專利名稱：在蔗糖上生長(zhǎng)的重組破囊壺菌和其組合物、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及在蔗糖上生長(zhǎng)的重組破囊壺菌和包含所述重組破囊壺菌的細(xì)胞培養(yǎng)物，以及使用所述重組破囊壺菌生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物、生物質(zhì)、微生物油、組合物和生物燃料的方法。
背景技術(shù)：
脂肪酸基于碳鏈長(zhǎng)度和飽和特性分類。根據(jù)存在于鏈中的碳的數(shù)目將脂肪酸稱為短鏈、中鏈或長(zhǎng)鏈脂肪酸，當(dāng)碳原子間不存在雙鍵時(shí)稱為飽和脂肪酸，而當(dāng)存在雙鍵時(shí)稱為不飽和脂肪酸。當(dāng)僅存在一個(gè)雙鍵時(shí)不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸是單不飽和的，而當(dāng)存在多于一個(gè)雙鍵時(shí)是多不飽和的。多不飽和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一個(gè)雙鍵的位置分類Ω-3(η-3)脂肪酸在第三個(gè)碳處包含第一個(gè)雙鍵，而Ω-6(η-6)脂肪酸在第六個(gè)碳處包含第一個(gè)雙鍵。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是Ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，具有22個(gè)碳的鏈長(zhǎng)和6個(gè)雙鍵，通常標(biāo)為“22: 6η-3”。其他Ω -3LC-PUFA包括標(biāo)為“20: 5η_3”的二十碳五烯酸(“ΕΡΑ”)和標(biāo)為“22:5η-3”的Ω-3 二十二碳五烯酸(“DPA η_3”)。DHA和EPA已被稱為“必需”脂肪酸。Q-6LC-PUFA包括標(biāo)為“20: 4n_6”的花生四烯酸(“ARA”)和標(biāo)為“22:5n-6”的Ω-6 二十二碳五烯酸(“DPA n_6，，)。Ω-3脂肪酸是生物學(xué)上重要的分子，由于其存在于細(xì)胞膜而影響細(xì)胞生理學(xué)，調(diào)節(jié)生物活性化合物的生成和基因表達(dá)，且充當(dāng)生物合成底物。Roche，H. Μ.，Proc. Nutr.Soc. 58 :397-401(1999)。例如，DHA占人大腦皮層中脂質(zhì)的約15%_20%、并占視網(wǎng)膜中月旨質(zhì)的約30%-60%，其集中于睪丸和精子中，且是乳汁中的重要成分。Jean-Pascal Berge和Gilles Barnathan，“來(lái)自海洋生物脂質(zhì)的脂肪酸分子生物多樣性，作為生物標(biāo)記的作用，生物活性化合物和經(jīng)濟(jì)方面”(Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds， andEconomical Aspects)，《海洋生物技術(shù)》(Marine Biotechnology) I 49 (Τ· Scheper 編，2005) o DHA占大腦中Ω-3脂肪酸的多達(dá)97%和視網(wǎng)膜中Ω-3脂肪酸的多達(dá)93%。此外，DHA對(duì)胎兒和嬰兒發(fā)育以及維持成人中的認(rèn)知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在內(nèi)的Ω -3脂肪酸還具有抗炎特性。參見(jiàn)例如同上以及Simopoulos, Α. P.，J. Am. Coll. Nutr. 21 495-595(2002)。特別的是，EPA與花生四烯酸競(jìng)爭(zhēng)通過(guò)環(huán)氧合酶和脂氧合酶進(jìn)行的二十烷類如前列腺素和白三烯的合成。同上。由于Ω-3脂肪酸不在人體內(nèi)從頭合成，這些脂肪酸必須獲得自營(yíng)養(yǎng)源。破囊壺菌(thraustochytrids)是破囊壺菌目(Thraustochytriales)微生物，其被認(rèn)為是脂質(zhì)生產(chǎn)的替代來(lái)源。例如，已經(jīng)報(bào)道了破囊壺菌菌種的菌株以占該生物體所產(chǎn)生總脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5，130,242號(hào)；Huang，J.等，J. Am. Oil. Chem. Soc. 78 :605-610(2001)；和 Huang, J.等，Mar. Biotechnol. 5 450-457(2003)，以整體引用的方式并入本文。破囊壺菌還被認(rèn)為是生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)來(lái)源。參見(jiàn)例如美國(guó)公開(kāi)第2009/0064567號(hào)和WO 2008/067605，以整體引用的方式并入本文。雖然破囊壺菌代謝葡萄糖和/或果糖，它們是蔗糖的兩個(gè)糖成分，但是其似乎無(wú)法天然代謝鹿糖。參見(jiàn)，例如，Aki等，JAOCS 80:789-794(2003) ;Yokochi等，Appl.Microbiol.Biotechnol. 49:72-76(1998) ；Honda 等，Mycol. Res. 4:439-448(1998)；Singh, World J. of Microbiology 12:76-81(1996) ；Goldstein, American J. of Botany50:271-279(1963);和美國(guó)專利第5，340，742號(hào)。由此，破囊壺菌培養(yǎng)，包括商業(yè)和工業(yè)培養(yǎng)，目前需要葡萄糖漿作為碳源和能 源，而不是更廉價(jià)的含有蔗糖的碳水化合物來(lái)源。對(duì)于產(chǎn)生能夠在替代碳源如蔗糖上生長(zhǎng)的破囊壺菌以在商業(yè)和工業(yè)應(yīng)用中使用的需求一直存在。