)菌人工染色體 (BAC)中SARS-CoV衍生的復(fù)制子的制備?;谶@種含SARS病毒 復(fù)制子的BAC, SARS-CoV核酸的基因組序列的全長拷貝可以如實(shí)施 例中描述的制備。然后全長克隆可以用于引入點(diǎn)突變、刪除或替換, 其將鈍化某些結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)基因。做為選擇,人們也可以從保藏的復(fù) 制子開始,通過引入希望在核酸中具有的那些序列并刪除不應(yīng)被包括 的序列來相同地修改。換句話說,不必制備全長克隆來作為制備編碼 減毒病毒的核酸的中間產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明,提供了疫苗,其優(yōu)選的能夠誘導(dǎo)針對SARS-CoV的 全身性免疫反應(yīng)和粘液性免疫反應(yīng)。與其他冠狀病毒類似,病毒的刺突蛋白與細(xì)胞受體相互作用并介 導(dǎo)膜融合以容許病毒進(jìn)入易感的目標(biāo)細(xì)胞。因而,刺突蛋白在病毒感 染周期中起到重要作用,并且是中和抗體的主要目標(biāo)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中,所述核酸進(jìn)一步編碼共刺激分子, 例如CD80或CD86或免疫刺激性細(xì)胞因子,例如TNF-ct 、 IFN-Y 、 粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素-2( IL-2)、IL-12或IL-18。本發(fā)明的疫苗可以施用給哺乳動物以獲得免疫反應(yīng),所述免疫反應(yīng)降低或消除由SARS-CoV病毒的感染引起的疾病癥狀。所述疫苗優(yōu) 選的用于接種哺乳動物,特別是人類、環(huán)尾貓熊(a civet cat)、浣熊 或白鼬(aferret)。所有這些動物已知充當(dāng)了 SARS-CoV的宿主。疫苗可以根據(jù)本領(lǐng)域中通常使用的方法來施用。特別地,疫苗可 以通過口服、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)的施用來施用??谠耹施用 是特別優(yōu)選的。所述疫苗也可以包含藥學(xué)上可接受的栽體、賦形劑和/或佐劑。適合于經(jīng)由粘膜途徑施用遺傳疫苗和免疫原的佐劑和栽體是本領(lǐng) 域已知的。例如在Kiyono et al., 1996中綜述了常規(guī)的載體和佐劑。用 于條件免疫反應(yīng)的趨化因子的添加也被本發(fā)明涵蓋。在Toka et al., 2004中綜述了相應(yīng)的化合物和它們的醫(yī)學(xué)用途。特別有益的是使用粒 細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集集落刺激因子、白細(xì)胞介素-2 (IL-2) 、 IL-12、 IL-18 之一。也可以應(yīng)用利用幾種細(xì)胞因子和趨化因子的組合方法。此外, 隨著關(guān)于T細(xì)胞的記憶發(fā)育的需求發(fā)現(xiàn)更多,涉及關(guān)鍵細(xì)胞因子例如 IL-15和IL-23的激發(fā)劑可能證明有益于記憶庫的長期維持。使用跨越基因組的非翻譯的5'和3'末端、整個復(fù)制酶基因和核蛋白 (N)基因的一組重疊cDNA,可以產(chǎn)生復(fù)制子。構(gòu)建SARS-CoV復(fù)制子作為細(xì)菌人工染色體(BAC)的策略可以 如下4既述(i) 鑒定復(fù)制子的工程化中要使用的病毒基因組中的合適的限制性位點(diǎn)。(ii) 產(chǎn)生中間質(zhì)粒作為構(gòu)建SARS-CoV復(fù)制子的基礎(chǔ)。(iii) 通過RT-PCR產(chǎn)生疊蓋SARS-CoVcDNA亞克隆,使用選擇 的限制性位點(diǎn)的復(fù)制子組裝 SARS-CoV復(fù)制子cDNA的構(gòu)建在實(shí)施例1中更多細(xì)節(jié)地說明。 制備本發(fā)明的疫苗中使用的病毒顆粒的方法可以使用以上描述的 復(fù)制子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方面,這些方法基于質(zhì)粒 pBAC-SARS-CoV-REP的使用。含有這種質(zhì)粒的細(xì)菌于2004年9月1 日保藏于 Colecci6n Espafiola de Cultivos ( Tipo, CECT in Valencia, Spain)。保藏物被給予了臨時登記號碼7020。質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV-REP包含編碼SARS-CoV復(fù)制酶和 SARS-CoV N蛋白的復(fù)制感受態(tài)的、非傳染性SARS-CoV基因組的序列。這種載體提供了穩(wěn)定的、安全的和易于操作的基礎(chǔ),用于產(chǎn)生本發(fā)明的病毒顆粒和疫苗。通過克隆至少一個進(jìn)一步的SARS-CoV基因 到復(fù)制子中,可以產(chǎn)生病毒顆粒和疫苗?;蚪M病毒RNA可以用作起始材料來獲得編碼進(jìn)一步的 SARS-CoV蛋白質(zhì)的序列。SARS-CoV Urbani林的基因組RNA可以從 美國亞特蘭大的疾病控制中心獲得。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法從病毒 RNA制備cDNA庫??梢詮腸DNA庫重建全長基因。這些基因然后可 以與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(TRS)和/或翻譯調(diào)節(jié)序列(例如,內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點(diǎn),IRES)組合,并可以插入到復(fù)制子的克隆位點(diǎn)中。如在實(shí)施 例中所示,按這種方式,可以制備編碼SARS-CoV的基因組核酸的全 長拷貝的全長克隆,可以隨后修改來產(chǎn)生編碼減毒病毒的核酸。然后所述核酸可以用于轉(zhuǎn)染輔助細(xì)胞系。如果使用復(fù)制子,需要 使用表達(dá)不由所述核酸編碼的必需SARS-CoV蛋白的細(xì)胞系(例如, 包裝細(xì)胞系)。做為選擇,宿主細(xì)胞可以使用如上所述的復(fù)制子核酸 和輔助病毒、或表達(dá)必需的SARS-CoV蛋白的其他核酸轉(zhuǎn)染。按這種 方式,編碼SARS-CoV復(fù)制酶、SARS-CoV N蛋白和至少一種進(jìn)一步 的SARS-CoV蛋白的核酸(即,復(fù)制子)與進(jìn)一步的必需的SARS-CoV 蛋白締合來形成本發(fā)明的疫苗的病毒顆粒。通過產(chǎn)生以上列出的病毒顆粒,并將它配制到疫苗中,例如,通 過混合病毒顆粒與載體、佐劑和/或賦形劑,可以獲得疫苗。疫苗的測試優(yōu)選的包括按順序的幾個步驟。例如,減毒的 SARS-CoV的免疫原性可以通過在Vero E6細(xì)月包的組織培養(yǎng)物中產(chǎn)生 它們來測試。獲得的抗原可以通過包括離心的常規(guī)過程來部分純化, 可以測試這些抗原是否在小鼠和兔中誘導(dǎo)SARS-CoV中和抗體。選擇的疫苗可以進(jìn)一步測試動物系統(tǒng),例如BALB/c小鼠、白鼬和 恒河猴中的保護(hù)(使用例如在Enserink, 2003; Yang et al., 2004; ter Meulen et al., 2004; Martina et al., 2003; and Kuiken et al., 2004中甘葛述 的方便的方法)。動物模型系統(tǒng)可以連續(xù)地用于疫苗效力測試和初步安全性測試。 首先,疫苗候選物可以在小鼠模型中測試,然后在白鼬SARS-CoV模 型中測試 (Martina et al., 2003 )。進(jìn)一步的判斷可以基于針對 SARS-CoV攻擊的保護(hù),選擇的疫苗候選物然后可以在恒河猴中測試。19為了實(shí)現(xiàn)這個目標(biāo),病毒儲庫可以在青年食蟹猴中滴定。在首先的實(shí)驗(yàn)中,這種病毒儲庫的提高的對數(shù)稀釋物(10"、 101、 102、 103、 104、 105和106 TCID50)用于氣管內(nèi)地感染恒河猴(每個稀釋度n-2)。根 據(jù)早先已經(jīng)建立的方案,從這些SARS-CoV感染的動物中系統(tǒng)性地收 集臨床的、病毒學(xué)的、gross病理學(xué)和免疫學(xué)的(中和抗體、血漿中的 W "方;系a mT MA A拚^眙、粉棍^ et ai., 2004 ).附圖的簡要說明附

