專利名稱：：用于cd34-陰性干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基的制作方法用于CD34-陰性干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基本申請要求2009年12月23日提交的申請?zhí)枮?1/289，796的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán),其全部內(nèi)容通過引用并入本文。本申請通篇引用了不同的出版物。這些出版物的公開內(nèi)容在此通過引用并入本申請，以便更全面地描述本發(fā)明涉及的技術(shù)現(xiàn)狀。
背景技術(shù)：
：來源于骨髓和臍血的人類非造血干細(xì)胞越來越多地被用作用于患者的再生和免疫調(diào)節(jié)指征的間充質(zhì)細(xì)胞。在全球范圍內(nèi)已經(jīng)利用間充質(zhì)干細(xì)胞實施了超過80例臨床試驗。幾乎所有的研究人員都使用含胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)血清補(bǔ)充物。FBS是牛源的，可以傳播TSE(即可傳播性海綿狀腦病)和刺激接受者的免疫應(yīng)答。只有無BSE的牛被權(quán)威機(jī)構(gòu)核準(zhǔn)用于人類(新西蘭)，研究人員正努力研發(fā)用于促進(jìn)細(xì)胞生長的替代方法。由于細(xì)胞療法很可能在未來幾年將被越來越多地使用，隨之而來的將是FBS的短缺。ー些公司已經(jīng)研發(fā)了無血清培養(yǎng)基。但是這些培養(yǎng)基顯示出比理想的生長速率低的生長速率，骨髓源性CD34-陰性干細(xì)胞的形態(tài)和性質(zhì)在這些培養(yǎng)基中不能如在含F(xiàn)BS培養(yǎng)基中那樣廣泛表征。人類凝血細(xì)胞(即血小板)已經(jīng)被其他研究人員用作新鮮冰凍血漿(FFP)，用作促生長成分。血小板及其用于再生醫(yī)學(xué)的潛在意義由Stellos和Gawaz,以及Langer和Gawaz分別評述。關(guān)于使用血小板或FFP的干細(xì)胞擴(kuò)增可提及本領(lǐng)域的下列具體教導(dǎo)。Schallmoser等人公開了使用血小板裂解物的間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)増。Capelli等人公開了未過濾的人類血小板裂解物用于擴(kuò)增和生產(chǎn)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的用途。Kocaoemer等人公開了人類AB血清和凝血酶激活的富血小板血漿在擴(kuò)增來自脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞中的用途。Muller等人公開了用于分離和擴(kuò)增來自人類骨髄的多潛能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的無動物血清培養(yǎng)條件，所述條件使用FFP和血小板兩者。Blande等人公開了脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞在無動物血清培養(yǎng)基中的擴(kuò)增，所述無動物血清培養(yǎng)基中補(bǔ)充有已經(jīng)無菌過濾的人自體血小板裂解物。而且，SalvadS等人公開了血小板裂解物在培養(yǎng)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞中的用途，其中所述裂解物是無菌過濾的。盡管血小板裂解物和FFP用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的已知用途，仍然存在未滿足的需求，即更快速、更低廉和更安全地以穩(wěn)定方式培養(yǎng)這種細(xì)胞，同時保留其以后在需要時進(jìn)行分化的能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的1%至10%；(c)濃度為所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基，其中所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的75%至97%，且可以包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，所得經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力。本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物的總體積的17%至94%;和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物的總體積的6%至83%；其中在將所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞生長培養(yǎng)基時，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力，所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基包含(i)3體積％至25體積％的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物；(ii)濃度為OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。本發(fā)明另外提供了ー種無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中根據(jù)下列步驟制備所述血小板裂解物(i)冷凍血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再次離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。本發(fā)明還另外提供了ー種無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中根據(jù)下列步驟制備所述FFP濾出物⑴融化FFP；(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。本發(fā)明還提供了ー種用于擴(kuò)增人類⑶34_干細(xì)胞的試劑盒，其在分開的區(qū)室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中⑴所述裂解物構(gòu)成(a)和(b)合并的體積的17%至94%;(ii)所述FFP濾出物構(gòu)成(a)和(b)合并的體積的6%至83%，和(iii)在將所述裂解物和所述濾出物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞生長培養(yǎng)基時，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得經(jīng)擴(kuò)增的CD34—干細(xì)胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內(nèi)容物構(gòu)成所述培養(yǎng)基體積的3%M25%;和(ii)肝素的濃度為OU/ml至IOU/ml0本方明還提供了ー種物質(zhì)組合物，其包含(a)人類⑶34_干細(xì)胞和(b)上述任意實施方式的主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基。本發(fā)明另外提供了一種用于制備無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物的方法，其包括下列步驟(i)冷凍血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。本發(fā)明還另外提供了一種用于制備無直徑大于0.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物的方法，其包括下列步驟⑴融化FFP；(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。本發(fā)明還提供了一種用于制備細(xì)胞生長培養(yǎng)基的方法，其包括組合下列物質(zhì)的步驟(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的1%至10%；(c)其量足夠產(chǎn)生所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的OU/ml至10U/ml的濃度的肝素；(d)其量足夠產(chǎn)生O.5mM至IOmM的濃度的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基，其中所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的75%至97%，且所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，所得經(jīng)擴(kuò)增的CD34_〒_胞保持分化的能力。