專利名稱：在木糖上生長(zhǎng)的重組破囊壺菌和其組合物、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及在木糖上生長(zhǎng)的重組破囊壺菌和包含所述重組破囊壺菌的細(xì)胞培養(yǎng)物，以及使用所述重組破囊壺菌生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物、生物質(zhì)、微生物油、組合物和生物燃料的方法。
背景技術(shù)：
脂肪酸基于碳鏈長(zhǎng)度和飽和特性分類。根據(jù)存在于鏈中的碳的數(shù)目將脂肪酸稱為短鏈、中鏈或長(zhǎng)鏈脂肪酸，當(dāng)碳原子間不存在雙鍵時(shí)稱為飽和脂肪酸，而當(dāng)存在雙鍵時(shí)稱為不飽和脂肪酸。當(dāng)僅存在一個(gè)雙鍵時(shí)不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸是單不飽和的，而當(dāng)存在多于一個(gè)雙鍵時(shí)是多不飽和的。多不飽和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一個(gè)雙鍵的位置分類Ω-3(η-3)脂肪酸在第三個(gè)碳處包含第一個(gè)雙鍵，而Ω-6(η-6)脂肪酸在第六個(gè)碳處包含第一個(gè)雙鍵。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是Ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，具有22個(gè)碳的鏈長(zhǎng)和6個(gè)雙鍵，通常標(biāo)為“22: 6η-3”。其他Ω -3LC-PUFA包括標(biāo)為“20: 5η_3”的二十碳五烯酸(“ΕΡΑ”)和標(biāo)為“22:5η-3”的Ω-3 二十二碳五烯酸(“DPA η_3”)。DHA和EPA已被稱為“必需”脂肪酸。Q-6LC-PUFA包括標(biāo)為“20: 4n_6”的花生四烯酸(“ARA”)和標(biāo)為“22:5n-6”的Ω-6 二十二碳五烯酸(“DPA n_6，，)。Ω-3脂肪酸是生物學(xué)上重要的分子，由于其存在于細(xì)胞膜而影響細(xì)胞生理學(xué)，調(diào)節(jié)生物活性化合物的生成和基因表達(dá)，且充當(dāng)生物合成底物。Roche，H. Μ.，Proc. Nutr.Soc. 58 :397-401(1999)。例如，DHA占人大腦皮層中脂質(zhì)的約15%_20%、并占視網(wǎng)膜中月旨質(zhì)的約30%-60%，其集中于睪丸和精子中，且是乳汁中的重要成分。Jean-Pascal Berge和Gilles Barnathan，“來(lái)自海洋生物脂質(zhì)的脂肪酸分子生物多樣性，作為生物標(biāo)記的作用，生物活性化合物和經(jīng)濟(jì)方面”(Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds， andEconomical Aspects)，《海洋生物技術(shù)》(Marine Biotechnology) I 49 (Τ· Scheper 編，2005) o DHA占大腦中Ω-3脂肪酸的多達(dá)97%和視網(wǎng)膜中Ω-3脂肪酸的多達(dá)93%。此外，DHA對(duì)胎兒和嬰兒發(fā)育以及維持成人中的認(rèn)知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在內(nèi)的Ω -3脂肪酸還具有抗炎特性。參見例如同上以及Simopoulos, Α. P.，J. Am. Coll. Nutr. 21 495-595(2002)。特別的是，EPA與花生四烯酸競(jìng)爭(zhēng)通過(guò)環(huán)氧合酶和脂氧合酶進(jìn)行的二十烷類如前列腺素和白三烯的合成。同上。由于Ω-3脂肪酸不在人體內(nèi)從頭合成，這些脂肪酸必須獲得自營(yíng)養(yǎng)源。破囊壺菌(thraustochytrids)是破囊壺菌目(Thraustochytriales)微生物，其被認(rèn)為是脂質(zhì)生產(chǎn)的替代來(lái)源。例如，已經(jīng)報(bào)道了破囊壺菌菌種的菌株以占該生物體所產(chǎn)生總脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。參見例如美國(guó)專利第5，130，242號(hào)；Huang, J.等，J. Am. Oil. Chem. Soc. 78 :605-610 (2001) ；Huang, J.等，Mar. Biotechnol. 5 450-457(2003)，以整體引用的方式并入本文。破囊壺菌還被認(rèn)為是生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)來(lái)源。參見例如美國(guó)公開第2009/0064567號(hào)和WO 2008/067605，以整體引用的方式并入本文。植物生物質(zhì)由三種主要組分構(gòu)成；纖維素、半纖維素、和木質(zhì)素。纖維素主要是由葡萄糖聚合物構(gòu)成，半纖維素富含木糖聚合物，而木質(zhì)素主要 是由復(fù)雜的多酚類化合物構(gòu)成。來(lái)自這些生物質(zhì)級(jí)分的碳水化合物被統(tǒng)稱為木素纖維素糖，并已被作為乙醇發(fā)酵的低成本可再生原料的來(lái)源進(jìn)行了研究。來(lái)自例如甘蔗渣、玉米秸桿、柳枝稷、麥秸桿、硬木和軟木等來(lái)源的植物半纖維素可以是富含木糖的糖的來(lái)源。可以通過(guò)酸水解和/或酶消化從半纖維素釋放這些糖類。雖然破囊壺菌代謝葡萄糖和/或果糖，但是其似乎無(wú)法天然代謝木糖。參見，例如，Honda 等，Mycol. Res. 4:439-448(1998) ；Goldstein, American J. of Botany 50:271-279 (1963) ；Damare, Indian Journal of Marine Sciences 35:326-340 (2006)。由此，破囊壺菌培養(yǎng)，包括商業(yè)和工業(yè)培養(yǎng)，目前需要葡萄糖漿作為碳源和能源。對(duì)于產(chǎn)生能夠在替代碳源如木糖上生長(zhǎng)的破囊壺菌以在商業(yè)和工業(yè)應(yīng)用中使用的需求一直存在。