      圖1顯示了 SARS-CoV Urbani林的遺傳結(jié)構(gòu)。方框內(nèi)的字母和 數(shù)字代表病毒基因。L,前導(dǎo)序列;UTR,非翻譯區(qū)。標(biāo)明了相關(guān)的限制性位點(diǎn)。附圖2顯示了中間質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV 5, 3,的構(gòu)建。含有 SARS-CoV Urbani林的基因組5'末端678 nt和3'末端973 nt的PCR片 段,其左側(cè)末端側(cè)翼是巨細(xì)胞病毒(CMV)即時早期啟動子,右側(cè)末 端側(cè)翼是poly ( A)尾部和隨后的肝炎厶病毒核酶(Rz)和牛生長激素 (BGH)終止子和多聚腺苷酸序列,克隆到BAC中。為了便于 SARS-CoV復(fù)制子的組裝,含有限制性位點(diǎn)C7"/、 M/w/、尸we/和5"w/// 的單克隆位點(diǎn)克隆到5'末端病毒序列的下游。附圖3顯示了 SARS-CoV衍生的復(fù)制子pBAC-SARS-CoV-REP的 產(chǎn)生。說明了構(gòu)建SARS-CoV復(fù)制子的策略。通過連續(xù)克隆由RT-PCR 產(chǎn)生的亞基因組疊蓋cDNA片段到附圖2的質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV 5, 3,中,組裝SARS-CoV復(fù)制子。在底部顯示了 SARS-CoV復(fù)制子的遺 傳圖譜。說明了克隆步驟中使用的相關(guān)的限制性位點(diǎn)。Repla、 Rep lb 和N代表病毒基因。CMV, CMV即時早期啟動子;TRSN, N基因的 天然TRS; pA, 25個A殘基的尾部;Rz,肝炎A病毒核酶;BGH, 牛生長激素終止子和多聚腺苷酸序列。附圖4顯示了附圖3的SARS-CoV衍生的復(fù)制子的功能分析。在 頂部說明了 SARS-CoV復(fù)制子的遺傳結(jié)構(gòu)。標(biāo)明了 N基因TRS、核心 序列(斜體字字母)和相關(guān)的限制性位點(diǎn)。L,前導(dǎo)序列;UTR,非翻 譯區(qū)。BHK-21和人類293T細(xì)胞用SARS-CoV復(fù)制子(SARS-CoV-REP ) 或非復(fù)制性cDNA克隆(GFP-NR)利用Lipofect細(xì)ne 2000模擬轉(zhuǎn)染 (MOCK )或轉(zhuǎn)染。在24 hpt分離總RNA,用特定寡核苷酸通過RT-PCR分析來檢測基因NmRNA。平行擴(kuò)增的雙份RT-PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖 凝膠中電泳來分辨。附圖5顯示了從SARS-CoV復(fù)制子的SARS-CoV全長cDNA克隆 的構(gòu)建。從克隆在BAC中的SARS-CoV復(fù)制子(參見上文附圖3)開 始,通過在兩個步驟中導(dǎo)入剩余的SARS-CoV序列來組裝全長克隆。 在第 一個步驟中,&//7///-^^/片段插入到包括以下基因的復(fù)制子中 3a的部分、3b、 E、 M、 7a、 7b、 8a、 8b和N的部分。在第二個步驟 中,通過克隆包括Replb的3'末端、基因S和3a的5'末端的Pme/Wam/// 片段到前述質(zhì)粒中,來完成全長cDNA克隆。標(biāo)明了克隆步驟中使用 的相關(guān)的限制性位點(diǎn)。使用以下縮寫CMV,巨細(xì)胞病毒即時早期啟 動子;pA, 25個A殘基的尾部;Rz,肝炎A病毒核酶;BGH,牛生長 激素終止子和多聚腺苷酸序列。附圖6顯示了用于產(chǎn)生編碼SARS-CoV-E-的cDNA的策略。顯示 了核心序列和基因E開放閱讀框。以粗體和斜體顯示了改變初始ATG 到GTG的點(diǎn)突變。在方框中顯示了基因E核心序列(CS,在TRS中 部的高度保守的序列)。以斜體字顯示了導(dǎo)入基因ECS中的兩個點(diǎn)突 變(ACGAAC到ACCAAT )?;駿 ORF內(nèi)刪除的序列是下劃線的。附圖7顯示了在用rSARS-CoV-AE或重組野生型病毒以0.5的moi 感染的Vero E6 ( A ) 、 Huh-7 ( B )和CaCo-2 ( C )細(xì)胞中SARS-CoV 和SARS-CoV-AE病毒產(chǎn)生的動力學(xué)。在感染后的不同時間,通過在 VeroE6細(xì)胞上的斑塊分析來測定病毒滴度。誤差柱代表三個實(shí)驗(yàn)的平 均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。這個附圖顯示了 E衍生物在它的生長方面降低并因 而被減毒。附圖8顯示了 ( A)在感染后24小時在Vero E6細(xì)胞中缺陷的和 親本病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)(上部的正方形);和(B)在感染后72 小時在VeroE6細(xì)胞上標(biāo)明的病毒的斑塊形態(tài)(中間的圓圏);(C) 使用SARS-CoV特異性多價(jià)抗體的標(biāo)明的病毒的免疫焚光顯微(底部 正方形)。附圖的左半邊顯示了使用SARS-CoV野生型的感染,右邊 部分顯示了 SARS-CoV-AE。親本和E-兩種病毒產(chǎn)生了 Vero E6細(xì)胞 中顯著的細(xì)胞病變效應(yīng)(附圖8A)。較早使用全長病毒觀察到效果, SARS-CoV-AE病毒斑塊也小于野生型病毒產(chǎn)生的斑塊(附圖8B)。 重組E-病毒的援救的其他演示是使用SARS-CoV特異性抗體在免疫熒光中對感染的細(xì)胞染色(附圖8C)。附圖9顯示了受感染細(xì)胞的RT-PCR分析。使用在病毒前導(dǎo)序列 中雜交的病毒正向引物和分別在基因S、 E、 M和N的開放閱讀框中雜 交的反向引物進(jìn)行RT-PCR。 M,模擬感染的細(xì)胞;AE, SARS-CoV-△ E; FL, SARS-CoV野生型。附圖IO顯示了在用SARS-CoV (FL)或SARS-CoV-AE ( AE) 感染后在VeroE6細(xì)胞中SARS-CoV蛋白表達(dá)的分析。S, N和E病毒 蛋白;M,模擬感染的細(xì)胞。附圖11顯示了溫度和pH值變化對rSARS-CoV-AE病毒傳染性的 影響。含有重組SARS-CoV和SARS-CoV-厶E病毒的上清液在標(biāo)明的 溫度(附圖11A)或pH (附圖11B)下孵育30分鐘,通過在VeroE6 細(xì)胞上培養(yǎng)物上清液的滴定來評估病毒傳染性。誤差柱代表三個實(shí)驗(yàn) 的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。附圖12顯示了感染后24小時rSARS-CoV-AE感染的Vero E6細(xì) 胞在電子顯微鏡超薄切片處理之后的超結(jié)構(gòu)分析。(A )充滿病毒顆粒 的受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。(B )核殼進(jìn)入腫脹的高爾基體的腔的發(fā)芽位 置。在SARS-CoV-AE感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中致密材料用箭頭表示。 在表現(xiàn)為大的空泡的腫脹高爾基體中發(fā)現(xiàn)的成熟病毒顆粒。表現(xiàn) rSARS-CoV感染的細(xì)胞或rSARS-CoV- △ E感染的細(xì)胞的突變分別在左 側(cè)和右側(cè)顯示。條形,畫面A中2 ium,畫面B和C中200 nm。附圖13顯示了從感染的Vero E6細(xì)胞釋放的rSARS-CoV- △ E病毒 顆粒的形態(tài)。(A ) 顯示細(xì)胞表面內(nèi)層的細(xì)胞外病毒的超薄切片的電 子顯微照片。(B) rSARS-CoV和rSARS-CoV-AE感染的細(xì)胞的上 清液在空氣離心機(jī)中濃縮,在用磷鎢酸鈉負(fù)染色之后通過電子顯微鏡 檢查來分析。左側(cè)的圖片代表rSARS-CoV感染的細(xì)胞,而右側(cè)的代表 rSARS-CoV-AE感染的細(xì)胞。條形,畫面A中200 nm,畫面B中IOO nm。附圖M顯示了在用103 TCIDso的rSARS-CoV或rSARS-CoV-AE接種后在倉鼠中缺陷性病毒的體內(nèi)生長動力學(xué)。肺(A)和鼻甲(B) 中的病毒滴度在Vero E6細(xì)胞單層上測定。非參數(shù)的Mann-Whitney U 統(tǒng)計(jì)方法被用于確定觀察的差異的顯著性。統(tǒng)計(jì)顯著性由*( p值<0.05 ) 表明。點(diǎn)線表明檢測的下限。附圖15顯示了用103 TCID50的rSARS-CoV或rSARS-CoV- △ E接 種之后在倉鼠中rSARS-CoV-AE的病理。(A)感染后2天的肺的免 疫組織學(xué)染色的切片。(B)感染后2天的肺的蘇木色素&伊紅染色 的切片。(C)感染后5天的肺的免疫組織學(xué)染色的切片。(D)感染 后5天的肺的蘇木色素&伊紅染色的切片。