專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)諾氟沙星的scFv抗體、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)諾氟沙星的SCFv重組抗體、其編碼基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
諾氟沙星(Norfloxacin，NFLX)，化學(xué)名稱(chēng)為1_乙基_6_氟-1，4_ 二氫_4_氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，是氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥，具廣譜抗菌作用，尤其對(duì)需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，對(duì)下列細(xì)菌在體外具良好抗菌作用腸桿菌科的大部分細(xì)菌，包括枸椽酸桿菌屬、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等腸桿菌屬、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形菌屬、 沙門(mén)菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、耶爾森菌等。諾氟沙星體外對(duì)多重耐藥菌亦具抗菌活性。對(duì)青霉素耐藥的淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌亦有良好抗菌作用。諾氟沙星作為一種常用獸藥在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛使用。但因其具有一定的毒性，在動(dòng)物性食品中的殘留對(duì)食品衛(wèi)生和公共健康產(chǎn)生威脅。檢測(cè)諾氟沙星殘留的方法主要有儀器分析法和免疫學(xué)方法。化學(xué)分析方法因需要昂貴的儀器設(shè)備、對(duì)樣品前處理要求高，且需要配備專(zhuān)門(mén)操作人員等，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控檢測(cè)。免疫學(xué)方法，目前主要是Elisa(酶聯(lián)免疫吸附)方法，但該方法的核心試劑-單克隆抗體，因其制備和篩選過(guò)程繁瑣，且對(duì)操作技術(shù)要求很高，不利于廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)諾氟沙星的scFv抗體及編碼該抗體的基因序列及氨基酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供上述scFv抗體及其及其編碼基因在檢測(cè)諾氟沙星中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明人運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)，將小鼠抗體的重鏈、輕鏈可變區(qū)基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，并借助了 15肽的連接肽段將重鏈和輕鏈片段拼接成一條單鏈抗體scFv，接著將該scFv片段插入噬菌體展示載體pCANTABk中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌中，經(jīng)過(guò)3輪固相淘篩和鑒定，獲得了抗諾氟沙星的scFv單鏈抗體。其包括重鏈和輕鏈，其中，重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示。前述的scFv抗體，重鏈和輕鏈之間的連接肽段為(Glyjer)3。本發(fā)明還提供編碼上述scFv抗體的基因，其中，編碼scFv抗體重鏈的基因具有 SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，編碼scFv抗體輕鏈的基因具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有編碼上述scFv抗體的基因的載體。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述scFv抗體、編碼該抗體的基因、含有所述基因的載體或含有該載體的宿主細(xì)胞在檢測(cè)諾氟沙星中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供上述scFv抗體的制備方法，其是將編碼上述scFv抗體的基因構(gòu)建至表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后進(jìn)行蛋白的表達(dá)及分離純化。其中，所述表達(dá)載體為 pCANTAB5e。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果本發(fā)明檢測(cè)諾氟沙星的scFv抗體，主要采用競(jìng)爭(zhēng)性Elisa方法定性或定量檢測(cè)樣品中諾氟沙星的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；采用高特異性的諾氟沙星scFv抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測(cè)。能簡(jiǎn)便、高效地運(yùn)用本發(fā)明獲得的能分泌表達(dá)抗諾氟沙星重組抗體的重組菌株制備特異性的抗諾氟沙星scFv重組抗體。


圖1 :scFv-pCANTABk重組質(zhì)粒sfil和NotI雙酶切電泳圖，M :DL2000核酸分子量 Marker，1 10 :scFv-pCANTAB5e 酶切產(chǎn)物。圖2 為30個(gè)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生可溶性抗體scFv-ELISA檢測(cè)結(jié)果。圖3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖，1 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)胞周間質(zhì)，2 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)上清液，3 陰性對(duì)照。圖4 諾氟沙星誘導(dǎo)表達(dá)上清可溶性重組抗體IC5tl實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的試劑盒材料均為市售商品。實(shí)施例1免疫原及檢測(cè)原的偶聯(lián)制備1、材料牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺(EDC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、諾氟沙星(NFLX)標(biāo)準(zhǔn)品、透析膜、透析膜處理液、磁力攪拌儀、紫外分光光度儀。2、方法采用混合酸酐法，將諾氟沙星與蛋白大分子(BSA、OVA)進(jìn)行偶聯(lián)，制備免疫原和包被原。2. 1免疫原及包被原合成及純化A.中間產(chǎn)物制備a.取20mg藥物置于燒杯中，加入^iil DMF，若溶解不充分，可在超聲波中助溶；b.充分溶解后，加入25mg EDC和20mg NHS,磁力攪拌反應(yīng)；c.將以上燒杯用錫箔紙包裹好，室溫磁力攪拌反應(yīng)M小時(shí)，此液為A液。B.合成及初步純化a.取 50mg BSA (或 OVA)溶于 6ml PBS (0. 01M, ρΗ7· 4)中，充分溶解，此液為 B 液；b.在磁力攪拌下，將A液逐滴滴入B液中；c.用錫箔紙將燒杯包裹，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜；