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)破囊壺菌細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，包括(a)以包含編碼異源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化破囊壺菌細(xì)胞，并(b)在包含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的破囊壺菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，蔗糖酶是轉(zhuǎn)化酶。在一些實(shí)施方案中，蔗糖酶可操作地與信號(hào)肽連接。在一些實(shí)施方案中，編碼異源蔗糖酶的多核苷酸序列與選自下組的序列是至少90%相同的編碼登錄號(hào)P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；編碼登錄號(hào)P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以供在裂殖壺菌屬(Schizochytrium)中表達(dá)；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括以包含編碼異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化破囊壺菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，編碼異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列與選自下組的序列是至少90%相同的登錄號(hào)L47346或X69165的多核苷酸序列；和經(jīng)密碼子優(yōu)化以供在裂殖壺菌屬中表達(dá)的登錄號(hào)L47346或X69165的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌是裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬(Thraustochytrium)的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)所述方法生產(chǎn)的破囊壺菌細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明也涉及包含含有編碼異源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子的破囊壺菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，蔗糖酶是轉(zhuǎn)化酶。在一些實(shí)施方案中，蔗糖酶可操作地與信號(hào)肽連接。在一些實(shí)施方案中，編碼異源蔗糖酶的多核苷酸序列與選自下組的序列是至少90%相同的編碼登錄號(hào)P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；編碼登錄號(hào)P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以供在裂殖壺菌屬中表達(dá)；和SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:4的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列與選自下組的序列是至少90%相同的登錄號(hào)L47346或X69165的多核苷酸序列；和經(jīng)密碼子優(yōu)化以供在裂殖壺菌屬中表達(dá)的登錄號(hào)L47346或X69165的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌是裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬的。本發(fā)明也涉及一種破囊壺菌培養(yǎng)物，其包含(a)本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞，和(b)包含蔗糖作為碳源的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)破囊壺菌生物質(zhì)的方法，該方法包括(a)將本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞在包含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并(b)從所述培養(yǎng)基收獲生物質(zhì)。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)微生物油的方法，該方法包括(a)將本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞在包含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以生成生物質(zhì)，并(b)從所述生物質(zhì)提取油。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)用于動(dòng)物或人的食品、化妝品、工業(yè)組合物、或藥物組合物的方法，該方法包括(a)將本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞在包含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，(b)從所述培養(yǎng)基收獲生物質(zhì)，并(C)從所述生物質(zhì)制備食品、化妝品、工業(yè)組合物、或藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括從生物質(zhì)提取油并從所述油制備食品、化妝品、工業(yè)組合物、或藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述食品是嬰兒配方食品。