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)破囊壺菌細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，包括(a)用包含編碼與木糖輸入、木糖向木酮糖轉(zhuǎn)換、木酮糖磷酸化、或其組合相關(guān)的多肽的多核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化破囊壺菌細(xì)胞，并(b)在包含木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的破囊壺菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，與木糖輸入、木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換、或木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽選自下組異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木糖異構(gòu)酶、異源木酮糖激酶、異源木糖還原酶、異源木糖醇脫氫酶及其組合。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞表達(dá)異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木糖異構(gòu)酶、和異源木酮糖激酶。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞表達(dá)異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木糖還原酶、異源木糖醇脫氫酶、和異源木酮糖激酶。在一些實(shí)施方案中，編碼與木糖輸入相關(guān)的多肽的多核苷酸序列與選自下組的序列是至少90%相同的登錄號(hào)AJ875406、BT015128、AF127802、AJ249910、X59465、或 X55392 的多核苷酸序列；編碼登錄號(hào) CAB76571的氨基酸序列的多核苷酸序列；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、或SEQ ID NO: 23的多核苷酸序列，及其組合。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌是裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)所述方法生產(chǎn)的破囊壺菌細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明也涉及包含含有編碼與木糖輸入、木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換、木酮糖磷酸化、或其組合相關(guān)的多肽的多核苷酸序列的核酸分子的破囊壺菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，與木糖輸入、木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換、木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽選自下組異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木糖異構(gòu)酶、異源木酮糖激酶、異源木糖還原酶、異源木糖醇脫氫酶及其組合。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞表達(dá)異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木糖異構(gòu)酶、和異源木酮糖激酶。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞表達(dá)異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木酮糖激酶、異源木糖還原酶、和異源木糖醇脫氫酶。在一些實(shí)施方案中，編碼木糖與輸入相關(guān)的多肽的多核苷酸序列與選自下組的序列是至少90%相同的登錄號(hào)AJ875406、BT015128、AF127802、AJ249910、X59465、或X55392的多核苷酸序列；編碼登錄號(hào)CAB76571的氨基酸序列的多核苷酸序列；SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:23的多核苷酸序列，及其組合。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌是裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬的。本發(fā)明也涉及一種破囊壺菌培養(yǎng)物，其包含(a)本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞，和(b)包含木糖作為碳源的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)破囊壺菌生物質(zhì)的方法，該方法包括(a)將本文所述的 任何一種破囊壺菌細(xì)胞在包含木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并(b)從所述培養(yǎng)基收獲生物質(zhì)。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)微生物油的方法，該方法包括(a)將本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞在包含木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以生成生物質(zhì)，并(b)從所述生物質(zhì)提取油。 