專利名稱：用于檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒耐藥突變位點的檢測，尤其是一種利用妨4測序技術(shù)對乙型肝炎病毒耐藥突變位點進行檢測，屬于醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科。根據(jù)目前所知，乙肝病毒只對人和猩猩有易感性，引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙型肝炎病毒成顆粒狀，直徑為42納米，是英國科學(xué)家Dane于1970年首先發(fā)現(xiàn)，故又稱Dane顆粒(丹氏顆粒)。Dane顆粒由外膜和內(nèi)核兩部分組成，外膜厚7納米，由蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)組成，稱作乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。中心部分的直徑約觀納米，為病毒的核心，其中包括核心抗原(HBcAg)，病毒基因組DNA和合成病毒基因組的DNA多聚酶。乙肝病毒基因組編碼四個基因，分別是表面抗原基因(S、PreSl及ft~eS2基因)，DNA多聚酶基因(P基因)，X蛋白基因，核心抗原基因(C及基因)。乙肝病毒感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。全球60 億人口中，約20億人曾感染過乙肝病毒，其中3. 5 4億人為慢性乙肝病毒感染，約占全球人口 6%。在這3. 5 4億慢性乙肝病毒感染者中，約15% 25%最終將死于與乙肝病毒感染相關(guān)的肝病。而我國屬于高流行區(qū)，根據(jù)2002年全國乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查表明，我國一般人群中HBsAg流行率為9. 09%，估計約1.2 1.3億人為慢性乙肝病毒感染， 占全世界慢性乙肝病毒感染者的1/3，全國每年死于與乙肝相關(guān)肝病約30萬例。目前廣泛應(yīng)用于臨床乙肝病毒抗病毒治療的藥物是核苷類似物藥物。由于乙型肝炎病毒(HBV)在復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴格的校正機制，復(fù)制過程中自發(fā)突變率達10-5，導(dǎo)致乙型肝炎病毒的基因極易發(fā)生突變。當(dāng)基因突變是發(fā)生在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase，RT)基因的特定位點的特定種類的突變，就會產(chǎn)生對核苷類似物藥物的耐藥。目前已經(jīng)鑒定的與耐藥相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶基因突變?yōu)長80V/I，I169T，V173L， L180M, A181TV, T184S/A/I/L/F/G, A194T, S202G/I, M204V/I/S, N236T, M250V, Q215S, V84M, S85A和V214A。數(shù)字代表突變在逆轉(zhuǎn)錄酶基因上的位置。慢性乙型肝炎患者抗病毒治療過程中發(fā)生病毒耐藥突變是限制核苷類似藥物治療的一個主要障礙，隨著治療時間的延長， 抗病毒藥物治療的患者體內(nèi)可出現(xiàn)變異株，從而發(fā)生病毒學(xué)突破，導(dǎo)致治療失敗。一些病毒發(fā)生的耐藥變異已被證實可以引起對幾種藥物的交叉耐藥，這就限制了對患者的進一步長期有效地治療。因此在治療中早期檢測出這些變異，對選擇藥物、指導(dǎo)遠期治療非常必要，對大幅度提高抗病毒治療的療效具有重要的意義。目前用于檢測HBV耐藥突變位點的方法主要有以下三種
(1)聚合酶鏈擴增產(chǎn)物直接測序(Sanger測序)聚合酶鏈擴增(PCR)產(chǎn)物直接測序被認為是藥物治療過程中耐藥檢測的首選方法。該方法簡明，易操作，但是靈敏性不高，只有當(dāng)變異株超過HBV準種池(quasispecies pool)的20%以上直接測序才能檢測到。(2)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)通過PCR擴增出目標(biāo)基因片段，然后用給定的限制性內(nèi)切酶進行酶切，根據(jù)酶切圖譜進行突變位點的分析。該方法可以檢測到病毒準種池中5%的變異株，但只能檢測單位點變異，僅適用于少數(shù)耐藥突變位點的檢測。(3)反向雜交線性探針技術(shù)(LiPA)將一系列寡聚核苷酸探針固定在一條雜交膜上，將地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的探針結(jié)合，通過堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)來觀察雜交結(jié)果。該方法可以檢測到病毒準種池中5%的變異株，但對新出現(xiàn)的變異都要設(shè)計新的探針， 迫使該技術(shù)要定期進行更新。另外由于核苷酸序列上基因型的不同，為了檢測一個氨基酸置換通常需要許多個探針來檢測。Roche公司的妨4測序技術(shù)是一種基于焦磷酸測序原理而建立起來的高通量測序系統(tǒng)。