本發(fā)明提供了ー種用于擴(kuò)增人類CD34_干細(xì)胞群的方法，其包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谥黝}細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞的步驟。本發(fā)明還提供了一種人類CD34_干細(xì)胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34_干細(xì)胞群的擴(kuò)增獲得，其中所述擴(kuò)增包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谥黝}細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞群。最后，本發(fā)明提供了人類CD34_干細(xì)胞群，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34_干細(xì)胞群的擴(kuò)增獲得，其中所述擴(kuò)增包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谥黝}細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞群。ISI在不同組成的培養(yǎng)基中MSC的倍增時間。IS2在不同培養(yǎng)基中MSC的增殖速率。IS3在Bio-I中MSC生長的動力學(xué)。圖4MSC特異性表面蛋白質(zhì)的表達(dá)。圖5通過流式細(xì)胞儀對MSC種群的分析。左側(cè)在IMDM+20%FBS中培育的MSC;右側(cè)在Bio-I中培育的MSC。S6Bio-I中MSC生長的誘導(dǎo)分化。S7MSC的倍增時間(天)。紅(柱4-6):用FFP培養(yǎng)的MSC的倍增時間，所述FFP通過至少40μm的過濾器或具有更小孔徑的過濾器過濾。藍(lán)(柱1-3):用沒有過濾或者僅通過100μm的過濾器過濾的FFP培養(yǎng)的MSC的倍增時間。S8在12天后達(dá)到的倍增量。紅(柱4-6):用FFP培養(yǎng)的MSC達(dá)到的倍増，所述FFP通過至少40μm的過濾器或具有更小孔徑的過濾器過濾。藍(lán)(柱1-3):用沒有過濾或者僅通過100μm的過濾器過濾的FFP培養(yǎng)的MSC達(dá)到的倍増。圖9在培育4天之后進(jìn)行顯微鏡分析。通過40μm、40μm或O.22μm過濾器來過濾FFP明顯增加了MSC的生長速率。僅通過100μm的過濾器的過濾只是稍微改善了效果。圖10MSC的倍增時間(天)。在含有通過40μm過濾器的FFP的培養(yǎng)基中培育的MSC的倍增時間(紅，柱4-6)，是用未經(jīng)過濾的FFP培養(yǎng)的MSC的倍增時間(藍(lán)，柱1-3)的大約一半。圖11在培育9天之后的顯微鏡分析。在所述分析中使用晚代的MSC，這解釋了衰老MSC典型的長倍增時間和扁平化的形態(tài)(圖1-4)。但是在含有經(jīng)過濾的FFP的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)不僅提高了細(xì)胞生長速率，而且還改善了細(xì)胞的形態(tài)(圖5-8)。圖12對不同TK和FFP制備物中MSC生長的對照。TK和FFP都經(jīng)過不同的過濾步驟。顯微圖片示出培育7天之后的細(xì)胞生長。用都經(jīng)過40μm和O.20μm的過濾器過濾的TK和FFP制備的培養(yǎng)基提供了最高效的MSC生長(樣品2)，即使在所得到的培養(yǎng)基又經(jīng)過O.20μm的過濾器過濾時也是如此(樣品5)。在所有情況下都充分促進(jìn)了細(xì)胞生長。圖13對在經(jīng)過不同過濾步驟制備的Bio-I中生長的⑶41+MSC的分析。所述分析使用來自供體AP00029、AP00042和AP00045的MSC。(A)I-對照；2-TKO.8μm/0.2μm+FFP；3-TK+FFP0.8μm/0.2μm;4_Tk0.8μm/0.2μm+FFP0.8μm/0.2μmo(B)ト對照；2-TK8μm+FFP；3-TK+FFP8ym；4-ΤΚ8μm+FFP8μm。(C)I-對照；2-TK8μm/0.8μm/0.2μm+FFP；3-TK+FFP8μm/0.8μm/0.2μm;4_TK8μm/0.2μm+FFP8μm/0.8μm/0.2μm。(D)I-對照；2_TKO.8μm/0.2μm+FFP0.8μm/0.2μm+Bio—10·8μm/0.2μm;3_TK8μm/0.8μm/0.2μm+FFP8μm/0.8μm/0.2μm+Bio-10.8μm/0.2μm。圖14對在Bio-I中生長的MSC的分析，所述Bio-I含有(I)標(biāo)準(zhǔn)FFP和⑵無冷沉淀物的FFP。發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明提供了ー種新型生長培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞出人意料地快速擴(kuò)增。經(jīng)擴(kuò)增的干細(xì)胞不分化，直至另外誘導(dǎo)才分化。因此，本發(fā)明的生長培養(yǎng)基，以及其相關(guān)的方法構(gòu)成了快速地、安全地和廉價地產(chǎn)生臨床上有效數(shù)量的CD34_干細(xì)胞用于治療疾病的能力的顯著進(jìn)歩。特別地，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板(即凝血細(xì)胞)裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的1%至10%；(c)濃度為所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基，其中所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的75%至97%，且可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且其中得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力。這種細(xì)胞生長培養(yǎng)基的優(yōu)選實施方案包括如下(i)所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的3%至8%，5%至7%，和優(yōu)選6%；(ii)所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的2%至7%，4%至6%，和優(yōu)選5%肝素的濃度為所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的O.8U/ml至I.2U/ml，和優(yōu)選lU/ml；(iv)L-谷氨酰胺的濃度為O.5mM至IOmM,和優(yōu)選2mM;和(V)所述無血清低葡萄糖(lmg/ml)培養(yǎng)基是含L-谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM(達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)),且構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的85%至93%，87%至91%，和優(yōu)選89%。在另外優(yōu)選的實施方案中，經(jīng)擴(kuò)增的⑶34_干細(xì)胞具有下列表現(xiàn)型⑶347⑶45_/⑶73+/⑶105+/⑶90+。對于所述表現(xiàn)型，它意味著在測試標(biāo)志物⑶34和⑶45(例如使用流式細(xì)胞儀分析)吋，這種標(biāo)志物在經(jīng)擴(kuò)增的細(xì)胞上出現(xiàn)0%±10%(和優(yōu)選±0.5%)。同樣地，在測試標(biāo)志物⑶73、⑶105和⑶90時，所述標(biāo)志物在經(jīng)擴(kuò)增的細(xì)胞上出現(xiàn)100%±10%(和優(yōu)選+0.5%)ο如本文所用的，“⑶34_干細(xì)胞”應(yīng)表示在其表面上缺少⑶34的干細(xì)胞。⑶34_干細(xì)胞可來源于組織，例如骨、臍帶和脂肪細(xì)胞。