左側(cè)圖片代表rSARS-CoV 感染的肺,而右側(cè)圖片代表rSARS-CoV-厶E感染的肺。條形,所有畫 面中100 nm。附圖16顯示了被導(dǎo)入以消除9b基因的表達(dá)的突變。顯示了基因 9bORF的前96個核苷酸。三個ATG密碼子突變成ACG,以粗體字符 顯示。以粗體和斜體字顯示了突變的C。引入的終止密碼子TAA以粗體顯示。附圖17顯示了被導(dǎo)入以消除3b基因的表達(dá)的突變。顯示了基因 3b ORF的前75個核苷酸。同相地突變成ACG的三個密碼子ATG以 粗體顯示,突變的C以粗體和斜體顯示。通過改變密碼子TCA到TAA 引入的終止密碼子以粗體顯示。附圖18到26顯示了全長SARS-CoVUrbanis菌抹的序列和其選擇 的基因的序列。以下實(shí)施例說明、但不限制本發(fā)明的實(shí)施方式。實(shí)施例使用以下的細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒和細(xì)菌菌抹細(xì)胞。非洲綠猴腎臟衍生的Vero E6細(xì)胞由Eric Snijder ( Medical Center, University of Leiden, The Netherlands )好意地提供。人類結(jié)腸癌 衍生的CaCo-2細(xì)胞從歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所獲得。人類肝臟衍生的 Huh-7細(xì)月包由R. Bartenschlager ( Dept. of Molecular Virology, University of Heidelberg, Germany)好意地提供,Gillim-Ross et al., 2003; Hatte隠nnetal.,2005; Mossel et al., 2005中提及。嬰兒倉鼠腎臟細(xì)胞 (BHK-21 )和人類293T細(xì)胞購自美國細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ATCC )。 所有細(xì)胞在37。C在C02孵化器中維持在補(bǔ)充有25mM HEPES和10% 胎兒牛血清和抗生素的DMEM中。病毒。Urbani抹的基因組RNA在材料轉(zhuǎn)移協(xié)議的簽署之后從美國 喬治亞州亞特蘭大的疾病控制和預(yù)防(CDC)中心獲得。質(zhì)粒和細(xì)菌菌林。質(zhì)粒pBeloBACll (Wang et al., 1997)由H. Shizuya和M. Simon ( California Institute of Technology, Pasadena, Ca ) 好意地提供。Escherichia coli DH10B菌抹從GIBCO/BRL獲得。通過根 據(jù)廠家的說明書在25|aF、 2.5 kV和200 Q使用Gene Pulser單元 (Bio-Rad)電穿孔來轉(zhuǎn)化DH10B細(xì)胞。根據(jù)廠家的說明使用Qiagen (Chats worth, CA ) Large Construct Kit分離質(zhì)粒DNA。實(shí)施例1SARS-CoV復(fù)制子cDNA的構(gòu)建含有Urbani基因組的非翻譯5'和3'末端以及復(fù)制酶和N基因的 cDNA ^皮克隆作為BAC處在CMV啟動子的控制下。另外,含有獨(dú)特的限制性位點(diǎn)尸ac/、 Ac/和Saw/7/的多克隆位點(diǎn) 被克隆到復(fù)制酶基因的下游以允許異源基因的克隆(附圖3)。這種方 法使用兩步擴(kuò)增系統(tǒng),其聯(lián)結(jié)了核中從CMV啟動子的復(fù)制子RNA轉(zhuǎn) 錄與細(xì)胞質(zhì)中由病毒聚合酶驅(qū)動的第二擴(kuò)增步驟。如通過限制性內(nèi)切 酶分析所測定的,在DH10B細(xì)胞中的增殖期間,編碼SARS-CoV復(fù)制 子的質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV-REP至少180代是穩(wěn)定的。在第一步中,鑒定了可以用于工程化SARS-CoV的復(fù)制子和全長 cDNA克隆的病毒基因組中合適的限制性位點(diǎn)(附圖1)。在第二步中,產(chǎn)生中間質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV 5, 3'作為構(gòu)建 SARS-CoV復(fù)制子以及全長cDNA構(gòu)建體的基礎(chǔ)(附圖2 )。這個質(zhì)粒 含有處在巨細(xì)胞病毒(CMV)即時早期啟動子的控制下的Urbani抹基 因組的5'末端的前678 nt,和基因組的后973 nt,隨后是25-bp合成的 poly (A)、肝炎A病毒核酶、和牛生長激素終止子和多聚腺苷酸序列 以產(chǎn)生精確的3'末端。另外,含有第一步驟中選擇的限制性位點(diǎn)C/"/、 A//w/、尸we/和8"/w///的多克隆位點(diǎn)被克隆到SARS-CoV序列之間以容 許SARS-CoV復(fù)制子的組裝。在第三個步驟中,通過RT-PCR產(chǎn)生疊蓋SARS-CoV cDNA亞克 隆,使用選擇的限制性位點(diǎn)組裝復(fù)制子。使用pBAC-SARS-CoV5, 3, 作為起始點(diǎn),根據(jù)附圖3中描述的策略工程化SARS-CoV復(fù)制子。質(zhì) 粒pBAC-SARS-CoV-REP含有Urbani基因組的非翻譯5'和3,末端、 復(fù)制酶基因,隨后是含有獨(dú)特限制性位點(diǎn)Pw/、和j5"w///的多克隆位點(diǎn),以容許異源基因的克隆和表達(dá),以及處在其天然TRS的控制 下的核蛋白(N)基因。實(shí)施例2 克隆的dDNA穩(wěn)定性的分析 通過研究不同傳代下的限制性內(nèi)切酶圖型,分析克隆到 pBeloBACll中的病毒序列的穩(wěn)定性。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在37°C 在含有12.5 pg/ml氯霉素的10 ml LB中生長。來自這些原代培養(yǎng)物 (考慮傳代0)的細(xì)胞通過每天稀釋106倍來連續(xù)增殖。每個傳代被認(rèn) 為代表約20代。實(shí)施例3 序列分析使用熒光染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸和溫度抗性DNA聚合酶 (Perkin Elmer)利用自動373 DNA測序儀(Applied Biosystem )來對DNA測序。實(shí)施例4 SARS-CoV復(fù)制子cDNA的轉(zhuǎn)染 BHK-21和293T細(xì)胞在35 mm直徑平板上生長到95%匯合,并根 據(jù)廠家說明書使用6 jug Lipofectamine 2000 ( Invitrogen),用5 m gSARS-CoV復(fù)制子轉(zhuǎn)染。實(shí)施例5 RNA分離和RT-PCR分析 在轉(zhuǎn)染后24h ( hpt)用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen )提取總細(xì)胞 內(nèi)RNA,用作基因NmRNA轉(zhuǎn)錄的RT-PCR分析的模板。用Moloney 鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Ambion)和與基因N的核苷酸510到531互 補(bǔ) 的 反 義 引 物 URB-28630RS ( 5 ' -TGCTTCCCTCTGCGTAGAAGCC-3' ) ( SEQ ID NO: 7)進(jìn)行RT 反應(yīng)。使用反向引物URB-28630RS和;凈越Urbani前導(dǎo)序列的核苷酸 29 到 50 的正向引物 URB-29VS ( 5 ,-GCCAACCAACCTCGATCTCTTG-3' ) ( SEQ ID NO: 8 )來擴(kuò)增產(chǎn) 生的cDNA。對于通過基因N mRNA的實(shí)時RT-PCR的定量分析,使 用 Primer Express軟件(Applied Biosystems )設(shè)計(jì)用于 RT (URB-28163RS, 5' -TGGGTCCACCAAATGTAATGC-3' ( SEQ ID NO: 9),與基因N的核普酸43到63互補(bǔ))和PCR (反向引物 URB-28163RS 和 正 向 引 物 URB-27VS, 5 , -AAGCCAACCAACCTCGATCTC-3, ( SEQ ID NO: 10 ),跨越Urbani 前導(dǎo)序列的核苷酸27到47)的引物。根據(jù)廠家的說明(Applied Biosystems )將SYBR Green PCR主混合物用于PCR步驟中。實(shí)施例6 SARS-CoV衍生的復(fù)制子的分析SARS-CoV衍生的復(fù)制子在幾個細(xì)胞系中是功能性的?;騈 mRNA的表達(dá)被用于通過RT-PCR分析研究復(fù)制子活性。