依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的新技術(shù)；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。 通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。與其他高通量測序方法相比，4M測序技術(shù)具有測序速度快，單個序列讀長長，準確度高，一致性好的優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用于基因組及轉(zhuǎn)錄組的測序中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是第一個目的是提供一種用于乙型肝炎病毒耐藥突變位點檢測的引物。第二個目的是用上述引物檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的方法，該方法操作簡單，一次測序可以進行多個樣本耐藥突變位點的分析。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案
本發(fā)明是根據(jù)基因庫中能夠檢索到的乙型肝炎病毒基因組核苷酸序列進行同源性分析，設(shè)計以下用于檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的四對引物 第一對是Fl片段的引物Flf和Flr，其中 Flf的序列為
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC Flr的序列為
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG 第二對是F2片段的引物F2f和F2r，其中 F2f的序列為
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG F2r的序列為
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA 第三對是F3片段的引物F3f和F3r，其中 F3f的序列為
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC F3r的序列為
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG 第四對是F4片段的引物F4f和F4r，其中 F4f的序列為
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGTF4r的序列為
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。本發(fā)明提供的用于檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的方法，該方法是采用上述的引物，通過PCR獲得4段PCR產(chǎn)物，這4段PCR產(chǎn)物以重疊的方式覆蓋全部逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列，將4段PCR產(chǎn)物等摩爾比混合構(gòu)建樣本的逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫，再用4M測序技術(shù)對該文庫進行檢測，從而確定樣本中是否含有耐藥性突變位點。上述方法可以按下列步驟順序進行
a.提取患者血清中乙型肝炎病毒DNA；
b.PCR反應(yīng)
以步驟a中提取的DNA為模版，分別用Fl片段的引物Flf和Flr，F(xiàn)2片段的引物F2f 和F2r，F(xiàn)3片段的引物F3f和F3r，F(xiàn)4片段的引物F4f和F4r進行PCR,
在PCR管中加入下列物質(zhì)=IOXPCR緩沖液5uL，四種脫氧核糖核苷酸1 uL，濃度為 20umol/L PCR 引物 f luL，濃度為 20umol/L PCR 引物 r luL，高保真DNA聚合酶 0. 5 uL，DNA 模板2 uL和超純水39uL，
將PCR管放入PCR儀中進行擴增反應(yīng)，所得產(chǎn)物中含有PCR擴增的目標(biāo)基因片段；
c.獲取樣本庫
對步驟b中獲得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用試劑盒回收目的片段，其中Fl片段大小為480bp，F(xiàn)2片段大小為466bp，F(xiàn)3片段大小為457bp，F(xiàn)4片段大小為38;3bp ；用 Nanadrop紫外分光光度計檢測回收到的片段的濃度，將四種片段以等摩爾比混合構(gòu)成樣本的逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫；
d.測序
采用4M測序技術(shù)對逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫進行測序，檢測是否存在15種位于轉(zhuǎn)錄酶基因上與乙型肝炎病毒耐藥性相關(guān)的突變的一種或者幾種，這15種位于轉(zhuǎn)錄酶基因上與乙型肝炎病毒耐藥性相關(guān)的突變分別是L80V/I，I169T，V173L，L180M, A181T/V，T184S/A/I/L/ F/G, A194T, S202G/I, M204V/I/S, N236T, M250V, Q215S, V84M, S85A 和 V214A。所述步驟b包含bl b7七個擴增反應(yīng)的步驟，這些擴增反應(yīng)步驟的工藝條件分別是bl.94°C 5 分鐘；b2. 94°C 30 秒；b3. 57°C 30 秒；b4. 72°C 30 秒；b5.重復(fù)四次步驟1^2 b4 ;b6. 72°C 10分鐘；b7.降溫至4°C。本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下主要的優(yōu)點