在一些實(shí)施方案中，所述嬰兒配方食品適合早產(chǎn)兒。在一些實(shí)施方案中，所述食品是牛奶、飲料、治療性飲品、營(yíng)養(yǎng)飲品或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述食品是用于動(dòng)物或人食物的添加劑。在一些實(shí)施方案中，所述食品是營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。在一些實(shí)施方案中，所述食品是動(dòng)物飼料。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物飼料是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物飼料是家畜飼料、動(dòng)物園動(dòng)物飼料、役畜飼料、牲畜飼料或其組合。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)生物 燃料的方法，該方法包括(a)將本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞在包含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以生成生物質(zhì)，(b)從所述生物質(zhì)提取油，并(c)通過(guò)對(duì)油進(jìn)行酯交換(transesterifying),裂化油，經(jīng)由熱解聚加工油，將油加入石油精煉過(guò)程，或其組合生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)油進(jìn)行酯交換生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，生物燃料是生物柴油。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)裂化油生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，生物燃料是噴氣生物燃料。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)經(jīng)由熱解聚加工油生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，生物燃料是可再生柴油。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將油加入石油精煉過(guò)程生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，生物燃料是共處理的可再生柴油(co-processed renewable diesel)。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯不了裂殖壺菌屬的密碼子選擇表。圖2 顯示了 pSchiz-EPCT(+)-slSuc2_CL0076 的質(zhì)粒圖譜，也稱為 pCL0076 (SEQ IDNO:2)。圖3顯示了來(lái)自在蔗糖-SSFM上生長(zhǎng)的用pCL0076轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌屬菌種ATCC20888的培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀的干重(g/L)。將轉(zhuǎn)化體稱為1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、
3-21、4-1、4-24和4_31?！皩?duì)照”是指在葡萄糖-SSFM上生長(zhǎng)的野生型裂殖壺菌屬菌種ATCC20888細(xì)胞。
圖4顯示了來(lái)自在蔗糖-SSFM上生長(zhǎng)的用pCL0076轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌屬菌種ATCC20888的培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀中的脂肪含量(以占干生物質(zhì)的重量％表示)。將轉(zhuǎn)化體稱為1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24 和 4-310 “對(duì)照”是指在葡萄糖-SSFM 上生長(zhǎng)的野生型裂殖壺菌屬菌種ATCC20888細(xì)胞。圖5顯示了在蔗糖-SSFM上生長(zhǎng)的用pCL0076轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌屬菌種ATCC 20888的培養(yǎng)物隨著時(shí)間(天)測(cè)量的細(xì)胞沉淀的干重(g/L)。將轉(zhuǎn)化體稱為1-3和3-5?！皩?duì)照”是指在葡萄糖-SSFM上生長(zhǎng)的野生型裂殖壺菌屬菌種ATCC 20888細(xì)胞。圖6顯示了來(lái)自在蔗糖-SSFM上生長(zhǎng)的兩種轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀中的脂肪含量(以占干生物質(zhì)的重量％表示)。將轉(zhuǎn)化體稱為1-3和3-5。“對(duì)照”是指在葡萄糖-SSFM上生長(zhǎng)的野生型裂殖壺菌屬菌種ATCC 20888細(xì)胞。圖7顯示了來(lái)自用PCL0076轉(zhuǎn)化并在蔗糖-SSFM上生長(zhǎng)2天或7天后收獲的裂殖壺菌屬菌株B76-32的培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀的干重(g/L)。2118*是指在葡萄糖-SSFM上生長(zhǎng)的野生型裂殖壺菌屬菌種ATCC 20888細(xì)胞的亞分離株。B76-32**是指在葡萄糖-SSFM上生長(zhǎng)的B76-32親本株。圖8顯示了來(lái)自用PCL0076轉(zhuǎn)化并在蔗糖-SSFM上生長(zhǎng)2天或7天后收獲的裂殖壺菌屬菌株B76-32的培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀的脂肪含量。每個(gè)樣品的最右邊的一列顯示以占干生物質(zhì)的重量％表示的脂肪含量。每個(gè)樣品的最左邊的一列顯示由?；?8個(gè)或更少的碳(淺灰色)或20個(gè)或更多的碳(中度灰色)組成的總脂肪的％。2118*是指在葡萄糖-SSFM上生長(zhǎng)的野生型裂殖壺菌屬菌種ATCC 20888細(xì)胞的亞分離株。B76-32**是指在葡萄糖-SSFM上生長(zhǎng)的B76-32親本株。