例如在LangeC等人的Acceleratedandsafeexpansionofhumanmesenchymalstromalcellsinanimalserum-freemediumfortransplantationandregenerativemedicine.J.CellPhysiol.2007，Apr.25[印刷目！]電子出版(Epubaheadofprint)]中描述了⑶34-干細(xì)胞及其分離方法。[54]在本發(fā)明的一種實施方案中，術(shù)語新鮮冰凍血漿(FFP)指的是已經(jīng)冷凍和保存的人類血液的液體部分。在實施方案中術(shù)語FFP尤其指采集后6小時內(nèi)已經(jīng)離心、分離和在-18°C下冷凍成固體的人類血液的流體部分。[55]適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清的低葡萄糖培養(yǎng)基可以包含例如各種氨基酸、維生素、鹽和其它化合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基是低葡萄糖的(DMEM)，其還可包含L-谷氨酰胺。下面的表I和2中作為實例提供了兩種幾乎一致的生長培養(yǎng)基配方。表I低葡萄糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)DMEM包含(mg/ml)無機(jī)鹽:0.0002mgCaCl0.000ImgFe(NO3)X9H200.0004mgKCl0.0000977mgMgSO40.0064mgNaCl0.000125mgNaH2PO4X2H200.0037mgNaHCO3氨基酸:0.000084mgL-精氨酸XHCl0.000048mgL-胱氨酸0.000584mgL-谷氨酰胺0.000030mg甘氨酸0.000042mgL-組氨酸XHClXH2O0.000105mgL-異亮氨酸0.000105mgL-亮氨酸0.000146mgL-賴氨酸XHCl0.00003mgL-甲硫氨酸0.000066mgL-苯丙氨酸0.000042mgL-絲氨酸0.000095mgL-蘇氨酸0.000016mgL-色氨酸0.000072mgL-酪氨酸0.000094mgL-纈氨酸維牛素0.000004mgD-泛酸鈣0.000004mg氯化膽堿0.000004mg葉酸鹽/酷0.0000072mg肌-肌醇0.000004mg煙酰胺0.000004mg吡哆醛XHCl0.0000004mg核黃素0.000004mg硫胺XHCl其他成分0.OOlmgD-葡萄糖0.000015mg苯酚紅0.OOOllmg丙酮酸鈉0.9862567mgH2O水0.9862567mg表2達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，DMEM低葡萄糖化合物配方mg/L部分A:無機(jī)鹽氯化鈣(無水)200.00硝酸鐵0.10硫酸鎂200.00氯化鉀400.00碳酸氫鈉3700.00氯化鈉6400.00磷酸鈉，H2O125.00部分B:其他成分D-葡萄糖1000.00苯酚紅15.00丙酮酸鈉110.00部分C:氨基酸L-鹽酸精氨酸84.00L-胱氨酸48.00L-谷氨酰胺584.00甘氨酸30.00L-鹽酸組氨酸42.00L-異亮氨酸105.00L-亮氨酸105.00L-賴氨酸HCl146.00L-甲硫氨酸30.00L-苯丙氨酸66.00L-絲氨酸42.00L-蘇氨酸95.00L-色氨酸16.00L-酪氨酸72.00L-纈氨酸94.00部分P:維生素D-泛酸鈣4.00氯化膽堿4.00i-肌醇7.20煙酰胺4.00鹽酸吡哆醛4.00鹽酸硫胺4.00葉酸4.00核黃素0.40[pH7.O滲透摩爾濃度324_333m0sm]人類血小板(即凝血細(xì)胞)可以從全血獲得或從單采血液成分法獲得。血小板可以來源于單個供體或相匹配的混合供體。在優(yōu)選的實施方案中，使用單個供體單采血液成分法。同樣，F(xiàn)FP可以從全血獲得或從單采血液成分法獲得。優(yōu)選地，使用單采血液成分方法來制備FFP。血小板濃縮物以及FFP濃縮物可以根據(jù)常規(guī)方法制備，例如在歐洲委員會推薦的“血液成分的制備、使用和質(zhì)保指南(Guidetothepreparation,useandqualityassuranceofbloodcomponents)”；和“用于血液療法的輸血法則(TransfusionsgesetzandRichtlinienzurHSmotherapie)”(德國)中描述的那些方法。在優(yōu)選的實施方案中，所用的血小板単位具有下列特征體積為200_300ml;凝血細(xì)胞含量為2-4X1011/単位血小板；紅細(xì)胞含量<3XIO9/単位血小板；白細(xì)胞含量<1X106/単位血小板；且供體對HLA抗體是陰性的(對于避免免疫并發(fā)癥重要)。這些是根據(jù)制造商許可的特征。也可以使用其他的血小板単位。在主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基的優(yōu)選實施方案中，根據(jù)下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。在本發(fā)明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(V)。在一種實施方案中，如下制備步驟(i)的人類血小板濃縮物離心血小板并從而使其成丸；分離成丸的血小板與液相；和在FFP中重懸(reconstituting)得到的血小板。以下是用于制備血小板裂解物的這種方法的特定額外優(yōu)選的實施方案在_20°C至_80°C，優(yōu)選在_80°C冷凍人類血小板濃縮物；在18°C至37°C，優(yōu)選在37°C融化經(jīng)裂解的血小板；在9000Xg至55000Xg,優(yōu)選在10000Xg下離心融化的經(jīng)裂解的血小板10至20分鐘，優(yōu)選20分鐘；在3000Xg至5000Xg，優(yōu)選在4000Xg下再次離心來自步驟(iii)的上清液10分鐘；和使用孔徑漸減的過濾器，即40μm±5μm、5μm±Iμm和0.22μm的過濾器過濾來自步驟(iv)的上清液三次。重懸的血小板隨后可以經(jīng)過上述的步驟(i)，冷凍步驟。這種程序可以實現(xiàn)血漿中血型抗原和同族凝集素之間良好的血型相容性。在步驟(ic)中用于重懸血小板的FFP可以根據(jù)任一種下面描述的方法來制備。而且，在主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基的優(yōu)選實施方案中，根據(jù)下列步驟制備部分(b)的FFP濾出物⑴融化人類FFP;(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。在本發(fā)明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(iii)。在本發(fā)明的另ー種實施方案中，如下制備部分(b)的FFP濾出物(i)融化人類FFP；(ii)冷凍融化的人類FFP;(iii)融化所得的人類FFP;和(iv)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心得到的融化的FFP。優(yōu)選地，在離心步驟(iv)之前至少再一次冷凍和融化來自步驟(iii)的融化的FFP。在一種實施方案中，還省略了對得自步驟(iv)的液體部分的過濾。以下是用于制備FFP濾出物的這種方法的特定優(yōu)選的實施方案在18°C至37°C，優(yōu)選在37°C融化FFP;在9000Xg至55000Xg,優(yōu)選在10000Xg下離心融化的FFPlO至20分鐘，優(yōu)選20分鐘；和使用孔徑漸減的過濾器，即40μm±5μm、5μm±lμm和O.22μm的過濾器過濾來自步驟(ii)的液體部分三次。理想地是，主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基不含動物血清。這減少了在將非人源抗原引入人受試者時可引起的并發(fā)癥。優(yōu)選地，在主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基中，血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。也就是說，血小板裂解物和FFP濾出物優(yōu)選來源于具有相同血型抗原的受試者(例如裂解物和濾出物都來源于0+/Rh+受試者)。下面將更詳細(xì)地討論這個題目。本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物的總體積的17%至94%;和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物的總體積的6%至83%；其中在將所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成如下細(xì)胞生長培養(yǎng)基時其包含(i)3體積％至25體積％的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物；(ii)濃度為OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_〒_胞的擴(kuò)增，且所得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力。