其一.與PCR產(chǎn)物直接進行Sanger測序的方法比較，本方法具有更高的靈敏性，能夠檢測到HBV準種池中占1%以上的突變。其二 .操作簡單，檢測過程中的樣本RNA提取過程及PCR反應(yīng)為實驗室和醫(yī)院檢驗科常用技術(shù)。其三.通量大，一次測序可以獲得80—100萬條DNA測序結(jié)果，可以進行30_40個樣本耐藥突變位點的分析。


圖1是利用四對PCR引物經(jīng)PCR反應(yīng)后擴增出的片斷，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測到的PCR產(chǎn)物示意圖。其中M代表DNA Marker。每個片段的結(jié)果1代表目的片段，結(jié)果2代表陰性對照。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明基于妨4測序技術(shù)對乙型肝炎病毒耐藥突變位點進行檢測。首先根據(jù)乙型肝炎病毒基因組核苷酸序列進行同源性分析，設(shè)計4對引物，擴增獲得的4段PCR產(chǎn)物以重疊的方式覆蓋全部逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列，將PCR擴增獲得的DNA等摩爾比混合構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄酶基因的DNA文庫，再用妨4測序技術(shù)進行測序，監(jiān)測樣本中是否含有耐藥性突變位點。相比于現(xiàn)有的乙型肝炎耐藥突變位點的檢測技術(shù)，
下面結(jié)合實施實例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。一 .基于妨4測序技術(shù)檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的引物
根據(jù)基因庫中能夠檢索到的乙型肝炎病毒基因組核苷酸序列進行同源性分析，設(shè)計以下用妨4測序技術(shù)檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的四對引物 第一對是擴增第1個片段Fl的正向引物Flf、反向引物Flr， 正向引物Flf的序列為
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC 反向引物Flr的序列為
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG 第二對是擴增第2個片段F2片段的正向引物F2f、反向引物F2r，其中 正向引物F2f的序列為
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG 反向引物F2r的序列為
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA 第三對是擴增第3個片段F3片段的正向引物F3f、反向引物F3r，其中 正向引物F3f的序列為
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC 反向引物F3r的序列為
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG 第四對是擴增第4個片段F4片段的正向引物F4f、反向引物F4r，其中 正向引物F4f的序列為
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGT 反向引物F4r的序列為
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。上述四對引物中，每條引物由下述三部分組成
第一部分為5、末端的通用引物序列，是基于4M測序方法本身的要求，其中， 正向引物的通用序列為CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG ；反向引物的通用序列為 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG ；
第二部分是樣本的識別碼，是引物中的可變部分，其用下劃線表示，根據(jù)測序樣本的數(shù)量由6-10個核苷酸以不同的方式排列組合構(gòu)成，用于在妨4測序結(jié)果中將不同樣本的數(shù)據(jù)區(qū)分開；因為4M測序獲得的數(shù)據(jù)量較大，在測序的過程中可以將多個樣本的PCR產(chǎn)物混合在一起在同一個反應(yīng)中同時測序，測序獲得的DNA序列通過識別碼歸為相應(yīng)樣本。第三部分是針對乙型肝炎病毒設(shè)計的特異性引物，用來在PCR反應(yīng)的過程中和乙型肝炎病毒基因組配對，擴增目的DNA片段。二.用于檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的方法 1.檢測方法
