專利名稱：硝基還原酶的新型酶底物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測硝基還原酶活性的新型酶底物。這些底物可用在特別是微生物學、生物化學、免疫學、分子生物學、組織學等包括產生物理化學信號的酶還原步驟的應用中。
背景技術：
目前存在非常多的能夠檢測微生物的培養(yǎng)基。該檢測可特別地基于特定底物的使用，所述底物對于期待檢測的微生物中的酶具有特異性。通常，對酶的合成性底物的制備方式是使底物和它通過靶酶代謝的產物具有不同的物理化學性質，所述性質使得能夠將它們區(qū)分，并能夠評價是否所有或部分的底物已通過酶轉化為產物。例如，酶代謝的產物可以是生色或熒光的。由此，在細菌的情況中，通過底物的選擇，根據是否存在反應，可表征微生物的性質。硝基還原酶活性可特別地用于鑒定細菌群、屬或種。還可將其用于監(jiān)測微生物的還原性代謝，如與它們的生長或抑制這樣的生長相關的還原性代謝。多年來已知一些細菌具有還原硝基芳族化合物的能力。Asnis (1957)報道了從大腸桿菌提取物中分離黃素蛋白，黃素蛋白能夠還原對硝基苯甲酸。從這篇報道開始，在各種生物體中已鑒定出硝基芳基還原酶活性。這包括嚴格需氧菌如假單胞菌屬O^eudomonas) (Won等人，1974)和諾卡菌屬(Nocardia) (Vi llanueva, 1964)、嚴格厭氧菌如梭菌屬 (Clostridium) (Ancermaier 和 Simon，1983)和韋榮氏球菌屬(Veillonella) (McCormick等人，1976)或真菌(Masuda和Ozaki，1993)和真核寄生蟲(Douch, 1975) 存在著一些被指認能夠被細菌性硝基芳基還原酶還原的底物。這些底物尤其為硝基芳族化合物，例如對硝基苯甲酸、對硝基苯酚、對硝基苯胺及2，4，6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。通常通過間接方法如監(jiān)測底物或共因子的消失對硝基還原酶的酶活性進行檢測。 例如，Kitamura等人(198 已研究了對硝基苯甲酸甲酯和一些其他的硝基芳族化合物與大腸桿菌提取物的還原。但是，該方法不是非常靈敏，并且不適于在非均相培養(yǎng)基中的檢測。還可提及申請WO 00Λ8073，其描述了用于直接檢測硝基芳基還原酶活性的基于硝基香豆素的熒光底物。該類型的硝基芳族化合物能夠在還原后產生較強熒光的化合物，因此該化合物可易于檢測。但是，該底物不能很好地適于非均相培養(yǎng)基中的檢測。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明提出對可進行微生物檢測的硝基還原酶底物的改進。相對于現有的底物，這些新型底物易于合成，并且可以特別地用于微生物檢測的凝膠培養(yǎng)基，因為它們產生在反應培養(yǎng)基中不擴散的顏色。此外，本發(fā)明相對于現有技術的改進在于本發(fā)明的化合物可進行的微生物檢測， 同時顯示出硝基還原酶活性和引起培養(yǎng)基的pH變化的代謝。在進一步描述本發(fā)明之前，給出以下定義以有助于本發(fā)明的公開?！│?ΙιΙ是指這樣的底物，其可被酶改變成允許直接或間接地檢測微生物、細胞或細胞器的產物。在硝基還原酶底物的情況中，該底物特別包括硝酸酯官能團，該官能團可被待檢測的酶活性部分或全部地還原，這樣的硝酸酯官能團的還原改變分子的某些物理化學性質，使得能夠監(jiān)測該還原。本發(fā)明的底物適用于流式細胞術，因為由于其還原產物主要保留在表達酶活性的細胞內，可以特定地對表達該活性的細胞計數，或者甚至將它們從樣品的其余部分中分離。本發(fā)明的底物還較好地適用于組織酶學，這是因為由于還原產物主要保留在還原位點處，所以可特異性地鑒定在組織中表達該活性的細胞或細胞器。由于它們的低毒性，本發(fā)明的底物較好地適于對細胞培養(yǎng)物的硝基還原酶活性的監(jiān)測。本發(fā)明的底物特別良好地適用于培養(yǎng)基的檢測和/或鑒定，這是因為它們產生在反應培養(yǎng)基中不擴散的顏色或熒光。在本申請中，術語“顏色”包括在可見光譜中的顏色、
光吸收或在某波長(λ J下吸收且在更高波長下(Tiem，λεπι;^λ6Χ)激發(fā)的熒光。本發(fā)明的底物可以是鹽化的，即可以為如氯鹽、溴鹽、碘鹽、鉀鹽或三氟乙酸鹽的鹽形式。術語“ρΗ指示劑”應理解是指顏色和/或熒光根據培養(yǎng)基的PH變化而改變的化學物質，所述變化與在所述培養(yǎng)基上生長的微生物的代謝相關或不相關?！跋趸€原酶”應理解是指可全部或部分還原NO2基的酶?！巴榛睉斫馐侵革柡蜔N基鏈,例如特別是C「C6烷基，即碳原子數為1-6的直鏈或支鏈的烷基。例如，可提及甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基。“芳基”應理解是指從芳環(huán)衍牛的官能團(或取代基)，芳環(huán)特別是如芳族C6-Ciq 環(huán)，尤其是苯基、苯甲基、I"萘基或2-萘基?！棒然睉斫馓貏e是指由通過雙鍵與第一氧原子連接，并且通過單鍵與第二氧原子連接的碳原子構成的官能團，第二氧原子帶負電荷或與氫原子連接。取決于分子的PKa* 培養(yǎng)基的pH，羧基可以是以離子化的形式，即不具有與第二氧原子連接的H，其從而是帶負電荷的?！胺磻囵B(yǎng)基”應理解是指這樣的培養(yǎng)基,其包含用于微牛物、細胞或者細胞器的代謝表達和/或生長所需的所有成分。