專利名稱：含有與丹寧組合的植物乳桿菌菌株的組合物和新植物乳桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗炎特性和對腸微生物群落的體內(nèi)控制作用和體外防腐特性的組合物，所述組合物含有任選的新的、產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌(Lac t cA ac i 11 u s plantarum)菌株，所述菌株具有粘附到人腸粘膜的顯著能力。
背景技術(shù)：
丹寧被定義為水溶性酚類產(chǎn)品，它們可以從水溶液中沉淀蛋白質(zhì)，是天然存在的化合物。有兩類丹寧，來源于沒食子酸和鞣花酸的可水解丹寧，和縮合丹寧也就是原花色素，它們是黃烷醇的寡聚物和多聚物。丹寧抑制多種微生物生長并抵抗微生物攻擊 (Chung,K. Τ.，et al.，(1998)，Tannins and human health :A review. Critical Reviewsin Food Science md Nutrition 38:421-464)。霉菌和酵母和一些需氧細(xì)菌通常最佳地適于降解丹寧但厭氧降解也會發(fā)生，如在腸道中(Bhat, T.K.，et al.，(1998)，Microbial degradation of tannins-A current perspective.Biodegradation 9 :343-357)0已知丹寧是抗?fàn)I養(yǎng)劑，也即，它們降低身體將消化的營養(yǎng)物轉(zhuǎn)化成新的身體物質(zhì)的效率。然而，也已經(jīng)有丹寧的有益健康作用的報道，例如抗癌作用、降低血壓和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力。這些作用可能是由于丹寧的抗氧化特性(Chung et al.，1998)。報道有抗癌特性的有效抗氧化性丹寧是鞣花酸。具有極高抗氧化能力的另一種類型的丹寧是原花色素，例如存在于葡萄和橄欖中。因此，來源于植物的食物中存在的不同濃度的丹寧對人類健康有顯著影響。不建議攝入大量丹寧因為它們可能參與癌癥形成和抗?fàn)I養(yǎng)活性，但通過影響代謝酶、免疫調(diào)節(jié)或其它功能，攝入少量正確種類的丹寧可能對健康有益(Chung etal.， 1998)。然而，正如腸道中產(chǎn)生的，很多丹寧的厭氧降解產(chǎn)物能產(chǎn)生具有有益健康作用的化合物(Bhat et al.，1998)。這些降解化合物是例如苯基丙酸或苯基乙酸的衍生物(Miat et al.，1998)。當(dāng)在胃腸道中被吸收時，這些化合物有抗炎作用。這些化合物與丹寧的其它降解產(chǎn)物一起在胃腸道中也有寬范圍的抗微生物作用，而抑制不需要的細(xì)菌。多數(shù)乳桿菌種不能降解丹寧，但緊密相關(guān)種植物乳桿菌，戊糖乳桿菌和 L. paraplantarum 的菌株能具有丹寧酶活性，Osawa, R.，et al.，(2000)，Isolation of tannin-degrading lactobacilli from humansand fermented foods, Applied and Environmental Microbiology66 :3093_3097o通過由于存在甘露糖而被阻斷的機(jī)制，一些植物乳桿菌菌株具有特異性粘附到人上皮細(xì)胞的能力，Adlerberth, I. , et al. , (1996), A mannose-specific adherence mechanism in Lactobacillusplantarum conferring binding to the human coloniccell lineHT-29. Applied and Environmental Microbiology 62:2244-2251。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有粘附到人腸粘膜并能產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌菌株，當(dāng)降解丹寧時，產(chǎn)生抵抗胃腸(GI)道中有害細(xì)菌的化合物，這些化合物在胃腸道中被吸收時具有抗炎作用。


附圖表示通過用限制酶EcoRI切割植物乳桿菌菌株HEAL 9 (泳道2) ,HEAL 19 (泳道3)、299v (泳道4)和HEAL 99 (泳道5)的染色體DNA而獲得的分離DNA片段。高分子量 DNA標(biāo)記物(BRL)和DNA分子量標(biāo)記物VI (Roche)被用作標(biāo)準(zhǔn)(泳道1)。
