專(zhuān)利名稱(chēng)：一種分離產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高效的產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌的分離方法。
背景技術(shù)：
纖維素生物質(zhì)是一種豐富的可再生資源，有巨大的潛在價(jià)值，可利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)可增值生物產(chǎn)品。近幾年來(lái)，有效利用生物質(zhì)的發(fā)展日益更加得到了重視。然而，生物質(zhì)的生物精煉過(guò)程在經(jīng)濟(jì)上仍不太可行，這是由于缺乏一種廉價(jià)高效的生物催化劑。纖維素酶產(chǎn)生細(xì)菌是纖維素酶的一個(gè)新來(lái)源。纖維素酶(Cellulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱(chēng)，是一類(lèi)具有催化纖維素分解成葡萄糖的生物活性蛋白質(zhì)， 纖維素酶的研究最早是1906年killiere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)了能分解纖維素的纖維素酶。它可將豐富的纖維素廢棄資源轉(zhuǎn)化為再生資源，解決能源、飼料和食品供應(yīng)之不足。傳統(tǒng)的產(chǎn)生纖維素酶的細(xì)菌的分離方法，是先分離大量的細(xì)菌，再分析其酶活性， 篩選具纖維素酶活的微生物菌株。通常篩選具纖維素酶活的微生物菌株在含羧甲基纖維素 (CMC)平板上進(jìn)行篩選。這種方法準(zhǔn)確度不好，并且水解帶也不易辨別，分離過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)， 研究者不能快速、直觀了解菌株的酶活情況。Thomas為了確定Wiytophthora菌絲的組成和結(jié)構(gòu)，針對(duì)九個(gè)不同種類(lèi)的 Phytophthora進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)其基本結(jié)構(gòu)是兩種形式纖維素混合物與幾丁質(zhì)的疊加， 有己糖，不存在果膠化合物。當(dāng)用偏振光觀察時(shí)，不同種類(lèi)的Wiytophthora新老菌絲有相同的表象特征。Wiytophthora是一種土傳卵菌病原體，能夠感染多種植物，包括一些茄科植物。Phytophthora(P. ) soyae Kaufman& Gerdemann是大豆疫霉病的病原菌，禾口 Phytophthora的特征一樣，是由己糖組成。還有研究發(fā)現(xiàn)，富含纖維素的疫霉能被產(chǎn)纖維素酶的腐霉所破壞。高效纖維素酶產(chǎn)生菌平板篩選技術(shù)必須是能夠提供一個(gè)更加快速，更易辨別的方法。纖維素酶是利用豐富的可再生資源纖維素的關(guān)鍵，纖維素酶產(chǎn)生菌是產(chǎn)纖維素酶的重要來(lái)源。傳統(tǒng)的篩選纖維素酶產(chǎn)生菌的方法效率低，且肉眼不可見(jiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡(jiǎn)便、高效率分離產(chǎn)纖維素酶菌的方法，本發(fā)明所述方法有利于纖維素酶的開(kāi)發(fā)利用。實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案是采用本發(fā)明方法分離產(chǎn)纖維素酶菌，有以下步驟1)取土壤樣品，加無(wú)菌水研磨，靜置10分鐘，得到土壤懸浮液，取所述土壤懸浮液涂于LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani medium)平板上；幻觀！恒溫箱中培養(yǎng)，4 挑取單菌落純化，得到純菌株；3)先在芝麻培養(yǎng)基上培養(yǎng)大豆疫霉，再在篩選培養(yǎng)基平板中心接種大豆疫霉，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)接種待測(cè)細(xì)菌菌株，在下培養(yǎng)3天，觀察，有抑制帶的即為產(chǎn)纖維素酶的菌株。步驟幻中篩選培養(yǎng)基上平板中心接種大豆疫霉的菌塊d = 0. 4cm0步驟幻中篩選培養(yǎng)基上平板中心接種大豆疫霉的兩側(cè)對(duì)稱(chēng)接種待測(cè)細(xì)菌菌株， 距中心2. 5cm,每個(gè)菌株重復(fù)3次。本發(fā)明利用了細(xì)菌和真菌的拮抗機(jī)制，Phytophthora (P. ) soyae Kaufman& Gerdemarm菌絲中的纖維素能被纖維素酶產(chǎn)生菌產(chǎn)的纖維素酶降解。