本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)用于動(dòng)物或人的食品、化妝品、工業(yè)組合物、或藥物組合物的方法，該方法包括(a)將本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞在包含木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，(b)從所述培養(yǎng)基收獲生物質(zhì)，并(C)從所述生物質(zhì)制備食品、化妝品、工業(yè)組合物、或藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括從生物質(zhì)提取油并從所述油制備食品、化妝品、工業(yè)組合物、或藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述食品是嬰兒配方食品。在一些實(shí)施方案中，所述嬰兒配方食品適合早產(chǎn)兒。在一些實(shí)施方案中，所述食品是牛奶、飲料、治療性飲品、營(yíng)養(yǎng)飲品或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述食品是用于動(dòng)物或人食物的添加劑。在一些實(shí)施方案中，所述食品是營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。在一些實(shí)施方案中，所述食品是動(dòng)物飼料。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物飼料是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物飼料是家畜飼料、動(dòng)物園動(dòng)物飼料、役畜飼料、牲畜飼料或其組合。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)生物燃料的方法，該方法包括(a)將本文所述的任何一種破囊壺菌細(xì)胞在包含木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以生成生物質(zhì)，(b)從所述生物質(zhì)提取油，并(c)通過(guò)對(duì)油進(jìn)行酯交換(transesterifying),裂化油，經(jīng)由熱解聚加工油，將油加入石油精煉過(guò)程，或其組合生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)油進(jìn)行酯交換生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，生物燃料是生物柴油。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)裂化油生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，生物燃料是噴氣生物燃料。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)經(jīng)由熱解聚加工油生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，生物燃料是可再生柴油。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將油加入石油精煉過(guò)程生產(chǎn)生物燃料。在一些實(shí)施方案中，生物燃料是共處理的可再生柴油(co-processed renewable diesel)。附圖簡(jiǎn)述
圖I 顯示了 pCL0120(SEQ ID NO: 12)的質(zhì)粒圖譜。圖2顯不了裂殖壺菌屬的密碼子選擇表。圖3顯示了密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，其編碼中間假絲酵母(Candida intermedia)的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GXS1,與 GenBank 登錄號(hào) AJ875406 對(duì)應(yīng)。圖4顯示了密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)，其編碼擬南芥屬(Arabidopsis thaliana)的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 At5gl7010,與 GenBank 登錄號(hào) BT015128 對(duì)應(yīng)。圖5 顯示了 pCL0130(SEQ ID NO: 14)的質(zhì)粒圖譜。圖6 顯示了 pCL0131(SEQ ID NO: 15)的質(zhì)粒圖譜。圖7A和圖7B顯示了 pCL0121的多核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。該載體賦予對(duì)抗生素ZE0CIN 的抗性并還包含編碼eGFP的分泌形式的基因。 圖8A和圖8B顯示了 pCL0122的多核苷酸序列(SEQ ID N0:5)。該載體賦予對(duì)抗生素巴龍霉素的抗性并還包含編碼eGFP的分泌形式的基因。圖9顯示了 pCL0121的質(zhì)粒圖譜。

圖10顯示了 pCL0122的質(zhì)粒圖譜。圖11顯示了密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列(SEQ ID N0:6)，其編碼瘤胃真菌屬菌種(Piromyces sp. )E2木糖異構(gòu)酶蛋白“XylA”，與GenBank登錄號(hào)CAB76571對(duì)應(yīng)。圖12顯示了密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列(SEQ ID NO:7)，其編碼瘤胃真菌屬(Piromyces sp. )E2木酮糖激酶蛋白“XylB”,與GenBank登錄號(hào)AJ249910對(duì)應(yīng)。圖13 顯示了 pCL0132(SEQ ID NO: 16)的質(zhì)粒圖譜。圖14 顯示了 pCL0136(SEQ ID NO:20)的質(zhì)粒圖譜。圖15顯示了密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列(SEQ ID NO: 21)，其編碼樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)木糖還原酶蛋白“Xyll”,與GenBank登錄號(hào)X59465對(duì)應(yīng)。圖16顯示了密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列(SEQ ID NO:22)，其編碼樹干畢赤酵母木酮糖激酶蛋白“Xuk3”，與GenBank登錄號(hào)AF127802對(duì)應(yīng)。