圖9A顯示了轉(zhuǎn)化酶蛋白的Western印跡，而圖9B顯示了相應(yīng)的考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。如Western印跡頂部所示，釀酒酵母(S. cerevisiae)轉(zhuǎn)化酶對(duì)照和PCL0076轉(zhuǎn)化體1-3的3天培養(yǎng)物的上清分別以5 μ g、2. 5 μ g、1. 25μ g、和0. 625 μ g的量上樣。圖1OA顯示了由作為蔗糖濃度的函數(shù)的反應(yīng)速率說(shuō)明的轉(zhuǎn)化酶活性測(cè)定。圖1OB顯示了用于計(jì)算Km和Vmax的標(biāo)準(zhǔn)Lineweaver-Burk圖。圖11顯示了在裂殖壺菌屬分泌蛋白上檢出的N-聚糖結(jié)構(gòu)，如通過(guò)全甲基化的N-聚糖的NS1-總離子映射(NS1-total ion mapping)所測(cè)定的。圖12顯示了通過(guò)全甲基化N-聚糖的NS1-總離子映射獲得的聚糖種類表。圖13 顯示了 pCL0120(SEQ ID NO:5)的質(zhì)粒圖譜。圖14顯示了密碼子優(yōu)化的核酸序列(SEQ ID NO:4)，其編碼融合的來(lái)自裂殖壺菌屬的SECl信號(hào)肽與來(lái)自黑曲霉(Aspergillus niger)的成熟Sucl轉(zhuǎn)化酶(GenBank登錄號(hào) S33920)。圖15 顯示了 pCL0137_EPCT(+)-slSucl 的質(zhì)粒圖譜，也稱為 pCL0137。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在蔗糖上生長(zhǎng)的重組破囊壺菌和包含所述重組破囊壺菌的細(xì)胞培養(yǎng)物，以及使用所述重組破囊壺菌生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物、生物質(zhì)、微生物油、組合物和生物燃料的方法。破囊壺菌
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“破囊壺菌”是指破囊壺菌目(Thraustochytriales)的任何成員，其包括破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)。破囊壺菌當(dāng)前的分類學(xué)地位可以簡(jiǎn)述如下界管毛生物界(Stramenopila)(Chromista)門網(wǎng)粘菌(Labyrinthulomycota)(不等毛門(Heterokonta))綱網(wǎng)粘菌綱(Labyrinthulomycetes) (Labyrinthulae)目網(wǎng)粘菌目(Labyrinthulales)科網(wǎng)粘菌科(Labyrinthulaceae)目破囊壺菌目(Thraustochytriales)科破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)對(duì)于本發(fā)明的目的而言，作為破囊壺菌描述的菌株包括如下生物體目破囊壺菌目；科破囊壺菌科；屬破囊壺菌屬(種菌種，arudimentale, aureum，benthicola，globosum， kinnei， motivum， multirudimentale, pachydermum， proliferum， roseum，striatum)、吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)(種菌種，amoeboidea，kerguelensis，minuta，profunda， radiata， sailens， sarkariana， schizochytrops, visurgensis， yorkensis)、裂殖壺菌屬(種菌種，aggregatum，limnaceum，mangrovei, minutum，octosporum)，Japonochytrium 屬(種菌種、marinum)、Aplanochytrium 屬(種菌種、haliotidis，kerguelensis，profunda, stocchinoi)、Althornia 屬(種菌種、crouchii)、或 Elina 屬(種菌種、marisalba，sinorifica)。出于本發(fā)明的目的，吾肯氏壺菌屬中描述的物種將被看作是破囊壺菌屬的成員。Aurantiochytrium、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium和Sicyoido chytrium是本發(fā)明包括的額外的屬。破囊壺菌屬的菌株包括但不限于，保藏菌株P(guān)TA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、 PTA-9695、 PTA-9696、 PTA-9697、 PTA-9698、 PTA-10208、 PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、破囊壺菌屬菌種(23B) (ATCC 20891) ；Thraustochytriumstriatum (Schneider) (ATCC 24473) ；Thraustochytrium aureum(Goldstein) (ATCC34304) ；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和 Japonochytrium 屬菌種(LI) (ATCC 28207)。