篩選纖維素酶產(chǎn)生菌是基于P. soyae Kaufman & Gerdemarm上的纖維素被作為是細(xì)菌纖維素酶的目標(biāo)底物， 其實(shí)驗(yàn)結(jié)果是直接明顯的。P. soyae Kaufman &Gerdemann結(jié)構(gòu)特征被利用了，P. soyae Kaufman & Gerdemarm和纖維素酶產(chǎn)生菌在平板上對(duì)峙培養(yǎng)，如果細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維酶素， 則P. soyae Kaufman &Gerdemann生長(zhǎng)被抑制。這種現(xiàn)象很容易觀察，篩選效率可以很大程度上提高。本研究的篩選方法為基于纖維素酶產(chǎn)生菌和P. soyae Kaufman &Gerdemann在平板培養(yǎng)基相互作用的特征的一種新方法，結(jié)果表明，抑制區(qū)的大小和細(xì)菌菌株纖維素酶活力基本上一致。本發(fā)明方法所述纖維素酶產(chǎn)生菌在瓊脂培養(yǎng)基上抑制了真菌的生長(zhǎng)，目標(biāo)菌肉眼很容易看見(jiàn)，不需要先進(jìn)的儀器檢測(cè)分析。在高通量的試驗(yàn)室篩選中，這種方法快速，簡(jiǎn)便， 高效的鑒定纖維素酶產(chǎn)生菌，利于纖維素酶的利用。


圖1為Puc-83的抑菌帶，其中A為對(duì)照，B為Puc-83的抑菌帶，其中中間為P. soyae Kaufman & Gerdemann,兩邊為 Puc-83 ；圖2為Puc-83在CMC-Na平板上的水解圈；圖 3 為 Puc-83 對(duì) P. soyae Kaufman & Gerdemann 水解的顯微照片(16X40 倍)；圖4為分離產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌的示意圖，圖中1為大豆疫霉，2為待測(cè)菌株。
具體實(shí)施例方式1、培養(yǎng)基、菌株及試劑
P. soyae Kaufman & Gerdemann (大豆疫霉，野生型，西南大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供)芝麻培養(yǎng)基芝麻，30g，蔗糖，15g，去離子水定容至IOOOmLdfpH 6.5。篩選培養(yǎng)基芝麻，30g，蔗糖，15g，蛋白胨，10g，去離子水定容至IOOOmLdjfpH 6. 5。L B 培養(yǎng)基(Luria-Bertani medium)蛋白胨 10g，酵母膏 5g，NaCl 10g，去離子水定容至 IOOOmL, il pH 7. 0。本實(shí)施例其它試劑均采用市售的分析純?cè)噭?、土壤細(xì)菌的分離土壤樣品采自菜園熟土(土壤樣品不限地域)。菌株是土壤樣品在的LB培養(yǎng)基上通過(guò)傳統(tǒng)平板分離方法進(jìn)行分離得到的。先把待分離的土壤樣品加無(wú)菌水少量研磨，靜置10分鐘，得到土壤懸浮液，用曲玻棒醮取懸浮液涂于LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani medium)平板上，連續(xù)涂?jī)蓚€(gè)平板。 恒溫箱中培養(yǎng)，4 挑取單菌落純化，分離得到346個(gè)純菌株，轉(zhuǎn)管保存待用。3、纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選先在芝麻培養(yǎng)基上培養(yǎng)大豆疫霉。用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，再在篩選培養(yǎng)基平板上作對(duì)峙實(shí)驗(yàn)。平板中心接種大豆疫霉，菌塊d = 0.如m，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)接種待測(cè)細(xì)菌菌株，距中心 2. 5cm，參見(jiàn)圖4，每個(gè)菌株重復(fù)3次，在下培養(yǎng)3天。3d后觀察有無(wú)抑菌帶并記錄。有抑制帶的即為纖維素酶產(chǎn)生菌，將所得的纖維素酶菌株進(jìn)一步做纖維素酶活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)。4.纖維素酶產(chǎn)生菌酶活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)取上述所得的菌株在LB培養(yǎng)基，下250轉(zhuǎn)每分鐘振蕩培養(yǎng)48h。所得培養(yǎng)液離心4500g，2min,收集上清液，用檸檬酸緩沖液調(diào)整溶液pH至5. 