這樣的反應培養(yǎng)基可用于流式細胞術、組織酶學、細胞培養(yǎng)等，或作為用于檢測和/或鑒定微生物的培養(yǎng)基。所述反應培養(yǎng)基可以是固體、半固體或液體。術語“固體培養(yǎng)基”應理解是指例如凝膠培養(yǎng)基。瓊脂是用于微生物培養(yǎng)的微生物學常規(guī)膠凝劑，但可使用明膠或瓊脂糖。一些制品是市售的，如Columbia瓊脂、胰酪蛋白胨大豆瓊脂、MacConkey瓊脂、Sabouraud瓊脂或更通常而言描述于 Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中的那些。所述反應培養(yǎng)基可包含一種成分或多種成分的組合，例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、礦物質、維生素、抗生素、表面活性劑、緩沖劑、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽、金屬鹽。所述培養(yǎng)基還可包含染色劑。例如，可提及伊文思藍、中性紅、羊血(she印 blood)、馬血(horse blood)、遮光劑如二氧化鈦、硝基苯胺、孔雀綠、亮綠等。所沭反應培養(yǎng)基可以是“檢測和/或鑒定培養(yǎng)基”,即是可視化培養(yǎng)基或培養(yǎng)且可視化培養(yǎng)基。在第一種情況中，在接種之前培養(yǎng)微生物，而在第二種情況中，所述檢測和/ 或鑒定培養(yǎng)基還構成培養(yǎng)培養(yǎng)基。
“牛物樣品”應理解表示這樣的臨床樣品，其源自生物學流體樣本或者食物樣品、 源自任何類型的食物、或源自任何化妝品或藥物制劑的化妝品或藥物樣品。該樣品因此可以是液體或固體，并且可以非限制性地提及臨床的血液、血漿、尿液或糞便樣品，來自鼻子、 喉嚨、皮膚、傷口或腦脊髓液的樣品，來自水或如奶、果汁的飲料、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚等的食品樣品，由動物飼料而得到的食品樣品，例如尤其從骨粉得到的樣品。所述樣品還可以取自臨床環(huán)境、畜牧環(huán)境或食品、化妝品或藥物生產的環(huán)境。術語“取自某環(huán)境的樣品，，應理解尤其表示表面樣品、液體樣品、原料樣品或產品樣品。術語“樣品”因此應理解表示樣品本身(拭子、糞便、食品等)和從所述樣品得到的微生物菌落(如在凝膠培養(yǎng)培養(yǎng)基上分離之后或使用所述樣品接種的增菌液)。出于本發(fā)明的目的，術語“微牛物”包括細菌、尤其為革蘭氏陰件菌和革蘭氏陽件菌、酵母、霉菌和更通常而言是普通單細胞的、肉眼看不見的生物體，其可以在實驗室中增殖和操作。作為革蘭氏陰性菌，可以提及如下屬的細菌假單胞菌屬(I^seudomonas)、 埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、腸 ff M (Enterobacter) > 3 W θ K ff ^ (Klebsiella) > ^ W K ^ M (Serratia)、^ 形桿菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、不動桿菌屬 (Acinetobacter)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、伯克氏菌屬(Burldiolderia)、檸檬酸細菌屬(CitrcAacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛德華氏菌屬 (Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、巴斯德氏菌屬 (Pasteurella)、普羅威登斯菌(Providencia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、產堿菌屬 (Alcaligenes)、博德特氏菌(Bordetella)、西地西菌屬(Cedecea)、歐文氏菌(Erwinia)、 泛生菌屬(Pantoea)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)、狹長平胞菌(Stenotrophomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)禾口軍團菌屬(Legionella)。作為革蘭氏陽性菌，可以提及如下屬的細菌氣球菌屬(Aerococcus)、腸球菌屬 (Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽抱桿菌屬 (Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、李其Jf 特菌屬(Listeria)、梭菌屬(Clostridium)、 加德納菌屬(Gardnerella)、考克斯菌屬(Kocuria)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌屬 (Leuconostoc)、微球菌(Micrococcus)、Falkamia、兼性雙球菌屬(Gemella)、小球菌屬 (Pediococcus)、分支桿菌屬(Mycobacterium)禾口棒狀桿菌屬(Corynebacterium)0作為酵母，可以提及如下屬的酵母假絲酵母(Candida)、隱球酵母 (Cryptococcus)、糖酵母(Saccharomyces)禾口毛抱子菌屬(Trichosporon)。