該細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物實際上被用作“濃縮物”添加到標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基如DMEM中。因此，所述補(bǔ)充物優(yōu)選帶來前面討論的優(yōu)選濃度的血小板裂解物和FFP濾出物(例如血小板裂解物和FFP濾出物分別構(gòu)成所述補(bǔ)充物的54.5%和45.5%)。在一種實施方案中，主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物另外包含肝素，其中在將所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞如下生長培養(yǎng)基時其包含3體積％至25體積％(優(yōu)選11體積％)的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，并且含有OU/ml至10U/ml(優(yōu)選lU/ml)的肝素，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力。在主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物中優(yōu)選地，根據(jù)下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。在本發(fā)明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(V)。在主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物中還優(yōu)選，根據(jù)下列步驟制備部分(b)的FFP濾出物⑴融化人類FFP;(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。在本發(fā)明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(iii)。正如主題生長培養(yǎng)基的所有實施方案，這種細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物理想地也是不包動物血清。在主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基中還優(yōu)選，血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。這又與前面關(guān)于主題生長培養(yǎng)基的討論一祥。本發(fā)明另外提供了ー種無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中根據(jù)下列步驟制備所述血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。在本發(fā)明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(V)。本發(fā)明還另外提供了ー種無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中根據(jù)下列步驟制備所述FFP濾出物⑴融化人類FFP;(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。在本發(fā)明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(iii)。本發(fā)明還提供了ー種用于擴(kuò)增人類⑶34_干細(xì)胞的試劑盒，其在分開的區(qū)室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中⑴所述裂解物構(gòu)成(a)和(b)合并體積的17%至94%(優(yōu)選54.5%);(ii)所述FFP濾出物構(gòu)成(a)和(b)合并體積的6%至83%(優(yōu)選45.5%)，和(iii)在將所述裂解物和所述濾出物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞生長培養(yǎng)基時，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內(nèi)容物構(gòu)成所述培養(yǎng)基體積的3%至25%(優(yōu)選11%);和(ii)肝素的濃度為OU/ml至10U/ml(優(yōu)選lU/ml)。在主題試劑盒的ー種實施方案中，所述試劑盒在分開的區(qū)室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，和(c)肝素，其中⑴所述裂解物構(gòu)成(a)-(c)合并體積的17%至94%(優(yōu)選54.5%)；(ii)所述FFP濾出物構(gòu)成(a)-(c)合并體積的6%至83%(優(yōu)選45.5%)，和(iii)在將所述裂解物、所述濾出物和肝素與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞生長培養(yǎng)基時，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內(nèi)容物構(gòu)成所述培養(yǎng)基體積的3%至25%(優(yōu)選11%);和(ii)肝素的濃度為OU/ml至IOU/ml(優(yōu)選lU/ml)。本方明還提供了ー種物質(zhì)組合物，其包含(a)人類⑶34_干細(xì)胞和(b)任ー種實施方式的主題細(xì)胞生長培養(yǎng)基。如本發(fā)明所預(yù)想的，在對受試者施用這種培養(yǎng)基和干細(xì)胞的組合物的情況下，優(yōu)選所述組合物與患者的血型是免疫相容的。在這點上，存在與這種物質(zhì)組合物的臨床應(yīng)用有關(guān)的幾種優(yōu)選的實施方案。在第一種優(yōu)選實施方案中，血小板裂解物是O型(萬能供血血型)，F(xiàn)FP是AB型(萬能供血血型)，將該組合物對具有任意血型(即0、Α、Β或AB)的患者施用。在第二種優(yōu)選實施方案中，血小板裂解物、FFP濾出物和患者均具有相同的血型。在第三種優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)FP濾出物是AB型，血小板裂解物和患者具有相同的血型并且可以是任意血型(例如FFP濾出物是AB型，血小板裂解物和患者都是O型)。最后，如果患者是O型，所用FFP可以具有任意血型。關(guān)于Rh因子，優(yōu)選但不是必須的，患者血型與FFP濾出物和血小板裂解物類型相匹配。本發(fā)明另外提供了一種用于制備無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物的方法，其包括下列步驟(i)冷凍人類血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。在本發(fā)明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(V)。本發(fā)明還另外提供了一種用于制備無直徑大于0.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物的方法，其包括下列步驟⑴融化人類FFP;(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。作為選擇，根據(jù)下列步驟制備細(xì)胞生長培養(yǎng)基的部分(b)的FFP濾出物(i)融化人類FFP;(ii)冷凍融化的人類FFP;(iii)融化來自步驟(ii)的人類FFP;和(iv)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心來自步驟(iii)的融化的FFP。在FFP的制備方法中，在離心步驟(iv)之前可至少再一次冷凍和融化來自步驟(iii)的融化的FFP。該FFP尤其可以在低于或等于-35°C的溫度下冷凍，和另外可以在5°C±3°C的溫度下過夜融化，導(dǎo)致通常引起所培養(yǎng)的MSC凝集的因子的團(tuán)聚。在本發(fā)明的這種方法的另ー種實施方案中，離心步驟可以在4000Xg下進(jìn)行10分鐘，以便沉淀上述團(tuán)聚的因子。當(dāng)使用上述融化和冷凍步驟時，可以省略對得自離心步驟(iv)的液體部分的過濾步驟。在使用經(jīng)過冷沉淀物去除步驟預(yù)處理的FFP制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MSC的倍增時間，與經(jīng)過FFP成分的過濾步驟制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MSC的倍增時間相當(dāng)。