圖17 顯示了 pCL0133(SEQ ID NO: 17)的質(zhì)粒圖譜。圖18 顯示了 pCL0135(SEQ ID NO: 19)的質(zhì)粒圖譜。圖19 顯示了 pCL0123(SEQ ID NO: 13)的質(zhì)粒圖譜。圖20顯示了密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列(SEQ ID NO: 23)，其編碼樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶蛋白“Xyl2”，與GenBank登錄號(hào)X55392對(duì)應(yīng)。圖21 顯示了 pCL0134(SEQ ID NO: 18)的質(zhì)粒圖譜。圖22顯示了來(lái)自用pCL0130(圖22A)或pCL0131(圖22B)轉(zhuǎn)化的SMM抗性裂殖壺菌屬克隆和裂殖壺菌屬野生型菌株ATCC 20888 (WT)的培養(yǎng)物的培養(yǎng)沉淀裂解物的Western印跡,其用識(shí)別中間假絲酵母木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GXSl (pCL0130轉(zhuǎn)化體)或擬南芥木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白At5gl7010(pCL0131轉(zhuǎn)化體)的抗體探查。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在木糖上生長(zhǎng)的重組破囊壺菌和包含所述重組破囊壺菌的細(xì)胞培養(yǎng)物，以及使用所述重組破囊壺菌生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物、生物質(zhì)、微生物油、組合物和生物燃料的方法。破囊壺菌
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“破囊壺菌”是指破囊壺菌目(Thraustochytriales)的任何成員，其包括破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)。破囊壺菌當(dāng)前的分類學(xué)地位可以簡(jiǎn)述如下界管毛生物界(Stramenopila)(Chromista)門網(wǎng)粘菌(Labyrinthulomycota)(不等毛門(Heterokonta))綱網(wǎng)粘菌綱(Labyrinthulomycetes) (Labyrinthulae)目網(wǎng)粘菌目(Labyrinthulales)科網(wǎng)粘菌科(Labyrinthulaceae)目破囊壺菌目(Thraustochytriales)
科破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)對(duì)于本發(fā)明的目的而言，作為破囊壺菌描述的菌株包括如下生物體目破囊壺菌目；科破囊壺菌科；屬破囊壺菌屬(種菌種，arudimentale, aureum，benthicola，globosum， kinnei， motivum， multirudimentale, pachydermum， proliferum， roseum，striatum)、吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)(種菌種，amoeboidea，kerguelensis，minuta，profunda， radiata， sailens， sarkariana， schizochytrops, visurgensis， yorkensis)、裂殖壺菌屬(種菌種，aggregatum，limnaceum，mangrovei, minutum，octosporum)，Japonochytrium 屬(種菌種、marinum)、Aplanochytrium 屬(種菌種、haliotidis，kerguelensis，profunda, stocchinoi)、Althornia 屬(種菌種、crouchii)、或 Elina 屬(種菌種、marisalba，sinorifica)。出于本發(fā)明的目的，吾肯氏壺菌屬中描述的物種將被看作是破囊壺菌屬的成員。Aurantiochytrium、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium和Sicyoidochytrium是本發(fā)明包括的額外的屬。破囊壺菌屬的菌株包括但不限于，保藏菌株P(guān)TA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、 PTA-9695、 PTA-9696、 PTA-9697、 PTA-9698、 PTA-10208、 PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、破囊壺菌屬菌種(23B) (ATCC 20891) ；Thraustochytriumstriatum (Schneider) (ATCC 24473) ；Thraustochytrium aureum(Goldstein) (ATCC34304) ；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和 Japonochytrium 屬菌種(LI) (ATCC 28207)。裂殖壺菌屬包括但不限于 Schizochytrium aggregatum、Schizochytrium limacinum、裂殖壺菌屬菌種(S31) (ATCC 20888)、裂殖壺菌屬菌種(S8)(ATCC20889)、裂殖壺菌屬菌種(LC-RM) (ATCC 18915)、裂殖壺菌屬菌種(SR 21)，保藏菌株ATCC 28209 和保藏的 Schizochytrium limacinum 菌株 IFO 32693。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞是Sicyoidochytrium或破囊壺菌屬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌的屬選自裂殖壺菌屬菌種、Schizochytriumaggregatum、Schizochytrium limacinum、Schizochytrium minutum、破囊壺菌屬菌種、Thraustochytrium striatum、Thraustochytrium aureum、Thraustochytrium roseum、Japonochytrium屬菌種及其衍生株。