用SARS-CoV 復(fù)制子或非復(fù)制型cDNA克隆使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染BHK-21和 人類293T細(xì)胞。在24 hpt提取總細(xì)胞內(nèi)RNA,用作使用特定寡核苷 酸的基因N mRNA轉(zhuǎn)錄RT-PCR分析的模板。在用SARS-CoV復(fù)制子 轉(zhuǎn)染的BHK-21和293T細(xì)胞中都檢測到高水平的基因NmRNA,顯示 了復(fù)制子在這些細(xì)胞系中是活性的。在轉(zhuǎn)染的293T和BHK-21細(xì)胞中 基因N mRNA的定量分析使用實(shí)施例5中描述的引物通過實(shí)時 RT-PCR進(jìn)行。在293T細(xì)胞中SARS-CoV復(fù)制子活性是在BHK-21細(xì) 胞中的8倍高。這種活性提高可以通過在人類293T細(xì)胞中SARS-CoV 復(fù)制子的更高復(fù)制水平來解釋,或僅僅由于293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率兩倍 高于BHK-2細(xì)胞的。分析了 N蛋白在SARS-CoV復(fù)制子活性中的作用。為了實(shí)現(xiàn)這個 目標(biāo),構(gòu)建缺少N基因的SARS-CoV復(fù)制子,與表達(dá)N基因的復(fù)制子 比較復(fù)制子活性。檢測缺少N基因的復(fù)制子的基礎(chǔ)活性,但當(dāng)存在N 蛋白時,復(fù)制子活性提高超過100倍。這些數(shù)據(jù)表明,N蛋白起到了 冠狀病毒復(fù)制子活性的增強(qiáng)子的重要作用。含有質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV-REP的細(xì)菌于2004年9月1日保藏在 Colecci6n Espafiola de Cultivos ( Tipo, CECT in Valencia, Spain ), 所述 質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV-REP包含編碼SARS-CoV復(fù)制酶和SARS-CoVN蛋白的復(fù)制感受態(tài)的、非傳染性的SARS-CoV基因組。保藏物被給 予了臨時登記號碼7020。實(shí)施例7 制備全長克隆根據(jù)附圖5中列出的克隆策略來制備SARS-CoV全長cDNA克隆 (pBAC-SARS-CoVFL )。從克隆到BAC中的SARS-CoV復(fù)制子開始(上述附圖3;和實(shí)施 例1到6),通過在兩個步驟中添加其余基因來組裝全長克隆。在第一 個步驟中,包括以下基因的^w ///-A^e/片段被插入到含有復(fù)制子的 BAC中3a的一部分、3b、 E、 M、 7a、 7b、 8a、 8b和N的一部分。 在第二個步驟中,通過克隆包括Rep lb的3'末端、基因S和3a的5' 末端的/^e/-5"w///片段到前述質(zhì)粒中,來完成全長cDNA克隆。通過獲自亞特蘭大的疾病控制中心的RNA片段的RT-PCR克隆, 獲得這兩個片段的cDNA。該RNA相應(yīng)于SARS-CoV的Urbani林的基 因組序列??寺〔襟E中使用的基因和相關(guān)的限制性位點(diǎn)在附圖5中示出。產(chǎn) 生的全長cDNA克隆的功能分析顯示,當(dāng)在E.coli中增殖時該克隆是完全穩(wěn)定的。在Vero細(xì)胞的轉(zhuǎn)染之后,從cDNA克隆回收傳染性的病毒,就噬 菌斑形態(tài)學(xué)、生長動力學(xué)以及mRNA和蛋白圖譜來說,發(fā)現(xiàn)與親本病 毒是相同的。實(shí)施例8制備含有除了編碼結(jié)構(gòu)蛋白蛋白E的基因以外的所有 SARS-CoV基因的減毒病毒 蛋白E被認(rèn)為是冠狀病毒必需的。為了消除基因E表達(dá),將三種 不同的修飾導(dǎo)入實(shí)施例7的SARS-CoV全長cDNA克隆中,來獲得作 為BAC的編碼SARS-CoV的cDNA,其中E基因被刪除(SARS-CoV-△ E)。(a) 已經(jīng)在基因E核心序列(CS)(圖6)中引入了兩個點(diǎn) 突變。這個部分是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的序列(TRS)的中心,突變的引入將阻止基因E的表達(dá)。原始的TRS序歹'J ACGAAC被ACCAAT替代。(b) 在E基因開放閱讀框的起始密碼子中引入了點(diǎn)突變。起始 密碼子ATG變?yōu)镚TG。(c) 引入了 ORF基因E內(nèi)的142個核苷酸刪除。通過在E基因的編碼序列的起始密碼子內(nèi)引入點(diǎn)突變,取消了 E 蛋白的表達(dá)。引入的突變對于部分地與E基因重疊的基因3b是沉默的。 此外,為了避免重組病毒的基因回復(fù)的可能性,刪除覆蓋大部分E基 因的142nt。為了維持M基因的野生型轉(zhuǎn)錄水平,不改變E基因的3' 末端的M基因的公開的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(TRS )的上游48 nt( Thiel et al., 2003 )。使用含有 SARS-CoV全長cDNA的實(shí)施例 7的質(zhì)粒 pBAC-SARS-CoVFL,通過重疊延伸PCR引入E基因刪除。寡核苷酸SARS-16501-VS ( 5'-GGCTCATGTGGTTTATCATTAGTATTGTACAAATGGCACC-3,)和SARS-16973-AE-RS(5' -CCTTCAGAAGAGTTCAGATTTTTAACACGCTTAACGTACCTGTTT-CTTCCGAAACGAATGAGTACACAATGGTACTCACTTTCTTGTGCTTAC-3 ')被用于從SARS-CoV基因組的nt 25170和26326產(chǎn)生PCR產(chǎn)物,所述 SARS-16973-AE-RS包括SARS-CoV基因組的核苷酸(nt) 26153和 26295之間的刪除、E基因的核心序列(CS)中的兩個點(diǎn)突變和取消這 個基因的起始ATG密碼子的一個點(diǎn)突變。寡核苷酸SARS-16943-VS( 5'-GCGTGTTAAAAATCTGAACCTCTGAA-GG-3' ) 和 SARS-N733-RS (5'-GGCCTTGTTGTTGTTGGCC-3')被用于產(chǎn)生跨越SARS-CoV基因組的nt26296到28852的PCR產(chǎn)物。兩個疊蓋產(chǎn)物都被用作使用引物 SARS-16501-VS和SARS-N733-RS的PCR擴(kuò)增的模板。用酶^m2/// 和M e/消化最終的PCR產(chǎn)物,克隆到中間質(zhì)粒pBAC-SARS-5, -3, -DN中來產(chǎn)生質(zhì)粒pBAC-SARS需5, -3,醫(yī)DN-AE。質(zhì)粒pBAC-SARS-5, -3, -DN和pBAC-SARS-5, -3, -DN-△ E都含有巨細(xì)胞病毒(CMV ) 啟動子之下的SARS-CoV基因組的前7452 nt,和最后的3683 nt,隨后 是25-bp合成的poly A、肝炎A病毒核酶(Rz )和牛生長激素(BGH ) 終止子和多聚腺苷酸序列以產(chǎn)生精確的3,末端。最后,含有SARS-CoV 全長cDNA的pBAC-SARS-CoVFL的片段,相應(yīng)于nt 26045 到29783,通過質(zhì)粒pBAC-SARS-5, -3, -DN-△ E的片段來交換,以產(chǎn)生缺少E基因的質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV-AE。為了援救工程化的病毒,在12.5 crr^燒瓶中生長到90%匯合的Vero E6細(xì)胞使用12 m g Lipofectamine 2000 (Invitrogen )根據(jù)廠家的i兌明書 用6 Mg質(zhì)粒pBAC-SARS-CoV-AE或用親本質(zhì)粒pBAC-SARS-CoVFL 作為對照來轉(zhuǎn)染。在37。C 6h的溫育期之后,替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,在37 。C孵育72小時。收獲細(xì)胞上清液,在新鮮的VeroE6細(xì)胞上傳代兩次, 乂人兩種質(zhì)#立收獲的增殖感受態(tài)病毒(propagation-competent viruses ) (rSARS-CoV-AE和重組野生型rSARS-CoV )通過三輪的斑塊純化來 克隆。援救了AE病毒,表明基因E不是病毒周期所必需的。缺陷性 病毒rSARS-CoV-AE的滴度是親本病毒(重組野生型rSARS-CoV )的 滴度20到50分之一。