本發(fā)明還提供了一種用于制備細(xì)胞生長培養(yǎng)基的方法，其包括組合下列物質(zhì)的步驟(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的2%至15%(優(yōu)選6%)；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的1%至10%(優(yōu)選5%)；(c)其量足夠產(chǎn)生所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的OU/ml至10U/ml(優(yōu)選lU/ml)的濃度的肝素；(d)其量足夠產(chǎn)生O.5mM至IOmM的濃度的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基，其中所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的75%至97%(優(yōu)選89%)，且所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且其中得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力。本發(fā)明提供了ー種用于擴(kuò)增人類CD34—干細(xì)胞群的方法，其包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谥黝}細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞的步驟。優(yōu)選地，適當(dāng)?shù)臏囟葹?6°C至38°C，優(yōu)選37。。。本發(fā)明還提供了一種人類CD34_干細(xì)胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34_干細(xì)胞群的擴(kuò)增獲得，其中所述擴(kuò)增包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谥黝}細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞群。最后，本發(fā)明提供了人類CD34_干細(xì)胞群，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34_干細(xì)胞群的擴(kuò)增獲得，其中所述擴(kuò)增包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谥黝}細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞群。通過參考以下的試驗細(xì)節(jié)將更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，具體的試驗細(xì)節(jié)只是舉例說明后續(xù)權(quán)利要求書中更全面地說明的本發(fā)明?！ぴ囼灱?xì)節(jié)A.干細(xì)胞相關(guān)材料的制備和用途新鮮冰凍血漿(藥品)新鮮冰凍血漿是用于輸血或其他分級過程的人類血漿成分，通過全血來制備或者通過由單采血液成分法采集的血漿來制備。FFP包含正常血漿水平的穩(wěn)定凝血因子、白蛋白和免疫球蛋白。不穩(wěn)定的凝血因子包括VIIIc因子。經(jīng)由單采血液成分法采集來達(dá)到FFP的純度。HLA和HPA抗體的測試可以對單個供體實施，從而降低同種異體免疫的可能風(fēng)險。使用ABO相容的血漿(ABRh+作為萬能供血血型或ABO相匹配的)。在培養(yǎng)期間FFP以非常低的濃度用于MSC的擴(kuò)增。為了進(jìn)一歩降低病原體傳播的風(fēng)險，理想的是測試FFP供體的病原體并使供體對こ肝免疫。通過所述措施降低患者的同種異體免疫和病原體傳播的風(fēng)險。凝血細(xì)胞裂解物(來源于血小板藥品)凝血細(xì)胞裂解物來源于通過單采血液成分法獲得的血小板，理想的是來自單個供體。所施用的血小板単位無污染的紅細(xì)胞，且包含非常少數(shù)量的白細(xì)胞(<IO5/単位)。血小板裂解物由顯著支持MSC生長和純度的無細(xì)胞的裂解物構(gòu)成。Iml裂解物對應(yīng)6.5XIO8至2.OXlO9的血小板。通過使用少白細(xì)胞的單個供體單采血液成分法產(chǎn)品來降低同種異體免疫的可能風(fēng)險。盡管血小板單位不包含紅細(xì)胞(或只包含非常少量)，但只使用ORh+血小板或相匹配的單位。通過使用單個供體的血小板和測試CMV來降低病原體傳播的可能風(fēng)險。如果需要的話可以進(jìn)行對其他病原體例如B19微小病毒、EBV或弓形體病毒的測試。B.Bio-I組合物(即包含血小板裂解物和FFP濾出物的培養(yǎng)基)的研發(fā)和測試比較下列條件下MSC的培育(a)MDM+20%FBS作為標(biāo)準(zhǔn)；(b)補(bǔ)充有3%血小板裂解物(=TK)和5%FFP的低葡萄糖DMEM;和(c)補(bǔ)充有6%血小板裂解物(=TK)和5%FFP的低葡萄糖DMHM。MSC增殖諫率在以上三種選定條件下檢驗來自四個供體的MSC的増殖速率。以相同的初始密度培養(yǎng)和傳代MSC，并在每個傳代步驟期間測定増殖速率。根據(jù)Td=t*log(2)/log(q2/ql)計算倍增時間，其中Td是倍增時間，ql是初始細(xì)胞量，q2是最終細(xì)胞量，t是培養(yǎng)持續(xù)時間(天)。圖I示出在這三種檢驗條件下MSC—次倍增所需的時間。在含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MSC的倍增時間(2.86±0.43天)比在DMEM+6%TK和5%FFP中生長的MSC的倍增時間(I.78±0.23天)更長。用較少的血小板裂解物(DMEM+3%TK和5%FFP)培育的MSC的生長速度在兩者之間(2.4±0.32天)。頂011+20%85與01^]+6%1'1(和5%兩者之間的這種差異在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的，并對所有三種培養(yǎng)基進(jìn)行比較以評價可再現(xiàn)趨勢。在圖2中示出，相對于含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中的MSC增殖速率歸ー化的在含TK的培養(yǎng)基中MSC的增殖速率。選擇DMEM+6%TK和5%FFP培養(yǎng)基組合物(稱為Bio-Ι)進(jìn)行進(jìn)ー步的詳細(xì)分析。研究在延長的培育時間段MSC在Bio-I中的擴(kuò)增。，將骨髓細(xì)胞培育在Bio-I(10個供體)中或MDM+20%FBS^f供體)中，得到純的MSC培養(yǎng)物(通過以下示出的測試證實)。細(xì)胞生長直至達(dá)到75%至85%的飽和度(confluency),在傳代期間計數(shù)并以相同的初始密度再次平板接種。以t/Td來計算細(xì)胞倍增，其中t是兩次傳代之間培養(yǎng)的持續(xù)時間(天)，Td是倍增時間。由于生長速度的大的差異，生長在兩種培養(yǎng)基中的MSC不能同時進(jìn)行傳代。因此，MSC的生長動力學(xué)(圖3)以趨勢線表示，所述趨勢線由代表兩次傳代之間的時間段內(nèi)達(dá)到的細(xì)胞倍増量的單個數(shù)據(jù)點構(gòu)建。由于接種是以低細(xì)胞密度實施的，在培育45天之后因為MSC進(jìn)入衰老(數(shù)據(jù)未示出)而沒有分析進(jìn)ー步的傳代步驟。在不同培養(yǎng)基中MSC特異性表面ホ不志物的表征對在上述條件下生長的MSC的表面標(biāo)志物表達(dá)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。使用標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)組合，它被描述為MSC表現(xiàn)型的指征和被接受為ISTH準(zhǔn)則(Dominici，LeBlanc等人，2006)。已知MSC缺乏造血標(biāo)志物⑶34和⑶45的表達(dá)，而⑶73、⑶90和⑶105是高度表達(dá)的。在表3中總結(jié)了對5個供體進(jìn)行比較獲得的數(shù)據(jù)。表3表面標(biāo)志物「DIDM+20%FBSBio-1'CD340.62±0.820.20±0.27'CD450.38±0.560.08±0.03'CD7399.06±1.5999.87±0.24'CD9094.17±2.7299.92±0.05'CD10599.28±1.0799.83±0.18'在含Tk和FFP的培養(yǎng)基中培育明顯改善了所得到的培養(yǎng)物的表型特征。