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指能夠?qū)⒑怂岱肿?即，重組核酸分子)插入本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞的任何方法。在微生物體系中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”用來(lái)描述由于微生物獲得外源核酸所致的一種遺傳性改變而且基本上與術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”同義。用于將核酸分子引入破囊壺菌細(xì)胞的合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)，包括但不限于粒子轟擊、電穿孔、顯微注射，脂轉(zhuǎn)染、吸附、感染和原生質(zhì)體融合。雖然短語(yǔ)“核酸分子”主要是指物理的核酸分子而短語(yǔ)“核酸序列”或“多核苷酸序列”主要是指核酸分子中的核苷酸序列，但所述短語(yǔ)可以互換使用，尤其是能夠編碼蛋白的核酸分子、多核苷酸序列、或核酸序列。在一些實(shí)施方案中，利用重組DNA技術(shù)(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增或克隆)或化學(xué)合成產(chǎn)生本文所述的分離的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，“分離的”核酸分子是已自其天然環(huán)境移出的核酸分子(即已經(jīng)過(guò)人為操作)，其天然環(huán)境是該核酸分子在自然界中存在于其中的基因組或染色體。如此，“分離的”并不一定反映核酸分子已被純化的程度，但表示該分子不包括該核酸分子在自然界中存在于其中的整個(gè)基因組或整個(gè)染色體。分離的核酸分子可以包括DNA、RNA (例如mDNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。分離的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于，天然的等位基因變體和修飾的核酸分子，其中已經(jīng)將核苷酸以如下方式插入、刪除、取代和/或倒置，該方式使得這樣的修飾在所編碼的肽或蛋白的序列、功能和/或生物活性上提供期望的效果。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括單鏈多肽分子以及其中單獨(dú)的組分多肽通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)手 段連接的多重多肽復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)“多肽”包括兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽，通常具有超過(guò)5、10或20個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，本文所述的多肽是異源多肽。本文使用的術(shù)語(yǔ)“異源”是指序列，例如，其不在本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞中天然存在。本發(fā)明涉及用包含編碼與木糖代謝相關(guān)的多肽的多核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌細(xì)胞。根據(jù)存在于破囊壺菌中的天然基因，可以將完成或補(bǔ)充木糖代謝途徑的一種或多種基因引入到破囊壺菌中以允許在木糖上生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，多肽或多肽的組合參與木糖向木酮糖-5-磷酸的轉(zhuǎn)換(例如，為了進(jìn)入磷酸戊糖途徑)。在某些實(shí)施方案中，木糖向木酮糖-5-磷酸的轉(zhuǎn)換包括3個(gè)步驟木糖輸入，木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換，和木酮糖磷酸化。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽參與木糖輸入(例如，木糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體(symporter)或木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，木糖向木酮糖直接(例如，木糖異構(gòu)酶)或經(jīng)由中間體的糖醇木糖醇(例如，木糖還原酶或木糖醇脫氫酶)的轉(zhuǎn)換，和/或木酮糖磷酸化(例如，木酮糖激酶)。在某些實(shí)施方案中，用一種或多種編碼涉及木糖輸入、木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換、和/或木酮糖磷酸化的多肽的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化破囊壺菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述多肽是異源多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞包含編碼異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如，登錄號(hào)AJ875406和/或BT015128)、異源木糖異構(gòu)酶(例如，登錄號(hào)CAB76571)、異源木酮糖激酶(例如，登錄號(hào)AF127802和/或AJ249910)、異源木糖還原酶(例如，登錄號(hào)X59465)、異源木糖醇脫氫酶(例如，登錄號(hào)X55392)、或其任意組合的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞包含編碼木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如，登錄號(hào)AJ875406和/或BT015128)、木糖異構(gòu)酶(例如，登錄號(hào)CAB76571)、和木酮糖激酶(例如，登錄號(hào)AF127802和/或AJ249910)的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，木糖異構(gòu)酶是WO 03/062430A1中描述的。