3，供以下做實(shí)驗(yàn)。用DNS (3，5- 二硝基水楊酸比色)法測(cè)纖維素酶活力用DNS (3，5- 二硝基水楊酸比色)法測(cè)纖維素酶活力的方法是，3，5_ 二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物-3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比。(I)DNS試劑的配制稱(chēng)取酒石酸鉀鈉182. 0g，溶于500ml蒸餾水中，加熱(45°C左右)，于熱溶液中依次加入3，5 二硝基水楊酸6. 3g,Na0H 21. 0g，苯酚5. 0g，無(wú)水亞硫酸鈉5. 0g，攪拌至溶解完全，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，貯存于棕色瓶中，室溫保存。(2)DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作精確稱(chēng)取經(jīng)105°C烘干至恒重的無(wú)水葡萄糖1. 0000克，配成10mg/ml濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。分別吸取10mg/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液1.0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. Oml于50ml容量瓶中，用蒸餾水制成每毫升分別含有葡萄糖200 μ g、400 μ g、600 μ g、800 μ g、1000 μ g、 1200 μ g的標(biāo)準(zhǔn)液。各取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液0. 5ml于試管中，加磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液 1. 5ml，DNS試劑3ml于沸水浴中沸騰7min，取出后立即加入蒸餾水IOml混勻，冷卻后，于紫外分光光度計(jì)^Onm處比色，以所得的光密度OD值為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的葡萄糖量為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。(3)空白的制作以0. 5ml蒸餾水代替0. 5ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，以下操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作。Cx酶活力=A (分光度值對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量)X 2/30 (u/ml)酶活定義在40°C，pH4. 8條件下，定義每分鐘催化纖維素水解生成1 μ g葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位U。(5)纖維素酶液酶活力測(cè)試上清液用DNS (3，5-二硝基水楊酸)法分析。取纖維素酶液(即步驟4所得的上清液)0. 5ml，加入CMC-Na (羧甲基纖維素鈉)底物1. 5ml，在40°C條件下反應(yīng)30min，然后立即加入:3ml DNS試劑，沸水浴中煮7min使其顯色，取出后立即加入蒸餾水IOml混勻，其余步驟同上述DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作。空白制作取纖維素酶液0. 5ml，先加入DNS試劑3ml煮沸3min，再加入CMC-Na液 1. 5ml，冷卻后測(cè)吸光光度值。CMC-Na 平板法
在CMC瓊脂平板上用滴管滴20 μ 1分離得到的菌產(chǎn)生的酶纖維素酶液。將瓊脂平板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中放置4 后，用0. 2%剛果紅染色30min，并依次用蒸餾水和 lmol/L的NaCl徹底洗去染液，然后用5% (W/V)醋酸溶液固定顏色5min。纖維素酶水解底物CMC-Na會(huì)形成一透明圈。(6)觀察 P. soyae Kaufman & Gerdemann 菌絲的顯微特征先在芝麻培養(yǎng)基上培養(yǎng)大豆疫霉，用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，再在滅菌載玻片上面覆蓋一層約Imm厚的篩選培養(yǎng)基。將大豆疫霉與待測(cè)菌株相距1. 5cm接種，放于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)曲玻棒上，加少量滅菌水保濕，對(duì)照只接種大豆疫霉。28°C培養(yǎng)48h，用顯微鏡檢查大豆疫霉菌落前沿的菌絲形態(tài)，并顯微照像，見(jiàn)附圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選培養(yǎng)基上的菌株特性本實(shí)施例將從土壤樣品分離出346個(gè)菌株分別命名為Puc-I......Puc-n, 346個(gè)