該方法是采用上述的引物，通過PCR獲得4段PCR產(chǎn)物，這4段PCR產(chǎn)物以重疊的方式覆蓋全部逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列，將4段PCR產(chǎn)物等摩爾比混合構(gòu)建樣本的逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫，再用4M測序技術(shù)對該文庫進行檢測，從而確定樣本中是否含有耐藥性突變位點。上述方法可以按下列步驟順序進行
a.用乙型肝炎病毒基因組DNA提取試劑盒提取樣本血清中的乙型肝炎病毒基因組
DNA。b. PCR擴增和樣本庫的構(gòu)建
以步驟a中提取的DNA為模版，分別用Fl片段的引物Flf和Flr，F(xiàn)2片段的引物F2f 和F2r，F(xiàn)3片段的引物F3f和F3r，F(xiàn)4片段的引物F4f和F4r進行PCR擴增；
在PCR管中加入下列物質(zhì)=IOXPCR緩沖液5uL，四種脫氧核糖核苷酸1 uL，濃度為 20umol/L PCR 引物 f luL，濃度為 20umol/L PCR 引物 r luL，高保真DNA聚合酶0. 5 uL，DNA 模板2 uL和超純水39uL ；
將PCR管放入PCR儀中進行擴增反應(yīng)，所得產(chǎn)物中含有PCR擴增的4種目標(biāo)基因片段； 進行擴增反應(yīng)的條件是bl. 940C 5分鐘；b2. 94°C 30秒；b3. 57°C 30秒；b4. 72°C 30秒；b5.重復(fù)29次步驟1^2 b4 ；b6. 72°C 10分鐘；b7.降溫至4°C。c.獲取樣本庫
對步驟b中獲得的PCR產(chǎn)物進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用膠回收試劑盒回收 4種目的基因片段，其中Fl片段大小為480bp，F(xiàn)2片段大小為466bp，F(xiàn)3片段大小為457bp， F4片段大小為38;3bp。用Nanadrop紫外分光光度計檢測回收到的4種目的基因片段的濃度，再將它們以等摩爾比混合構(gòu)成樣本的逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫。d.測序及分析
經(jīng)上海眾信生物技術(shù)有限公司采用妨4測序技術(shù)對逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫進行檢測及分析，確定樣本中是否含有15種位于轉(zhuǎn)錄酶基因上與乙型肝炎病毒耐藥性相關(guān)的突變中的一種或幾種，這15種位于轉(zhuǎn)錄酶基因上與乙型肝炎病毒耐藥性相關(guān)的突變分別是L80V/ I，I169T, V173L, L180M, A181T/V, T184S/A/I/L/F/G, A194T, S202G/I, M204V/I/S, N236T, M250V, Q215S, V84M, S85A 和 V214A。共檢測臨床樣本39例，其中部分樣本的測序結(jié)果與Sanger測序結(jié)果比較，結(jié)果見表1。2.相關(guān)試劑
膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA生物技術(shù)公司(貨號D2500-02);高保真DNA聚合酶、dNTP及 IOxbuffer購自Roch公司(貨號04 738 292 001)；乙型肝炎病毒基因組DNA提取試劑盒購自Qiagen生物技術(shù)公司(貨號51104)。實驗操作嚴格按廠家提供的說明書進行。
3.所用儀器
PCR擴增儀型號Biometra T personal，454測序儀型號GS_FLX，Nanodrop紫外分光光度計型號ND-1000 4.結(jié)論
乙型肝炎病毒耐藥突變的產(chǎn)生是核苷酸類似物藥物治療乙型肝炎治療過程中的一個主要障礙。在治療中早期檢測出耐藥突變位點的出現(xiàn)，對選擇藥物、指導(dǎo)遠期治療非常必要，對大幅度提高抗病毒治療的療效具有重要的意義。在我們的方法中，設(shè)計4對PCR引物， 通過PCR獲得整個逆轉(zhuǎn)錄酶基因的DNA文庫，將文庫進行454高通量測序，通過生物信息學(xué)分析檢測乙型肝炎病毒感染者血清中乙型肝炎病毒耐藥突變位點的出現(xiàn)。與PCR產(chǎn)物直接進行Sanger測序的方法比較，本方法具有更高的靈敏性，能夠檢測到HBV準種池中占1%以上的突變。附表
表1 部分血清樣本耐藥突變位點檢測結(jié)果(NA為在該方法下未檢測到耐藥性突變位
占)
權(quán)利要求