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以使在破囊壺菌細(xì)胞中的翻譯效率最大化。在一些實(shí)施方案中，將編碼木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶或其任意組合的多核苷酸序列整合到破囊壺菌細(xì)胞的基因組中。在一些實(shí)施方案中，將編碼木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶或其任意組合的多核苷酸序列穩(wěn)定整合到破囊壺菌細(xì)胞的基因組中。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的破囊壺菌細(xì)胞包含一種或多種包含編碼與木糖輸入、木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換、或木酮糖磷酸化相關(guān)的三種或更多種多肽的一種或多種多核苷酸序列的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括一種或多種與木糖輸入相關(guān)的多肽、一種或多種與木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換相關(guān)的多肽、和一種或多種與木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括兩種或多種與木糖輸入相關(guān)的多肽、一種或多種與木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換相關(guān)的多肽、和零或多種與木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括兩種或多種與木糖輸入相關(guān)的多肽、零或多種與木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換相關(guān)的多肽、和一種或多種與木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括一種或多種與木糖輸入相關(guān)的多肽、兩種或多種與木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換相關(guān)的多肽、和零或多種與木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括一種或多種與木糖輸入相關(guān)的多肽、零或多種與木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換相關(guān)的多肽、和兩種或多種與木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括零或多種與木糖輸入相關(guān)的多肽、兩種或多種與木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換相關(guān)的多肽、和一種或多種與木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括零或多種與木 糖輸入相關(guān)的多肽、一種或多種與木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換相關(guān)的多肽、和兩種或多種與木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木酮糖激酶、和異源木糖異構(gòu)酶。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木酮糖激酶、和異源木糖還原酶。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木酮糖激酶、和異源木糖醇脫氫酶。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木酮糖激酶、異源木糖還原酶、和異源木糖醇脫氫酶。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木酮糖激酶、異源木糖異構(gòu)酶、和異源木糖醇脫氫酶。在一些實(shí)施方案中，三種或多種多肽的組合可以包括異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異源木酮糖激酶、異源木糖還原酶、和異源木糖異構(gòu)酶。在一些實(shí)施方案中，前述組合的任一組包括其中任何與木糖輸入、木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)換、和木酮糖磷酸化相關(guān)的多肽來(lái)自不同生物的組合。在一些實(shí)施方案中，用于在破囊壺菌細(xì)胞中產(chǎn)生木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶或其任意組合的表達(dá)系統(tǒng)包含源自破囊壺菌序列的調(diào)節(jié)元件。在一些實(shí)施方案中，用于在破囊壺菌細(xì)胞中產(chǎn)生木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶或其任意組合的表達(dá)系統(tǒng)包含源自非破囊壺菌序列的調(diào)節(jié)元件，包括源自非破囊壺菌藻類序列的序列。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)包含編碼木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶或其任意組合的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列與任意啟動(dòng)子序列、任意終止子序列、和/或任意在破囊壺菌細(xì)胞中有功能的其他調(diào)節(jié)序列可操作地連接?？梢允褂谜T導(dǎo)型或組成型活性的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括但不限于美國(guó)申請(qǐng)
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