觀察到所有被分析的標(biāo)志物的表達(dá)趨勢(見圖4)。細(xì)胞活性和細(xì)胞形態(tài)通過在FACS分析中的7-AAD染色測定培育在Bio-I中的MSC活性。由來自11個供體的MSC分析計算出的平均活性為97.61±I.26%。此外，看起來在Bio-I中生長的MSC表現(xiàn)為在尺寸和顆粒度方面更均勻的細(xì)胞種群，與在含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中培育的MSC相比(見圖5)尺寸更小，這被認(rèn)為是MSC的更富生理機(jī)能的狀態(tài)。通過顯微鏡分析證實了這種觀察(數(shù)據(jù)未示出)。在Bio-I中牛長的MSC的功能分析在CFU-F(成纖維細(xì)胞克隆形成単位)測試(數(shù)據(jù)未示出)中證明MSC的克隆發(fā)生?？梢哉T導(dǎo)MSC的分化指向成脂細(xì)胞系、成骨細(xì)胞系和成軟骨細(xì)胞系(lineage)(見圖6)。C.Bio-I組合物的進(jìn)ー步研發(fā)和測試在下面的測試中，進(jìn)ー步改進(jìn)兩種Bio-I成分血小板裂解物(TK)和新鮮冰凍血漿(FFP)的制備方法。該改進(jìn)的目的在干，從培養(yǎng)基中除去所有尺寸大于O.22μπι的顆粒，和獲得不含在包含TK和FFP的培養(yǎng)基中可常見的沉淀物的澄清溶液。如下制備起始成分將血小板濃縮物冷凍(_20°C或-80°C)和融化，在18°C、10000Xg下離心20分鐘和在18°C、4000Xg下離心10分鐘，由此獲得血小板裂解物(TK)。使用得到的上清液。在<-35°C下儲存之后將FFP融化。以下描述的所有試驗中，將該成分添加到濃度為6%TK和5%FFP的低葡萄糖DMEM中，所述DMEM中補(bǔ)充有L-谷氨酰胺和肝素。在第一個測試中，如上所述地制備培養(yǎng)基并使其直接通過O.22μm的過濾器。在經(jīng)過濾的培養(yǎng)基中以標(biāo)準(zhǔn)方法培育三個供體的MSC。阻止細(xì)胞生長，并在培育兩周之后將培養(yǎng)基換成未經(jīng)過濾的ー種，之后細(xì)胞重新開始生長(數(shù)據(jù)未示出)。在另ー個測試中，起始成分在分別經(jīng)過離心和過濾步驟之后添加到培養(yǎng)基中。對培養(yǎng)基清晰度進(jìn)行視覺分析(數(shù)據(jù)未示出)并監(jiān)測MSC生長速率。FFP制備的改講保持TK制備方法不變。如下改變FFP的制備I.FFP4000Xg2.FFP4000Xg+100ym3.FFPIOOym4.FFP40μm5.FFP40μm+0.22μm6.FFP40μm+0.45μm制備培養(yǎng)基，并培養(yǎng)MSC12天。培養(yǎng)基樣品4、5和6中生長的細(xì)胞在4天后達(dá)到85%的飽和度，并再次傳代。在胰蛋白酶消化之后計數(shù)MSC并估算其生長速率(圖7-9)。TK制備的改講對在傳統(tǒng)方法制備的TK中和在額外通過O.45μm的過濾器的TK中的MSC生長進(jìn)行比較。如下面指出的改變FFP的制備。估算在這些培養(yǎng)基中培育的MSC的倍增時間，并進(jìn)行顯微鏡分析(圖10-12)。測試經(jīng)由孔較小的過濾器或不同過濾器(8μm、O.8μm和O.2μm)的組合過濾TK的效果。經(jīng)測試的組合都不顯著改變細(xì)胞生長速率(數(shù)據(jù)未示出)。但是，得到的培養(yǎng)基宏觀上無顆粒并且更透明，特別是使用O.8μm和O.2μm過濾器吋。由于不存在沉積的血小板，與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基相比，在經(jīng)過過濾的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞在胰蛋白酶消化之后的細(xì)胞懸浮液中觀察到更少的凝集作用。此外，可以通過對⑶41+細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀來監(jiān)測過濾的效率。在未經(jīng)過濾的TK中，殘留的血小板膜具有錨定MSC的能力，由此形成CD41+信號。該信號在使用小孔的過濾步驟中大部分被除去。圖13中示出了上述情況的實例。對TK或FFP或者兩者實施不同的過濾步驟(圖13，A-C)。隨后對得到的培養(yǎng)基進(jìn)行過濾(圖13，D)。應(yīng)指出，所有用于研究的培養(yǎng)基變化足夠支持細(xì)胞生長(數(shù)據(jù)未示出)。在所有測試中，以未經(jīng)過額外過濾步驟制備的標(biāo)準(zhǔn)Bio-I作為對照。通過O.8μm和O.2μm孔對TK進(jìn)行的過濾，單獨或與FFP過濾步驟組合，導(dǎo)致⑶41+信號的顯著減少(圖13A和C)。此外，這種效果的水平似乎依賴于過濾的效率，因為通過O.8μm和O.2μm孔對TK進(jìn)行的依次過濾比単獨通過O.2μm孔過濾導(dǎo)致更明顯的⑶41+減少(比較圖13C、2和4)。這通過圖13D示出的結(jié)果來支持。通過8μπι孔的過濾沒有引起CD41+信號的顯著減少，僅僅是起到了除去尺寸大的顆粒的作用，并因此使得隨后通過較小孔的過濾更容易。如預(yù)期的，F(xiàn)FP的過濾在CD41+信號方面沒有顯示任何差異。講ー步優(yōu)化改變的FFP制備以下步驟的目的在干，從FFP中除去凝血因子，并防止最后培養(yǎng)基的凝塊和細(xì)胞的凝集以及血小板裂解物殘留物的沉淀。為此在<_35°C溫度下冷凍FFP并在5±3°C溫度下過夜融化FFP。將這些步驟再重復(fù)一次，隨后在4000Xg離心FFP10分鐘。將上清液(無冷沉淀物的FFP)用于Bio-I制備。圖14示出了對在標(biāo)準(zhǔn)Bio-I和在含有無冷沉淀物的FFP的Bio-I中MSC生長的比較。在這兩種進(jìn)行研究的培養(yǎng)基改變方案中的細(xì)胞實現(xiàn)的倍増時間是相當(dāng)?shù)?，而在無冷沉淀物的FFP中的生長稍微得到改進(jìn)。該培養(yǎng)基還幾乎無污染的顆粒，從而不需要額外對FFP進(jìn)行過濾。在FFP中重懸血小板丸粒，隨后制備Bio-I培養(yǎng)基補(bǔ)充物為了實現(xiàn)如上所述的血型抗原和血漿中同族凝集素的最大血型相容性，并排除培養(yǎng)基補(bǔ)充物之間任何最終的不相容性，TK制備中的額外步驟在有些情況下可能是必要的。這在含同族凝集素的自體血漿中采集血小板濃縮物時可能是重要的。必須考慮到關(guān)于FFP的同族凝集素和凝血細(xì)胞濃縮物的血漿的相容性。為此可以如下采集血小板，即在2000Xg離心10分鐘或在5000Xg離心6分鐘，類似于經(jīng)洗滌的血小板。收集丸粒和在FFP(標(biāo)準(zhǔn)的、經(jīng)過濾的或無冷沉淀物的)中重懸并在<-20°C下冷凍?？梢匀缜懊鎸K所描述的來實施之后的制備步驟。所述補(bǔ)充物可以添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(例如DMEM或α-MEM)。根據(jù)期望的最終組成可以調(diào)節(jié)補(bǔ)充物的最終體積和添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的量。例如，如果選擇5%的血小板濃縮物和5%的FFP用于最佳細(xì)胞生長，可以將其少量離心和重懸在200ml的FFP中之后采集200ml血小板?？梢詫⑦@樣生產(chǎn)的補(bǔ)充物添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中得到5%的最終濃度。應(yīng)注意到下列在本文中指出的關(guān)于FFP和TK量的各點。在11的Bio-I中1%的FFP對應(yīng)8.O至10.Oml凝血活性的人類血漿。關(guān)于血小板裂解物，產(chǎn)品中血小板的最終濃度和在Bio-I中血小板的百分?jǐn)?shù)取決于所用的血小板制備方法。(I)來自單釆血液成分法的TK(Apceth):1ml的TK裂解物對應(yīng)6.5XIO8至4.5XIO9的血小板。相應(yīng)地，含有I%TK的11的Bio-I包含的裂解物量等于6.5XIO9至4.5XIOici的血小板。用在Bio-I中的血小板裂解物的百分?jǐn)?shù)必須基于本申請中列出的在起始材料中血小板的量和體積％值來計算。(2)來自全血的血小板裂解物在50至60ml懸浮液中存在45至90XIO9的血小板。參考文獻(xiàn)Blande,eta_L,“Adiposetissuemesenchymalstemcellexpansioninanimalserum-freemediumsupplementedwithautologoushumanplateletlysate，，，Transfusion,Vol.49，Dec.2009；2680-2685.Capelli,etal.