菌株中26個(gè)菌株可抑制P. soyae Kaufman & Gerdemann的生長(zhǎng)(見(jiàn)表1)。例如，P. soyae Kaufman & Gerdemann和Puc_83菌株之間的抑菌帶寬是1. 03cm等。細(xì)菌纖維素酶活的分析將可抑制P. soyae Kaufman & Gerdemann的生長(zhǎng)的26個(gè)菌株發(fā)酵液用DNS法分析，結(jié)果表明有抑菌帶的纖維素酶產(chǎn)生菌有不同的酶活，見(jiàn)表1。如Puc-83的纖維素酶活是 13. 50U/mL 等。在CMC-Na平板實(shí)驗(yàn)中，水解區(qū)很明顯，Puc-83水解圈直徑為0. 98cm(參見(jiàn)圖2)。 它和DNS法實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果一樣，抑菌帶和菌株的纖維素酶活總體上一致(參見(jiàn)表1)。Puc-83 降解 P. soyae Kaufman & Gerdemann 菌絲的顯微觀察P. soyae Kaufman & Gerdemann前側(cè)菌絲被Puc-83菌株降解，被分解成小片段 (參見(jiàn)圖3)，表明Puc-83菌株產(chǎn)的纖維素酶可以降解具有纖維素結(jié)構(gòu)的P. soyae Kaufman & Gerdemann 的菌絲。表1菌株的抑菌帶和纖維素酶活力
權(quán)利要求
1.一種分離產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌的方法，其特征在于有以下步驟1)取土壤樣品，加無(wú)菌水研磨，靜置10分鐘，得到土壤懸浮液，取懸浮液涂于LB培養(yǎng)基平板上；2)恒溫箱中培養(yǎng)，4 挑取單菌落純化，得到純菌株；3)篩選培養(yǎng)基上平板中心接種大豆疫霉，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)接種待測(cè)細(xì)菌菌株，在下培養(yǎng) 3天，觀察，有抑制帶的即為產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌的方法，其特征在于步驟幻中篩選培養(yǎng)基上平板中心接種大豆疫霉的菌塊d = 0. 4cm0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌的方法，其特征在于步驟幻中篩選培養(yǎng)基上平板中心接種大豆疫霉的，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)接種待測(cè)細(xì)菌菌株，距中心2. 5cm，每個(gè)菌株重復(fù)3次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌的方法，其特征在于所述篩選培養(yǎng)基組成和成分為芝麻，30g，蔗糖，15g，蛋白胨，10g，去離子水定容至IOOOmLdfpH 6.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌的方法，有以下步驟1)取土壤樣品，加無(wú)菌水研磨，靜置10分鐘，得到土壤懸浮液，取懸浮液涂于L B培養(yǎng)基平板上；2)28℃恒溫箱中培養(yǎng)，48h挑取單菌落純化，得到純菌株；3)篩選培養(yǎng)基上平板中心接種大豆疫霉，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)接種待測(cè)細(xì)菌菌株，在28℃下培養(yǎng)3天，觀察，有抑制帶的即為產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的菌株。本發(fā)明能快速、簡(jiǎn)便、高效率分離產(chǎn)生纖維素酶菌，所述方法有利于纖維素酶的開(kāi)發(fā)利用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102181388SQ20111006577
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者王萬(wàn)能 申請(qǐng)人:重慶理工大學(xué)