病毒滴度是親本病毒約5 x 107 pfu/ml和缺陷性 病毒3 x io6 pfu/ml,如Vero E6細(xì)胞上的斑塊分析中測定的(附圖7A )。 兩種病毒,親本(SARS-CoV )和E- ( SARS-CoV- △ E )在Vero E6 細(xì)胞中產(chǎn)生了顯著的細(xì)胞病變效應(yīng)(附圖8A),然而對于親本病毒, 這種效果比E-病毒更早觀察到。SARS-CoV-AE病毒斑塊(plaques) 小于野生型病毒產(chǎn)生的斑塊(附圖8B)。重組E—病毒的援救的其他證 明是使用SARS-CoV特異性抗體在免疫熒光中對感染的細(xì)胞染色(附 圖8C)。實(shí)施例9pBAC-SARS-CoV- △ E的RNA分離和RT-PCR分析 來自VeroE6感染的細(xì)胞的總RNA根據(jù)廠家的說明書使用Qmgen RNeasy試劑盒提取,用于S、 E和N基因mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RT-PCR 分析。使用莫洛尼氏白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Ambion)和與S基因的nt 594 到613互補(bǔ)的反義引物SARS-S613-RS ( 5'-ctactataggttgatagccc-3'); 與E 基因的nt 208到231互補(bǔ)的 SARS-E231-(5' - TTAGACCAGAAGATCAGGAACTCC-3')和與N基因的nt 5 1 1到532互#卜的URB-28630-RS ( 5'習(xí)tgcttccctctgcgtagaagcc-3')在42。C進(jìn)行反應(yīng)lh。 使用跨越SARS-CoV前導(dǎo)序列的核普酸29到50的病毒有義引物URB-29-VS ( s'- gccaaccaacctcgatctcttg-3')和對RT反應(yīng)所描述的反向引物通過PCR擴(kuò)增cDNA。 RT-PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中通過電泳來分辨。E—病毒的身份通過使用RT-PCR分析來分析病毒sg mRNAs的合成 來確認(rèn)(附圖9)。如預(yù)計(jì)的,來自E基因sgmRNA的250 bpPCR產(chǎn) 物在rSARS-CoV-AE感染的細(xì)胞中沒有檢測到。結(jié)果顯示,雖然基因 EmRNA由親本病毒產(chǎn)生,這種mRNA在E-病毒中沒有觀察到。此外, 鑒定了在rSARS-CoV-AE病毒的情況下1050 bp的PCR產(chǎn)物以及在重 組野生型病毒的情況下的1200 bp產(chǎn)物。這些PCR產(chǎn)物的序列匹配在 基因3的TRS開始的sg mRNA的序列,確認(rèn)了 rSARS-CoV-AE病毒 維持了被導(dǎo)入以防止E基因表達(dá)的突變和刪除。相比之下,來自編碼S 和N蛋白的mRNA的PCR產(chǎn)物中沒有^f企測到差異。實(shí)施例10 Western印跡分析通過使用E特異性抗體的Western印跡分析,與在用親本病毒感 染的細(xì)胞中E蛋白的存在相對比,由E基因表達(dá)的破壞引起的E蛋白 產(chǎn)生的缺乏,在用E-病毒感染的細(xì)胞中進(jìn)一步顯示。通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析細(xì) 胞溶胞產(chǎn)物。在含有20%甲醇的25mMTris-192mM甘氨酸緩沖液pH 8.3中,使用Bio-Rad mini protean II電印跡設(shè)備在150 mA 2h,將蛋白 轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。使用TBS (20mMTris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl)中的5%脫脂奶粉封閉膜1 h,用特異于N、 S (Imgenex; 1:500 稀釋)和E蛋白(由Shen Shuo, Institute of Molecular and Cellular Biology, Singapore好意地提供,1:2000稀釋)的多克隆抗體孵育。使用辣根過 氧化酶結(jié)合的山羊抗兔抗體(Cappel)和ECL檢測系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech )檢測結(jié)合的抗體。用rSARS-CoV-AE病毒感染的Vero E6細(xì)胞的蛋白提取物含有S 和N蛋白,但沒有E蛋白。使用針對S和N蛋白的抗體的western分 析分別揭示了 170 kDa條帶和大約46 kDa的雙帶。相比之下,使用特 異性E蛋白抗體的Western印跡分析未能檢測到大約10 kDa的條帶, 相應(yīng)于rSARS-CoV感染的Vero E6細(xì)胞提取物的Western印跡分析中 觀察到的E蛋白(附圖10)。30實(shí)施例11rSARS-CoV- △ E的生長動力學(xué)Vero E6、 Huh-7和CaCo-2細(xì)胞的亞匯合單層(90%匯合)以0.5 的感染復(fù)數(shù)(moi)用病毒rSARS-CoV-AE和rSARS-CoV感染。在感 染后不同時間收集培養(yǎng)物上清液,使用密閉燒瓶或密封平板根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 方法測定病毒滴度。rSARS-CoV-AE和重組野生型病毒在Vero E6細(xì)胞中的生長動力 學(xué)顯示了相似的分布(附圖7A)。在感染后24h檢測Vero E6細(xì)胞中 的細(xì)胞病變效應(yīng)。相比之下,在Huh-7和CaCo-2細(xì)胞中,沒有檢測到 細(xì)胞病變效應(yīng),即使在感染后72h。在VeroE6感染的細(xì)胞中,在感染 后24-48h達(dá)到最大病毒滴度(重組野生型病毒的峰值滴度是-8x 106 pfu/ml) 。 rSARS-CoV-AE病毒的滴度是重組野生型病毒的~ 20分之 —。在Huh-7細(xì)胞中,感染后48小時達(dá)到最大滴度(對于重組野生型 病毒-5x l05pfu/ml)(附圖7B),而在CaCo-2細(xì)胞中,感染后~ 72 小時達(dá)到最大滴度(對于重組野生型病毒~4>< l05pfu/ml)。在Huh-7 和CaCo-2細(xì)胞系中,rSARS-CoV-厶E病毒生長到重組野生型病毒~ 200分之一的滴度。這些數(shù)據(jù)表明,E蛋白對于SARS-CoV生長有重要 作用,它對于細(xì)胞培養(yǎng)物中的SARS-CoV復(fù)制不是關(guān)鍵的。在紹(mink) 肺細(xì)胞系MvlLu中確認(rèn)了相同結(jié)果。實(shí)施例12 間接免疫熒光顯微鏡檢查 在9 cm2載玻片燒瓶中生長的亞匯合Vero E6細(xì)胞以1的moi (感 染復(fù)數(shù))感染。在24 hpi (感染后小時數(shù)),細(xì)胞在冰冷的PBS中洗 涂,在室溫下用8%多聚甲醛固定30分鐘。細(xì)胞然后用0.2%皂角苷在 封閉溶液(磷酸鹽緩沖鹽水[PBS], pH 7.4,含有10。/。胎兒牛血清[FBS]) 中在室溫下預(yù)滲透lh,在室溫下與Anlong Xu ( Zhongshan Uninersity, Guangzhou, China)好意地提供的多克隆SARS-CoV特異性抗體孵育 90分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞三次,與在封閉溶液中1:200稀釋的Cy5 結(jié)合的抗人免疫球蛋白G (Jackson Immunoresearch)在室溫下孵育30 分鐘,并用PBS洗滌五次。移除載玻片,裝上玻璃蓋玻片,用Zeiss Axiophot熒光顯微鏡分析。在兩種情況下,免疫焚光的圖形對于兩種病毒是類似的,細(xì)胞膜 和細(xì)胞質(zhì)嚢泡被顯著地染色(附圖8C)。實(shí)施例13 rSARS-CoV-厶E的穩(wěn)定性為了分析E蛋白是否影響SARS-CoV的穩(wěn)定性,分析了溫度和pH 值對于病毒傳染性的影響(附圖11)。為此,在從4。C到80'C的溫度 范圍內(nèi)孵育重組野生型病毒和rSARS-CoV-AE病毒30分鐘。兩種病 毒都顯示了相似的鈍化分布型,在6(TC下脬育后103倍的降低。80°C 或更高溫度的熱度引起殘余的病毒感染性(附圖11A)。重組野生型病毒和rSARS-CoV-AE病毒在不同的pH值孵育30分 鐘顯示了兩種病毒從pH 5到9都是穩(wěn)定的(附圖11B)。這些結(jié)果表 明,在測試的不同溫度和pH值下,E蛋白對于病毒顆粒的穩(wěn)定性有4艮 少的影響。實(shí)施例14 電子顯微鏡檢查E蛋白已經(jīng)與病毒形態(tài)發(fā)生相聯(lián)系(Fischer et al., 1998; Kuo and Masters, 2003 )。