(2007)“Humanplateletlysateallowsexpansionandclinicalgradeproductionofmesenchymalstromalceilsfromsmallsamplesof·bonemarrowaspiratesormarrowfilterwashouts.nBoneMarrowTransplant.40(8)785-91.Hornetal.(2010).“Impactofindividualplateletlysatesonisolationandgrowthofhumanmesenchymalstromalcells”Cytotherapy，12:888-898.Kocaoemer，etal.,“HumanABserumandthrombin-activatedplatelet-richplasmaaresuitablealternativestofetalcalfserumfortheexpansionofmesenchymalstemcellsfromadiposetissue”，StemCells,Nov.11,2008；1271-1278.LangerandGawaz，“Plateletsinregenerativemedicine，，，BasicResCardiol103:299-307(2008).Muller,etal.(2006).“Animalserum-freecultureconditionsforisolationandexpansionofmultipotentmesenchymalstromalcellsfromhumanBM.”Cytotherapy8(5):437-44.Salvade,etal.，“CharacterizationofPlateletLysateCulturedMesenchymalStromalCellsandTheirPotentialUseinTissue-EngineeredOsteogenicDevicesfortheTreatmentofBoneDefects.，，TissueEngPartCMethods.15，2009:185-196.Schallmoser，etal.(2008)“Rapidlarge-scaleexpansionoffunctionalmesenchymalstemcellsfromunmanipulatedbonemarrowwithoutanimalserum.’’TissueEngPartCMethods.14(3):185-96.StellosandGawaz，“PlateletinteractionwithprogenitorcellsPotentialimplicationsforregenerativemedicine”，ThrombHaemost2007；98922-929.權(quán)利要求1.細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的1%至10%；(c)濃度為所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基，其中所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的75%至97%，且所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，所得經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力。2.如權(quán)利要求I所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其中根據(jù)下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解；()融化所得經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。3.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其中如下制備步驟(i)的人類血小板濃縮物離心血小板并由此使其成丸；分離成丸的血小板和液相；并在FFP中重懸得到的血小板。4.如權(quán)利要求I3之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其中如下制備部分(b)的FFP濾出液融化人類FFP;以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心所得融化的FFP;和使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。5.如權(quán)利要求I3之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其中如下制備部分(b)的FFP濾出液⑴融化人類FFP；(ii)冷凍融化的人類FFP;(iii)融化所得的人類FFP;和(iv)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心所得融化的FFP。6.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其中在離心步驟(iv)之前至少再一次冷凍和融化來自步驟(iii)的融化的FFP。7.如權(quán)利要求5或6之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其中省略對得自步驟(iv)的液體部分的過濾。8.如權(quán)利要求I7之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基不含動物血清。9.如權(quán)利要求I8之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其中所述血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。10.細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物的總體積的17%至94%;和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物的總體積的6%至83%;其中在將所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞生長培養(yǎng)基時，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力，所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基包含(i)3體積％至25體積％的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物；(ii)濃度為OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。11.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其還包含肝素，其中在將所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞生長培養(yǎng)基時，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力，所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基包含3體積％至25體積％的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，并且含有OU/ml至10U/ml的肝素。12.如權(quán)利要求10和11之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中根據(jù)下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解；()融化所得經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。13.如權(quán)利要求1012之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中根據(jù)下列步驟制備部分(b)的FFP濾出物⑴融化人類FFP；()以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。14.如權(quán)利要求1013之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物不含動物血清。15.如權(quán)利要求1014之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中所述血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。16.