裂殖壺菌屬包括但不限于 Schizochytrium aggregatum、Schizochytrium limacinum、裂殖壺菌屬菌種(S31) (ATCC 20888)、裂殖壺菌屬菌種(S8)(ATCC20889)、裂殖壺菌屬菌種(LC-RM) (ATCC 18915)、裂殖壺菌屬菌種(SR 21)，保藏菌株ATCC 28209 和保藏的 Schizochytrium limacinum 菌株 IFO 32693。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞是Sicyoidochytrium或破囊壺菌屬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌的屬選自裂殖壺菌屬菌種、Schizochytriumaggregatum、Schizochytrium limacinum、Schizochytrium minutum、破囊壺菌屬菌種、Thraustochytrium striatum、Thraustochytrium aureum、Thraustochytrium roseum、Japonochytrium屬菌種及其衍生株。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指能夠?qū)⒑怂岱肿?即，重組核酸分子)插入本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞的任何方法。在微生物體系中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”用來(lái)描述由于微生物獲得外源核酸所致的一種遺傳性改變而且基本上與術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”同義。用于將核酸分子引入破囊壺菌細(xì)胞的合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)，包括但不限于粒子轟擊、電穿孔、顯微注射，脂轉(zhuǎn)染、吸附、感染和原生質(zhì)體融合。雖然短語(yǔ)“核酸分子”主要是指物理的核酸分子而短語(yǔ)“核酸序列”或“多核苷酸序列”主要是指核酸分子中的核苷酸序列，但所述短語(yǔ)可以互換使用，尤其是能夠編碼蛋白的核酸分子、多核苷酸序列、或核酸序列。在一些實(shí)施方案中，利用重組DNA技術(shù)(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增或克隆)或化學(xué)合成產(chǎn)生本文所述的分離的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，“分離的”核酸分子是已自其天然環(huán)境移出的核酸分子(即已經(jīng)過(guò)人為操作)，其天然環(huán)境是該核酸分子在自然界中存在于其中的基因組或染色體。如此，“分離的”并不一定反映核酸分子已被純化的程度，但表示該分子不包括該核酸分子在自然界中存在于其中的整個(gè)基因組或整個(gè)染色體。分離的核酸分子可以包括DNA、RNA (例如mDNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。分離的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于，天然的等位基因變體和修飾的核酸分子，其中已經(jīng)將核苷酸以如下方式插入、刪除、取代和/或倒置，該方式使得這樣的修飾在所編碼的肽或蛋白的序列、功能和/或生物活性上提供期望的效果。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括單鏈多肽分子以及其中單獨(dú)的組分多肽通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)手段連接的多重多肽復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)“多肽”包括兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽，通常具有超過(guò)5，10或20個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，本文所述的多肽是異源多肽。本文使用的術(shù)語(yǔ)“異源”是指多肽(或多核苷酸)序列，例如，其不在本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞中天然存在。裂殖壺菌屬天然使用己糖和甘油而非蔗糖作為碳源。檢查裂殖壺菌屬的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有揭示蔗糖分解代謝的初始步驟所需的基因，這支持了通常的發(fā)現(xiàn)，即破囊壺菌代謝葡萄糖和/或果糖，它們是蔗糖的兩個(gè)糖組分，但天然地不代謝蔗糖。參見(jiàn)，例如，Aki等，JAOCS 80:789-794(2003) ;Yokochi 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:72-76 (1998)；Honda 等，Mycol. Res. 4:439-448 (1998) ；Singh, World J. of Microbiology12:76-81(1996) ；Goldstein, American J. of Botany 50:271-279(1963);和美國(guó)專利第5，340，742 號(hào)。