因此,通過電子顯微鏡檢查研究了 rSARS-CoV和 rSARS-CoV-AE病毒的組裝(附圖12)。對于常^L的電子顯微鏡4企查,以1的moi用rSARS-CoV和 rSARS-CoV- △ E病毒感染Vero E6細(xì)胞單層。用磷酸鹽Na/K緩沖液(pH 7.4)中的2%戊二醛在20 hpi原位固定細(xì)胞在室溫下lh。在固定液中 從平皿上移除細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到eppendorf管中。在離心之后,在磷酸鹽 Na/K緩沖液(pH 7.4 )中洗滌細(xì)胞三次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟處理包膜入Epoxy, TAAB 812樹脂(TAAB Laboratories, Berkshire, England )中。在4。C使 用蒸餾水中的1%四氧化鋨和0.8%鐵氰化鉀的混合物進(jìn)行細(xì)胞的后固 定lh。在用蒸餾水洗滌五次之后,用水中的2%醋酸鈾孵育樣品lh, 洗滌三次,在室溫下用提高濃度的丙酮(50、 70、 90和100%)脫水兩 次各10分鐘。在提高濃度的丙酮/環(huán)氧樹脂(3:1、 1:1、 1:3和100%環(huán) 氧樹脂)中進(jìn)行樹脂的浸潤。浸潤的樣品的聚合化在2天期間在60°C 進(jìn)行。用飽和的醋酸鈾和檸檬酸鉛染色樣品的超薄切片,在JeolJEM-1010 ( Tokyo, Japan )電子顯微鏡中在80 kV檢查。對于負(fù)染色電子顯微鏡檢查,感染20h的Vero E6細(xì)胞的上清液用 10%甲醛固定,使用Electron Microscopy Rotor ( EM-90, Beckman)以 21 psi在Beckman airfuge中濃縮物到碳包被的電離銅網(wǎng)上。篩網(wǎng)用2% 磷鴒酸pH 7染色1分鐘。在Jeol JEM-1010 (Tokyo, Japan)電子顯微 鏡中檢查樣品。在使用rSARS-CoV-AE感染的細(xì)胞中,細(xì)胞質(zhì)中存在的細(xì)胞內(nèi)成 熟病毒的數(shù)量低于用重組野生型病毒感染的細(xì)胞中的數(shù)量(附圖12A)。 這種觀察與缺陷性病毒的更低的病毒滴度一致。冠狀病毒通過出芽到 高爾基復(fù)合體的腔中來組裝(Ng et al., 2003 )。因而,分析了高爾基 復(fù)合體的腔內(nèi)核殼內(nèi)陷的位置。在rSARS-CoV-AE的情況下,在這些 位置上成熟病毒的數(shù)目低于重組野生型病毒感染的細(xì)胞中的,在 rSARS-CoV- △ E病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到致密材料的增加, 可能相應(yīng)于異常的病毒顆粒(附圖12B)。在泡嚢中作為單個顆粒(數(shù) 據(jù)未顯示)或作為擴(kuò)大的泡囊中病毒的群組見到病毒顆粒(附圖12C)。 在這種情況下,在rSARS-CoV感染的細(xì)胞中成熟病毒的數(shù)量顯著地高 于rSARS-CoV-AE感染的細(xì)胞中的。此外,在rSARS-CoV-AE感染 的細(xì)胞中觀察到的泡嚢含有散布在病毒顆粒之間的致密的、粒狀材料, 其可能相應(yīng)于取消的病毒組裝過程??偟恼f來,這些數(shù)據(jù)表明,E蛋白 在病毒運(yùn)輸和組裝中具有重要作用。通過感染細(xì)胞的超薄切片以及濃縮的負(fù)染色病毒的電子顯微鏡評 估,研究了 E蛋白刪除對SARS-CoV病毒顆粒形態(tài)的潛在影響。對于負(fù)染色電子顯微鏡檢查,感染20h的Vero E6細(xì)胞的上清液用 10%甲醛固定,使用Electron Microscopy Rotor (EM-90, Beckman)以 21psi在Beckman airfuge中濃縮物到碳包被的電離銅網(wǎng)上。篩網(wǎng)用2% 磷鴒酸pH 7染色1分鐘。在Jeol JEM-1010 ( Tokyo, Japan )電子顯微 鏡中在80kV檢查樣品(附圖13)。通過電子顯微鏡檢查在超薄切片中觀察到的細(xì)胞外的病毒顆粒形 態(tài)對于rSARS-CoV-AE和重組野生型病毒是類似的,沒有見到異常結(jié) 構(gòu)(附圖13A)。純化的重組野生型病毒和rSARS-CoV-AE病毒的負(fù)染色顯示了由 棒狀突出物圍繞的顆粒,表明E蛋白表達(dá)表面上對病毒顆粒形態(tài)具有很小的影響(附圖13B)。盡管如此,與野生型病毒相比,純化的 rSARS-CoV-AE病毒顯示了高頻率的病毒聚集和無定形結(jié)構(gòu),表明缺 陷性病毒對機(jī)械剪切力更敏感。實(shí)施例15 倉鼠中的病毒復(fù)制通過感染Golden Syran倉鼠來測定rSARS-CoV和rSARS-CoV-厶 E病毒的體內(nèi)生長(Roberts et al, 2005 )。這個實(shí)施例中采用的動物方案由過敏和傳染疾病國家協(xié)會動物照 料和使用委員會批準(zhǔn)。雄性Golden Syrian倉鼠LVG ( SYR )從Charles River Laboratories ( Wilmington, MA )獲得,在單獨(dú)的通風(fēng)的微隔離嚙 齒動物籠中配對居住。在開始以下實(shí)驗(yàn)前倉鼠休息至少3天。Golden Syrian倉鼠(44天齡)通過異氟烷(USP誦Baxter Healthcare, Deerfield, IL )吸入來輕輕地麻痹,用100 Ml總體積中的103 TCID50 的rSARS-CoV或rSARS-CoV-AE鼻內(nèi)地接種。病毒接種后兩天、五 天和八天處死倉鼠(4只倉鼠/組/天),獲取肺和鼻甲,并冷凍保存。 對于病毒滴度測定,解凍組織樣品,稱重,勻化成具有慶大霉素 (Invitrogen )和兩性霉素B ( Quality Biological, Gaithersburg, MD )的 Leibovitz, s L-l 5培養(yǎng)基(Invitrogen, Grand Island, NY)中的最終10。/t) (w/v)懸浮液,其分別以O(shè).l mg/L和5 mg/L的終濃度添加到組織培 養(yǎng)基中。通過低速離心來澄清組織勻漿,如早先Subbarao et al., 2004 描述的在24和96孔板中在Vero細(xì)胞單層中測定病毒滴度。病毒滴度 表示為組織的TCIDWg,檢測下限是1015 TCID5。/g。測定了三個噬斑 形成單位(pfu)相當(dāng)于一個TCID50。用rSARS-CoV- △ E病毒感染的倉鼠的鼻甲和肺中病毒滴度是重組 野生型病毒的100和1000分之一,表明rSARS-CoV-AE病毒在這個 物種中的生長是減毒的(附圖14)。在感染后八天,在用重組野生型 病毒感染的動物的肺和鼻曱中檢測到傳染性的病毒,而在這個時點(diǎn)缺 陷性病毒已經(jīng)被清除(附圖14)。實(shí)施例16 倉鼠的肺的病理組織學(xué)檢查在Golden Syrian倉鼠中比較與重組野生型病毒和rSARS-CoV- △ E 病毒的復(fù)制相關(guān)的肺部病理(附圖15)。異氟烷麻痹的Golden Syrian倉鼠(40天齡)用100 m 1總體積的 103 TCID50 rSARS-CoV ( —只倉鼠/天)或rSARS-CoV- △ E (兩只倉鼠/ 天)鼻內(nèi)地接種。感染后兩天(附圖15A和15B)和五天(附圖15C 和15D)處死倉鼠,肺充氣并保存在10%福爾馬林中并處理用于組織 病理學(xué)檢查(附圖15A和15C)和免疫組織化學(xué)(附圖15B和15D)。 肺在10%中性緩沖的福爾馬林中固定三天,常規(guī)處理,隨后石蠟包埋。 使用蘇木素伊紅染色的切片組織病理學(xué)地研究肺。與病毒滴度(參見上文實(shí)施例15) —致,免疫組織學(xué)分析揭示了 在rSARS-CoV感染的動物的肺中比rSARS-CoV-AE感染的動物中更 高的抗原濃度。與用rSARS-CoV-AE病毒感染的相比,用重組野生型 病毒感染的動物顯示了更多的肺部疾病(更多的細(xì)支氣管炎和間隙性 肺炎)(附圖15)。這表明,在倉鼠模型中在生長和伴隨的病理方面, rSARS-CoV-AE病毒是減毒的。實(shí)施例17制備缺少 一 個或多個結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)基因的減毒病毒 制備以下的進(jìn)一步的突變體缺少SARS-CoV的全部非結(jié)構(gòu)基因(基因3b、 6、 7a、 7b、 8a和8b)的病毒。缺少全部非結(jié)構(gòu)基因(基因3b、 6、 7a、 7b、 8a和a)和一個結(jié)構(gòu) 基因(基因E)的病毒。缺少全部非結(jié)構(gòu)基因(基因3b、 6、 7a、 7b、 8a、 8b)和結(jié)構(gòu)基因 3a的病毒。缺少全部非結(jié)構(gòu)基因(基因3b、 6、 7a、 7b、 8a、 8b)和兩個結(jié)構(gòu) 基因3a和E的病毒。