1.一種用于檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的引物，其特征是根據(jù)基因庫中能夠檢索到的乙型肝炎病毒基因組核苷酸序列進行同源性分析，設(shè)計以下四對引物第一對是Fl片段的引物Flf和Flr，其中 Flf的序列為CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC Flr的序列為CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG 第二對是F2片段的引物F2f和F2r，其中 F2f的序列為CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG F2r的序列為CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA 第三對是F3片段的引物F3f和F3r，其中 F3f的序列為CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC F3r的序列為CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG 第四對是F4片段的引物F4f和F4r，其中 F4f的序列為CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGT F4r的序列為CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。
2.一種用于檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的方法，其特征是采用權(quán)利要求1所述的引物，通過PCR獲得4段PCR產(chǎn)物，這4段PCR產(chǎn)物以重疊的方式覆蓋全部逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列，將4段PCR產(chǎn)物等摩爾比混合構(gòu)建樣本的逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫，再用4M測序技術(shù)對該文庫進行檢測，從而確定樣本中是否含有耐藥性突變位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是按下列步驟順序進行a.提取患者血清中乙型肝炎病毒DNA；b.PCR反應(yīng)以步驟a中提取的DNA為模版，分別用Fl片段的引物Flf和Flr，F(xiàn)2片段的引物F2f 和F2r，F(xiàn)3片段的引物F3f和F3r，F(xiàn)4片段的引物F4f和F4r進行PCR,在PCR管中加入下列物質(zhì)=IOXPCR緩沖液5uL，四種脫氧核糖核苷酸1 uL，濃度為 20umol/L PCR 引物 f luL，濃度為 20umol/L PCR 引物 r luL，高保真DNA聚合酶0. 5 uL，DNA 模板2 uL和超純水39uL，將PCR管放入PCR儀中進行擴增反應(yīng)，所得產(chǎn)物中含有PCR擴增的目標(biāo)基因片段；c.獲取樣本庫對步驟b中獲得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用試劑盒回收目的片段，其中Fl片段大小為480bp，F(xiàn)2片段大小為466bp，F(xiàn)3片段大小為457bp，F(xiàn)4片段大小為38;3bp ；用 Nanadrop紫外分光光度計檢測回收到的片段的濃度，將四種片段以等摩爾比混合構(gòu)成樣本的逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫； d.測序采用4M測序技術(shù)對逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫進行測序，檢測是否存在15種位于轉(zhuǎn)錄酶基因上與乙型肝炎病毒耐藥性相關(guān)的突變的一種或者幾種，這15種位于轉(zhuǎn)錄酶基因上與乙型肝炎病毒耐藥性相關(guān)的突變分別是L80V/I，I169T，V173L，L180M, A181T/V，T184S/A/I/L/ F/G, A194T, S202G/I, M204V/I/S, N236T, M250V, Q215S, V84M, S85A 和 V214A。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟b中，進行擴增反應(yīng)的條件是bl. 94°C 5 分鐘；b2. 94°C 30 秒；b3. 57 °C 30 秒；b4. 72 °C 30 秒；b5.重復(fù)四次步驟 b2 b4 ；b6. 72°C 10 分鐘；b7.降溫至 4°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測乙型肝炎病毒耐藥突變位點的引物及方法。本發(fā)明提供了用于乙型肝炎病毒耐藥突變位點檢測的4對PCR引物，以這4對PCR引物擴增乙型肝炎病毒基因組DNA，獲得的4個片段以重疊的方式覆蓋整個乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列。本發(fā)明將4段PCR片段以等摩爾比混合制成逆轉(zhuǎn)錄酶基因文庫，經(jīng)454高通量測序和生物信息學(xué)分析，能夠檢測乙型肝炎患者血清樣本中的乙型肝炎病毒是否含有耐藥性突變位點。本發(fā)明能夠檢測到患者血清中占1%以上的乙型肝炎病毒耐藥突變，具有敏感性高、操作簡單、通量大等優(yōu)點，一次測序可以進行多個樣本耐藥突變位點的分析。
文檔編號C12Q1/70GK102181575SQ201110065929
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者尹飛飛, 王華林, 胡志紅, 鄧菲 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所