具體實施例方式本發(fā)明涉及含與丹寧組合的一種或多種產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌或緊密相關(guān)乳桿菌種的菌株的組合物，所述菌株具有粘附到人腸粘膜上的能力。所述組合物將體內(nèi)產(chǎn)生具有抗微生物和抗炎作用的化合物，并體外產(chǎn)生具有防腐作用的化合物。本發(fā)明也涉及含與丹寧和載體組合的一種或多種產(chǎn)生丹寧酶的乳桿菌菌株的組合物。載體的實例是麥片糊、乳酸發(fā)酵食品、抗性淀粉。為改善細(xì)菌增殖并增加抗炎或防腐衍生物的生產(chǎn)，膳食纖維可以加到組合物中。膳食纖維如寡聚果糖、寡聚半乳糖、乳果糖、 麥芽糖糊精、β-葡聚糖和瓜耳膠，也可用作載體。本發(fā)明尤其涉及含產(chǎn)生丹寧酶的乳桿菌菌株的食物組合物，所述菌株與或多或少純丹寧組分例如鞣花酸、類黃酮如原花色素和花色素、或木脂體類組合，或與富含丹寧的食物組分如燕麥、大麥、紅高梁、松樹內(nèi)部皮層制造的粉和葡萄、柑桔、越橘、藍(lán)莓、黑醋栗、蔓越橘、草莓、覆盆子和玫瑰果的果汁或提取物組合。本發(fā)明也涉及含產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌菌株的藥物組合物，所述菌株與或多或少純丹寧組分一起組合，例如鞣花酸、類黃酮如原花色素或花色素、或木脂體類，或任何其它藥學(xué)可接受的丹寧來源。為了達(dá)到本發(fā)明組合物的預(yù)防或治療作用，丹寧含量優(yōu)選為約500-1000mg/天。 例如對于玫瑰果粉末，這大致相當(dāng)于100g，或玫瑰果漿形式4升。丹寧是具有不同分子量的水溶性酚類產(chǎn)物，它們能沉淀水溶液中的蛋白質(zhì)。有兩類丹寧，來源于沒食子酸和鞣花酸的可水解丹寧，和縮合丹寧也就是原花色素，它們是黃烷醇的寡聚物和多聚物。所謂縮合或不可水解丹寧比可水解丹寧可更強(qiáng)抵抗微生物降解。丹寧通常在果實和種子中發(fā)現(xiàn)，如葡萄、蘋果、香蕉、黑莓、蔓越橘、覆盆子、草莓、橄欖、豆類、高梁谷粒、大麥和finger millets、可可、茶和咖啡。本發(fā)明的組合物可以是食物組合物，其中載體是食品。在藥物組合物中，載體應(yīng)是藥學(xué)可接受的載體。所述組合物可以被給予普通消費者以改善保健措施，從而最終預(yù)防將來的疾病如胃腸來源的感染、糖尿病、炎癥性腸病(IBD)、腸激惹綜合征(IBS)、癌癥和心血管疾病，或減輕這些舉例說明的疾病。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成例如懸液、片劑、膠囊和粉末，它們可以口服給予。所述制劑也可以作為灌腸劑給予。本發(fā)明尤其涉及植物乳桿菌或緊密相關(guān)乳桿菌種的產(chǎn)生丹寧酶的菌株，所述菌株具有粘附到人腸粘膜上的能力，其特征是具有用已知方法確定的丹寧酶活性，其中排除菌株植物乳桿菌^9，DSM 6595和植物乳桿菌^9v，DSM 9843，所述方法由Osawa和Walsh描述于 Applied and Environmental Microbiology, Vol. 59, No. 4, Aprill993, pl251_1252。優(yōu)選的丹寧酶產(chǎn)生菌株屬于植物乳桿菌種并具有在胃腸(GI)道中存活的能力。 在這種環(huán)境中存活意味著所述菌株能在胃腸道中代謝和擴(kuò)增(生活)一段時間。根據(jù)優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及以下新菌株，它們都已于2002年11月觀日保藏于德意志微生物保藏中心并已給予保藏號，即植物乳桿菌HEAL 9，DSM 15312，植物乳桿菌HEAL 19,DSM 15313，和植物乳桿菌HEAL 99,DSM 15316，以及它們的具有基本相同REA模式的變體。所述新菌株已從健康成人結(jié)腸粘膜中分離并經(jīng)在Rogosa瓊脂上培養(yǎng)而篩選。所述菌株隨后已由REA表征。根據(jù)另一方面，本發(fā)明也涉及與丹寧組合的產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌菌株在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療性處理心血管疾病、炎癥性腸病(IBD)、腸激惹綜合征(IBS)、胃腸道感染、糖尿病、癌癥、阿爾茨海默病或具有自身免疫起源的疾病。產(chǎn)生丹寧酶菌株的實例是所述新菌株HEAL 9,HEAL 19和HEAL 99，以及已知菌株植物乳桿菌四9， DSM 6595 和植物乳桿菌 ^9v，DSM 9843。用于本發(fā)明組合物的產(chǎn)生丹寧酶的細(xì)菌的量優(yōu)選不少于IO9Cfu/劑·天。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及與丹寧一起的產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌菌株在食物保存中的用途。