缺少結(jié)構(gòu)基因(E、 3a,或兩者,和非結(jié)構(gòu)基因6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b的任意組合,例如分別缺少基因6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b的 病毒,以及缺少基因6、 7a、 7b、 8a、 8b、 9b和E的組合)的病毒?;?b刪除。為了消除基因9b的表達(dá)(a) 在這個基因的起始密碼子中引入點(diǎn)突變。(b) 親本病毒中存在的ATG突變成ACG以防止相應(yīng)蛋白的表達(dá)。(c) 在這個突變的ACG后引入終止密碼子,ORF內(nèi)的另兩個同 相的ATG被改變(參見附圖16)。基因9b與基因N完全重疊;因而所有引入了 N基因的突變對于N 基因的序列是沉默的(即,不引起氨基酸改變)?;?b刪除為了消除基因3b的表達(dá),使用以下策略(附圖17): 在這個基因的起始密碼子中引入點(diǎn)突變。親本SARS-CoV中存在的起始密碼子ATG突變成ACG。在基因中同相地存在的第二和第三個ATG用ACG替代。設(shè)計(jì)所有這些突變來引入基因3a和E中的沉默改變,其與基因3b重疊?;?a和3b的同時刪除。為取消基因3a和3b的表達(dá),我們采用了三種策略來工程化編碼 具有無功能的基因3a和3b的SARS-CoV的cDNA (附圖17):(a) 在控制基因3 mRNA表達(dá)的TRS中存在的核心序列通過 改變序列ACGAAC成ACCAAT來鈍化。(b) 這些基因的部分通過在SARS-CoV序列的核苷酸25274 和26015之間引入刪除來部分地刪除。(c) 基因3a的起始密碼子ATG由ACG替代。此外,在靠近 第一個的地方引入終止密碼子。參考書目AlmazSn, F., J. 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      權(quán)利要求
      1.編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸,當(dāng)與相同細(xì)胞培養(yǎng)物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時,所述減毒的SARS-CoV病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的最大病毒滴度降低至少2的因數(shù)。
      2. 編碼SARS-CoV病毒的核酸,其中所述核酸可通過包括步驟 的方法獲得,其中通過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列來修 飾所迷SARS-CoV病毒的基因組,從而所迷核酸不能表達(dá)功能性的E蛋白。
      3. 編碼SARS-CoV病毒的核酸,其中所述核酸不編碼 SARS-CoV病毒的功能性蛋白E的序列。
      4. 編碼SARS-CoV病毒的核酸,其中所述核酸包含編碼病毒蛋 白復(fù)制酶、S、 M和N的序列,并進(jìn)一步包含或不包含編碼蛋白3a的序列。
      5. 根據(jù)權(quán)利要求4的核酸,其中所述核酸不包含編碼病毒蛋白 E、 6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b的序列。
      6. 編碼SARS-CoV病毒的核酸,其中所述核酸包含病毒蛋白復(fù) 制酶、S、 M、 N和E的序列,并進(jìn)一步包含或不包含編碼蛋白3a的序列。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求6的核酸,其中所述核酸不包含編碼病毒蛋白 6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b的序列。
      8. 根據(jù)權(quán)利要求2到7的任一項(xiàng)的核酸,其中所述病毒在體內(nèi) 是減毒的,并且在體外可以是減毒的。
      9. 根椐權(quán)利要求1到8之一的核酸,其中(a) 編碼復(fù)制酶的核酸序列是SEQIDNO: 1和2,或與SEQID NO: 1和2的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源 性的序列;和/或(b) 編碼N或9a蛋白的核酸序列是SEQ IDNO:3,或與SEQ ID NO: 3的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源性的 序列;和/或(c) 編碼S蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 4,或與SEQ ID NO: 4的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源性的序列;和/或(d) 編碼M蛋白的核酸序列是SEQIDNO:5,或與SEQIDNO: 5的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源性的序列;和/或(e) 編碼E蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 6,或與SEQ ID NO: 6的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源性的序列;和/或(f) 編碼基因3a的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 12,或與SEQ ID NO: 4的序列具有至少70°/。、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源性的序列;和/或(g) 編碼基因6的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 14,或與SEQ ID NO: 14的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源 性的序列;和/或(h) 編碼基因7a的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 15,或與SEQ ID NO: 15的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源 性的序列;和/或(i) 編碼基因7b的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 16,或與SEQ ID NO: 16的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源 性的序列;和/或(j) 編碼基因8a的蛋白的核酸序列是SEQIDNO:17,或與SEQ ID NO: 17的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源 性的序列;和/或(k)編碼基因8b的蛋白的核酸序列是SEQIDNO:18,或與SEQ ID NO: 18的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源 性的序列;和/或(1)編碼基因9b的蛋白的核酸序列是SEQIDNO: 19,或與SEQ ID NO: 19的序列具有至少70%、優(yōu)選的至少85%或至少95%的同源 性的序列。
      10. 根據(jù)權(quán)利要求1到9之一的核酸,其中當(dāng)與相同的細(xì)胞培養(yǎng) 物中野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時,所述減毒的 SARS-CoV病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的最大病毒滴度降低至少5 的因數(shù),優(yōu)選的至少10或20的因數(shù)。
      11. 根據(jù)權(quán)利要求1到IO之一的核酸,其中當(dāng)與相同細(xì)胞培養(yǎng)物 中野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時,所迷減毒的 SARS-CoV病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的最大病毒滴度降低優(yōu)選的 2到100之間的因數(shù)、更優(yōu)選的5到50之間的因數(shù),以及最優(yōu)選的10 到25之間的因數(shù)。