本發(fā)明涉及用包含編碼與蔗糖代謝相關(guān)的異源多肽的多核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述多肽是異源多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞包含一種或多種核酸分子，所述核酸分子包含一種或多種編碼一種或多種異源蔗糖酶、異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、或其組合的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼分泌的蔗糖酶的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼胞質(zhì)蔗糖酶的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞包含一種或多種核酸分子，所述核酸分子包含一種或多種編碼一種或多種異源蔗糖酶和一種異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞包含一種或多種核酸分子，所述核酸分子包含一種或多種編碼一種異源胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶和一種異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞包含一種或多種核酸分子，所述核酸分子包含一種或多種編碼一種異源分泌性轉(zhuǎn)化酶和一種異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞包含一種或多種核酸分子，所述核酸分子包含一種或多種編碼一種異源胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶、一種異源分泌性轉(zhuǎn)化酶和一種異源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列。 在一些實(shí)施方案中，多核苷酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以使在破囊壺菌細(xì)胞中的翻譯效率最大化。在一些實(shí)施方案中，將編碼蔗糖酶、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其組合的多核苷酸序列整合到破囊壺菌細(xì)胞的基因組中。在一些實(shí)施方案中，將編碼蔗糖酶、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其組合的多核苷酸序列穩(wěn)定整合到破囊壺菌細(xì)胞的基因組中。蔗糖酶是催化糖苷鍵的水解以產(chǎn)生兩個(gè)較小的糖的、稱為糖苷水解酶(也稱為糖苷酶)的酶家族的一部分。正如本文所述，“蔗糖酶”是催化蔗糖(又稱saccharose或食用糖)水解為果糖和葡萄糖的酶。在某些實(shí)施方案中，蔗糖酶是轉(zhuǎn)化酶、蔗糖酶-異麥芽糖酶、果聚糖酶、sacridase、β -果糖苷酶、β _呋喃果糖苷酶、果糖水解酶、鹿糖酶(saccharase)、菊糖酶、蔗糖α -葡糖水解酶、a -D-葡糖苷酶、或其組合。在一些實(shí)施方案中，鹿糖酶是來(lái)自釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶SUC2 ;來(lái)自發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的轉(zhuǎn)化酶SacC;來(lái)自畢赤酵母屬(Pichia)的轉(zhuǎn)化酶INVl ;來(lái)自德巴利酵母屬(Debaryomyces)的轉(zhuǎn)化酶INV ;來(lái)自曲霉屬(Aspergillus)的鹿糖酶Sucl ;來(lái)自其他真菌、原生動(dòng)物、藻類、植物或真核生物來(lái)源的蔗糖酶；或其任何組合。在某些實(shí)施方案中，蔗糖酶來(lái)自原核生物來(lái)源，如棒狀桿菌型細(xì)菌(coryneform bacteria)或大腸桿菌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞中表達(dá)的蔗糖酶包含不同于在所述蔗糖酶所源自的生物體中表達(dá)時(shí)的糖基化模式。在一些實(shí)施方案中，在破囊壺菌細(xì)胞中表達(dá)的蔗糖酶是包含高-甘露寡糖的糖蛋白。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞還包含編碼糖化纖維素原料(例如甘蔗)所需的酶的多核苷酸序列。參見(jiàn)，例 如，美國(guó)2009/0064567，其以整體引用的方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞還包含編碼果糖激酶、葡糖激酶、己糖激酶、或其組合的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，用于在破囊壺菌細(xì)胞中產(chǎn)生蔗糖酶、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、或其組合的表達(dá)系統(tǒng)包含源自破囊壺菌序列的調(diào)節(jié)元件。在一些實(shí)施方案中，用于在破囊壺菌細(xì)胞中產(chǎn)生蔗糖酶、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、或其組合的表達(dá)系統(tǒng)包含源自非破囊壺菌序列的調(diào)節(jié)兀件，包括源自非破囊壺菌藻類序列的序列。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)包含編碼鹿糖酶、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、或其二者的組合的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列與任意啟動(dòng)子序列、任意終止子序列、和/或任意在破囊壺菌細(xì)胞中有功能的其他調(diào)節(jié)序列可操作地連接。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)包含編碼胞質(zhì)表達(dá)的蔗糖酶和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸序列。可以使用誘導(dǎo)型或組成型活性的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括但不限于美國(guó)申請(qǐng)
發(fā)明者J.C.利普梅爾, K.E.埃普特, J.M.漢森 申請(qǐng)人:Dsm Ip資產(chǎn)公司