產(chǎn)生丹寧酶的菌株的實例是所述新菌株HEAL 9,HEAL 19和HEAL 99，以及已知菌株植物乳桿菌四9，DSM 6595和植物乳桿菌^9v，DSM 9843。所述菌株然后將在降解丹寧后直接在食品中產(chǎn)生防腐劑。通過向產(chǎn)品中補(bǔ)充純丹寧組分或通過向產(chǎn)品中補(bǔ)充天然的、不太確定的、富含丹寧的添加劑，例如玫瑰果、紅高粱或由松樹內(nèi)部皮層制造的粉。能夠丹寧的乳桿菌菌株和丹寧的混合物可以為治療目的或作為保健作用而給予， 從而降低以下疾病的風(fēng)險因素心血管疾病、代謝綜合征、糖尿病、炎癥性腸病(IBD)、腸激惹綜合征(IBS)、胃腸道感染或與自身免疫起源有關(guān)的疾病。與菌株植物乳桿菌299v，DSM 9843相比較，菌株植物乳桿菌HEAL9、HEAL 19和 HEAL 99具有更高的粘附到人結(jié)腸粘膜細(xì)胞上的能力。邏分離菌株42株不同的、新分離的乳桿菌菌株被測試并與熟知的參考益生菌株植物乳桿菌 299v, DSM 9843比較它們產(chǎn)生丹寧酶即降解丹寧的能力。所述菌株列于下表1。篩選方法應(yīng)用的檢測丹寧酶活性的方法較以前被Osawa和Walsh (1993)描述。檢測原理是用以下程序測量丹寧，沒食子酸甲酯的降解待測細(xì)菌于MRS-瓊脂(Merck，Darmstadt, Germany)上在37°C下厭氧培養(yǎng)2天，然后收獲細(xì)胞并懸于5ml 0.9% (W/v)NaCl中。離心細(xì)胞懸液并將細(xì)胞重懸于IOml 0.9% NaCl中，測量620nm下的吸光度(0. 9% NaCl溶液作標(biāo)準(zhǔn))。細(xì)胞懸液稀釋到吸光度在0. 1 到0. 6之間(分光光度計，Pharmacia LKB, Novaspec II)。離心后細(xì)胞重懸于Iml沒食子酸甲酯緩沖液(3. 7g/l 沒食子酸甲酯[AldrichChemical Company, Inc.，Milwaukee, WI, USA], 4. 5g/l NaH2PO4, pH = 5. 0 [無菌過濾])中并將試管在37°C保溫M小時。加入Iml NaHCO3緩沖液G2g/1 NaHCO3, pH = 8. 6)并在室溫保溫溶液1小時，然后測量440nm的吸光度(NaHCO3緩沖液作標(biāo)準(zhǔn))。肉眼觀察測量懸液顏色。被分級為陽性丹寧酶活性的顏色應(yīng)該是棕色或綠色。通過與沒食子酸甲酯保溫開始時細(xì)胞懸液的吸光度(A62tl;細(xì)胞量)比與沒食子酸甲酯一起保溫M小時后的吸光度 (A440 ；在堿性溶液中暴露于氧后游離沒食子酸顯色)的比值而獲得丹寧酶活性的定量值。MM具有丹寧酶活性的乳桿菌菌株篩選結(jié)果表示于表1。多數(shù)測試菌株不具有任何丹寧酶活性。然而，11個菌株是陽性的并在表1中給出。表1.不同乳桿菌菌株中的丹寧酶活性。
權(quán)利要求
1.與丹寧組合的、產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌的菌株在制備藥物中的用途，所述菌株選自植物乳桿菌299，DSM 6595和植物乳桿菌^9v，DSM 9843，其中所述菌株具有粘附到人腸粘膜上的能力，所述藥物用于預(yù)防或治療性處理心血管疾病、糖尿病、炎癥性腸病(IBD)、腸激惹綜合征(IBS)、胃腸道感染、癌癥、阿爾茨海默病或具有自身免疫起源的疾病。
2.與丹寧組合的、產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌的菌株在食品保存中的用途，所述菌株選自植物乳桿菌299，DSM 6595和植物乳桿菌^9v，DSM 9843，其中所述菌株具有粘附到人腸粘膜上的能力。
3.與丹寧組合的、產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌的菌株在生產(chǎn)新食物中的用途，所述菌株選自植物乳桿菌299，DSM 6595和植物乳桿菌^9v，DSM 9843，其中所述菌株具有粘附到人腸粘膜上的能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有與丹寧組合的植物乳桿菌菌株的組合物和新植物乳桿菌菌株，所述菌株具有粘附到人腸粘膜上的能力。本發(fā)明還涉及與丹寧組合的、產(chǎn)生丹寧酶的植物乳桿菌的菌株在制備藥物中的用途、在食品保存中的用途以及在生產(chǎn)新食物中的用途，所述菌株選自植物乳桿菌299，DSM 6595和植物乳桿菌299v，DSM 9843，其中所述菌株具有粘附到人腸粘膜上的能力。
文檔編號C12N1/20GK102210717SQ201110060708
公開日2011年10月12日 申請日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者B·耶普松, G·莫林, S·阿恩 申請人:普羅比公司