      12.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸,其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物是用所述核酸 轉(zhuǎn)染的Vero E6、 CaCo-2或Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)物。
      13. 根據(jù)權(quán)利要求1到12之一的核酸,其中所述核酸進(jìn)一步包含 不來自SARS-CoV的序列,優(yōu)選的是外源基因。
      14. 根據(jù)權(quán)利要求1到13之一的核酸,其中所述核酸進(jìn)一步編碼 共刺激分子,所述共刺激分子選自由CD80、 CD86、免疫刺激細(xì)胞因 子如TNF-cx、 IFN-y、趨化因子、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白 細(xì)胞介素-2(IL-2) 、 IL-12和IL-18構(gòu)成的列表。
      15. 包含根據(jù)權(quán)利要求1到14的任何一項(xiàng)的核酸的宿主細(xì)胞。
      16. 包含權(quán)利要求1到14的任何一項(xiàng)的核酸的SARS-CoV病毒 顆粒。
      17. 可通過用權(quán)利要求l到14的任何一項(xiàng)的核酸轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲 得的SARS-CoV病毒顆粒。
      18. 疫苗,包含根據(jù)權(quán)利要求16或17的SARS-CoV病毒顆粒、 或根據(jù)權(quán)利要求1到14的任何一項(xiàng)的鈍化的SARS-CoV病毒顆粒或核 酸、或根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞,和藥學(xué)上可接受的佐劑、載體或 賦形劑。
      19. 根據(jù)權(quán)利要求18的疫苗,其中所述疫苗向哺乳動物的施用產(chǎn) 生免疫反應(yīng),所述免疫反應(yīng)降低或消除由SARS-CoV病毒感染引起的 疾病癥狀。
      20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19的疫苗,其中所述疫苗將施用給人類 或動物,其中所述動物優(yōu)選的是環(huán)尾貓熊、浣熊或白鼬。
      21. 根據(jù)權(quán)利要求18到20之一的疫苗,其中所述疫苗將口服地、 肌內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、皮下地或鼻內(nèi)地施用。
      22. 根據(jù)權(quán)利要求18到21的任一項(xiàng)的疫苗,其中所述佐劑選自 由細(xì)胞因子、TNF-a、 IFN-y、趨化因子、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激 因子、白細(xì)胞介素-2 (IL-2) 、 IL-12、 IL-18、 IL-15和IL-23構(gòu)成的列表。
      23. 根據(jù)權(quán)利要求16或17的病毒顆?;蚋鶕?jù)權(quán)利要求1到M的 核酸用于制備疫苗的用途,所述疫苗用于接種哺乳動物、特別是人類、 環(huán)尾貓熊、浣熊或白鼬對抗SARS-CoV感染。
      24. 制備SARS-CoV疫苗的方法,包括通過修改根據(jù)權(quán)利要求2 到9的核酸來修飾包含SARS-CoV病毒基因組的核酸。
      25. 根椐權(quán)利要求24的制備SARS-CoV疫苗的方法,包括修改 編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列,從而所迷基因不能表達(dá)功能性 的E蛋白。
      26. 根據(jù)權(quán)利要求25的方法,其中所述方法進(jìn)一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列,從而所迷核酸表達(dá)病毒蛋白復(fù)制酶、S、 M和N,并且進(jìn)一步表達(dá)或不表達(dá)編碼蛋白3a的序列。
      27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法,其中所迷方法進(jìn)一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列,從而所述核酸不能表達(dá)與SARS-CoV基 因E、 6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b (相應(yīng)于SEQ ID NO: 6、 14到19)編 碼的蛋白質(zhì)具有至少80%的同源性、優(yōu)選的至少90%的同源性或至少 95%的同源性的蛋白。
      28. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法,其中所述方法進(jìn)一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列,從而所述核酸不能表達(dá)與SARS-CoV基 因3a、 3b、 6、 7a、 7b、 8a、和8b (相應(yīng)于SEQ ID NO: 12到18)編 碼的蛋白質(zhì)具有至少80。/。的同源性、優(yōu)選的至少90%的同源性或至少 95%的同源性的蛋白。
      29. 根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中所述方法進(jìn)一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列,從而所述核酸表達(dá)病毒蛋白復(fù)制酶、S、 M、 N和E,并且進(jìn)一步表達(dá)或不表達(dá)編碼蛋白3a的序列。
      30. 根據(jù)權(quán)利要求29的方法,其中所述方法進(jìn)一步包括修改 SARS-CoV的基因組的序列,從而所述核酸不能表達(dá)與SARS-CoV基 因6、 7a、 7b、 8a、 8b和9b (相應(yīng)于SEQ ID NO: 14到19)編碼的蛋 白質(zhì)具有至少80%的同源性、優(yōu)選的至少90%的同源性或至少95%的 同源性的蛋白。
      31. 根據(jù)權(quán)利要求24到30之一的方法,其中所述方法進(jìn)一步包 括修改SARS-CoV的基因組的序列,從而所述核酸不能表達(dá)除了復(fù)制酶S、 M、 N和/或E以外任何SARS-CoV衍生的蛋白編碼序列,并進(jìn) 一步表達(dá)或不表達(dá)編碼蛋白3a的序列。
      32. 根據(jù)權(quán)利要求24或權(quán)利要求31的方法,其中所述方法進(jìn)一 步包括向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入所述修飾的核酸,并分離編碼所述修改的基 因組的核酸或包含所述修飾的核酸的SARS-CoV病毒顆粒。
      33. 根據(jù)權(quán)利要求24到32之一的方法,其中所述方法進(jìn)一步包 括與藥學(xué)上可接受的佐劑、載體或賦形劑混合所述核酸或所迷 SARS-CoV病毒顆粒。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸,所述SARS-CoV病毒能在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生最大病毒滴度,當(dāng)與相同細(xì)胞培養(yǎng)物中野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比時,所述最大病毒滴度降低至少2的因數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面,所述編碼減毒的SARS-CoV病毒的核酸可通過包括步驟的方法獲得,其中其中通過修改編碼SARS-CoV E蛋白的基因的序列來修飾所述SARS-CoV病毒的基因組,從而所述核酸不表達(dá)功能性的E蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由這些核酸編碼的病毒以及所述核酸和所述病毒的醫(yī)藥用途。
      文檔編號C12N7/04GK101248174SQ200680031114
      公開日2008年8月20日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
      發(fā)明者E·阿爾瓦雷茨戈梅茨, F·阿爾馬詹托拉爾, L·恩朱阿尼斯桑切斯, M·洛佩茨德迪戈 申請人:康斯喬最高科學(xué)研究公司
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