無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中根據(jù)下列步驟制備所述血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解；()融化所得經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。17.無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中根據(jù)下列步驟制備所述FFP濾出物⑴融化人類FFP；()以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。18.用于擴(kuò)增人類CD34—干細(xì)胞的試劑盒，其在分開的區(qū)室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中⑴所述裂解物構(gòu)成(a)和(b)合并體積的17%至94%；(ii)所述FFP濾出物構(gòu)成(a)和(b)合并體積的6%至83%，和(iii)在將所述裂解物和所述濾出物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞生長培養(yǎng)基時，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34—干細(xì)胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內(nèi)容物構(gòu)成所述培養(yǎng)基體積的3%至25%;和(ii)肝素的濃度為OU/ml至IOU/ml019.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其在分開的區(qū)室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，和(c)肝素，其中⑴所述裂解物構(gòu)成(a)-(c)合并體積的17%至94%；(ii)所述FFP濾出物構(gòu)成(a)-(c)合并體積的6%至83%，和(iii)在將所述裂解物、所述濾出物和肝素與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基組合，從而構(gòu)成細(xì)胞生長培養(yǎng)基時，所得到的細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且所得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34—干細(xì)胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內(nèi)容物構(gòu)成所述培養(yǎng)基體積的3%至25%;和(ii)肝素的濃度為OU/ml至IOU/ml020.物質(zhì)組合物，其包含(a)人類⑶干細(xì)胞和(b)如權(quán)利要求I9之一所述的細(xì)胞生長培養(yǎng)基。21.用于制備無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物的方法，其包括下列步驟(i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解；(ii)融化所得經(jīng)裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間離心融化的經(jīng)裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質(zhì)成丸的速度和持續(xù)時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少.5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。22.用于制備無直徑大于0.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物的方法，其包括下列步驟⑴融化人類FFP；()以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續(xù)時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。23.用于制備細(xì)胞生長培養(yǎng)基的方法，其包括組合下列物質(zhì)的步驟(a)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的1%至10%；(c)其量足夠產(chǎn)生所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的OU/ml至10U/ml的濃度的肝素；(d)其量足夠產(chǎn)生O.5mM至IOmM的濃度的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基，其中所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的75%至97%，且所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34_干細(xì)胞的擴(kuò)增，且其中得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34_干細(xì)胞保持分化的能力。24.用于擴(kuò)增人類⑶34—干細(xì)胞群的方法，其包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谌鐧?quán)利要求I9之一所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞的步驟。25.人類CD34—干細(xì)胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34—干細(xì)胞群的擴(kuò)增獲得，其中所述擴(kuò)增包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谌鐧?quán)利要求I9之一所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞群。26.人類CD34—干細(xì)胞群，其(i)具有分化的能力，和(ii)由人類CD34—干細(xì)胞群的擴(kuò)增獲得，其中所述擴(kuò)增包括在適當(dāng)?shù)臏囟认略谌鐧?quán)利要求I9之一所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞群。全文摘要本發(fā)明提供細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其包含(a)無直徑大于0.22μm的固體物質(zhì)的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的2％至15％；(b)無直徑大于0.22μm的固體物質(zhì)的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的1％至10％；(c)濃度為所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的0U/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為0.5mM至10mM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細(xì)胞生長的無血清低葡萄糖培養(yǎng)基，其中所述無血清低葡萄糖培養(yǎng)基構(gòu)成所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基的總體積的75％至97％，并且可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細(xì)胞生長培養(yǎng)基允許人類CD34”干細(xì)胞的擴(kuò)增，且其中得到的經(jīng)擴(kuò)增的CD34”干細(xì)胞保持分化的能力。本發(fā)明還提供了相關(guān)的細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充物、無菌的人類血小板裂解物和人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物、試劑盒、含CD34’干細(xì)胞的組合物，以及相關(guān)的生產(chǎn)和細(xì)胞擴(kuò)增方法。文檔編號C12N5/0775GK102686725SQ201080059394公開日2012年9月19日申請日期2010年12月23日優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日發(fā)明者克里斯廷·岡瑟,埃琳娜·阿塞瓦申請人:埃普塞斯有限責(zé)任兩合公司