優(yōu)選地，所述微生物屬于以下屬埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸細菌屬、克雷伯氏桿菌、變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬、摩根氏菌屬、耶爾森氏菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、放線桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、李斯特菌屬、芽孢桿菌屬、假絲酵母、隱球酵母、糖酵母。對此，本發(fā)明涉及下式(I)的化合物及其鹽作為檢測硝基還原酶活性的的酶底物的用途
權利要求
1.下式(I)的化合物及其鹽作為檢測硝基還原酶活性的酶底物的用途 W3W4
2.下式(I)的化合物及其鹽作為檢測硝基還原酶活性的酶底物和PH變化指示劑的用途
3.根據權利要求1或2所述的式(I)化合物的用途，其中η= 1。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的式(I)化合物的用途，其中WpW2I3和W4獨立地是H0
5.根據權利要求1-4中任一項所述的式(I)化合物的用途，其中U是N或N+R，并且V 是 CZ6。
6.根據權利要求1-4中任一項所述的式(I)化合物的用途，V是N或N+R，并且U是CZ6。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的式⑴化合物的用途，其中WmM 是H0
8.根據權利要求1或2所述的式(I)化合物的用途，其中所述化合物選自2-(4’-硝基苯乙烯基)喹啉ONSQ)、2-(4’ -硝基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鐺碘化物0NSMQ+I)、 2_(4’ -硝基苯基)丁二烯基-N-甲基喹啉鐺碘化物ONPBMQ+I)、4-(4’ -硝基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鐺碘化物GNSMQ+I)和4-(4’ -硝基_2’ -甲氧基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鐺碘化物GNMSMQ+I) ,4-(4'-硝基苯基)-2-甲基喹啉、2-(4’ -硝基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鐺TFA、4-(4’ -硝基苯乙烯基)-N-苯甲基喹啉鐺TFA、4-(4’ -硝基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鐺氯化物、4-(4’_硝基苯乙烯基)喹那啶鐺氫溴化物、4-(4’_硝基苯乙烯基)喹那啶鐺甲碘化物、4-(4’ -硝基苯乙烯基)喹啉TFA、2-(2’ -吡啶基)-4- ”-硝基苯乙烯基) 喹啉、4-(4’ -硝基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鐺TFA。
9.檢測微生物中的硝基還原酶活性的方法，其特征在于其包括以下步驟a)提供檢測和/或鑒定培養(yǎng)基，其包含式(I)的化合物及其鹽 W3W4
10.檢測硝基還原酶活性和pH變化的方法，其特征在于其包括以下步驟a)提供檢測和/或鑒定培養(yǎng)基，其包含式(I)化合物及其鹽
11.用于檢測和/或鑒定微生物的培養(yǎng)基，其包含下式(I)的化合物及其鹽
12.根據權利要求11所述的檢測和/或鑒定微生物的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基還包含至少一種其代謝造成所述培養(yǎng)基的PH變化的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有式(I)的化合物及其鹽在作為檢測硝基還原酶的活性的酶底物中的用途其中W1、W2、W3和W4獨立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)或它們的任意組合；n＝0、1或2；U是N或N+R，并且V是CZ6、N或N+R，或者V是N或N+R，并且U是CZ6，R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷?；蛲榛酋；?；Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6獨立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺?；?，包括羧基或磺?；孽セ蝓０贰?br> 文檔編號C12Q1/26GK102482708SQ201080033839
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權日2009年7月30日
發(fā)明者A·詹姆斯, J·佩里, O·法布雷加, S·奧倫加, S·斯坦福斯, V·L·薩爾瓦圖拉 申請人:生物梅里埃公司