d.待以上反應(yīng)完成，將過(guò)夜反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至處理好的透析袋中，于4°C冰箱中，用 PBS透析3天。透析中，前3次，每隔2小時(shí)換液，之后每8-12小時(shí)換液；e.透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液以4000rpm離心30min，取上清，_20°C凍存；f.取透析液在紫外分光光度儀下，檢測(cè)偶聯(lián)效果及偶聯(lián)物濃度測(cè)定表明 NFLX-BSA, NFLX-OVA偶聯(lián)物制備成功。實(shí)施例2小鼠免疫1、材料Balb/c小鼠(雄性、6周齡)、弗氏完全佐劑(sigma公司)、弗氏不完全佐劑(sigma 公司)、96孔酶標(biāo)板、免疫原NFLX-BSA、包被原NFLX-OVA、包被緩沖液(Na2CO3緩沖液0. 05N, PH9. 6)、封閉液脫脂乳PBS)、洗滌緩沖液(PBS、0. 1 % Tween20PBST)、終止液、鼠源抗諾氟沙星單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體(sigma公司)、TMB顯色液(sigma公司)。2、方法2.1小鼠免疫a.取100 μ g免疫原NFLX-BSA加入等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑；b.首免取8只6周齡Balb/c小鼠，采用背部多點(diǎn)注射免疫，0. 2ml/只，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組；C. 二免與三免免疫方法取100 μ g免疫原與等量弗氏不完全佐劑制成乳化劑， 背部多點(diǎn)免疫小鼠；每次免疫間隔15天。d.三免15天后，處死小鼠，摘取脾臟，_70°C凍存?？粝赂]取血，離心取血清。2. 2ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)a.將包被原 NFLX-OVA 用包被緩沖液，按照 0. 5mg/l、0. 4mg/l,0. 3mg/l,0. 2mg/l, 0. lmg/1濃度梯度，200 μ 1/孔，包被酶標(biāo)板，4°C包被過(guò)夜；b.洗滌棄包被液，用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；c.封閉向每孔加滿(mǎn)封閉液，于37 °C封閉1. 5小時(shí)；d.洗滌棄封閉液，用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；e.加血清抗體將小鼠血清抗體，用PBS按照1 IOOU 200,1 400,1 800、 1 1600、1 3200、1 6400、1 12800、1 25600、1 51200 進(jìn)行梯度稀釋后，加入封閉好的酶標(biāo)孔中，200 μ 1/孔，37°C孵育反應(yīng)2小時(shí)；f.洗滌棄血清抗體液，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；g.加酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體用PBS做1 10000稀釋?zhuān)?00 μ 1/孔， 37 °C孵育反應(yīng)1小時(shí)；h.洗滌棄酶標(biāo)抗體液，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；i.顯色加入200 μ 1/孔TMB顯色液，37°C孵育顯色45min左右；j.終止用200 μ 1/孔終止液，終止顯色，在450nm處讀值。3、結(jié)果通過(guò)間接ELISA檢測(cè)，包被原最佳濃度0. 2mg/mL·諾氟沙星免疫組的5只小鼠(1、 2、6、7、8號(hào))血清抗體效價(jià)達(dá)到1 1觀00以上，可滿(mǎn)足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。實(shí)施例3免疫小鼠脾細(xì)胞RNA的提取及通過(guò)RT-PCR獲得cDNA1、材料
免疫小鼠脾臟、細(xì)胞篩、DEPC處理的滅菌PBS、DEPC處理去離子水、總RNA提取試劑盒RNA iso Plus (Takara公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)。2、方法2. 1脾細(xì)胞總RNA的提取采用總RNA提取試劑盒RNAiso Plus，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。待RNA完全溶解后，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定獲得RNA的質(zhì)與量。將RNA凍存于-70°C。2. 2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA從-70°C低溫冰箱中取出獲得的小鼠脾臟RNA，在低溫環(huán)境下進(jìn)行操作。采用商品化總RNA提取試劑盒(Takara)，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增獲得cDNA第一鏈，-70°C保存。3、結(jié)果根據(jù)免疫小鼠血清抗體效價(jià)，選取了效價(jià)高的小鼠脾臟，通過(guò)提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，共制得諾氟沙星免疫組小鼠(共5只1、2、6、7、8號(hào))脾細(xì)胞cDNA文庫(kù)，cDNA濃度均達(dá)到 500ng/y L·實(shí)施例4scFv單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建1、材料免疫小鼠cDNA、重組噬菌體抗體擴(kuò)增系統(tǒng)(Recombinant PhageAntibody System) (27-9400-01)包括重鏈引物對(duì)、輕鏈引物混合物和linker引物混合物、RS引物混合物 (Pharmacia 公司)、long amp TaqDNA 聚合酶(NEB 公司)、瓊脂糖凝膠、DNAladder (DL2000、 lkb, TaKara公司)、凝膠回收試劑盒(TaKara公司)、質(zhì)粒提取試劑盒(TaKara公司)、T4 DNA連接試劑盒(NEB公司)、限制性?xún)?nèi)切酶(sfiI、NotI) (^ffiB公司)、pMD18_T simple載體系統(tǒng)(TaKara公司)、DH5 α工程菌、TGl宿主菌、pCANTAB5e噬菌體載體、0. IN CaCl2、酵母提取物、Tryptone、氨芐青霉素、卡那霉素。2、方法2. IVH 禾口 VL 基因 PCR 擴(kuò)增A.從超低溫冰箱取出cDNA，在低溫環(huán)境下構(gòu)建VH基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
；xPCR緩沖液20 μLIOmM dNTP (每種)6 pLcDNA (約 200ng )5 μ ν重鏈引物對(duì)4 μ Longamp Taq4 μL雙蒸水補(bǔ)足100 μL將以上反應(yīng)體系除longamp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增950C 5min 熱啟動(dòng)，加入 Longamp Taq 后94°C lmin，55°C 2min，65°C 2min ；；35 個(gè)循環(huán)后，65°C 10min，4°C 保溫。
PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(340bp)的目的條帶。B.從超低溫冰箱取出cDNA，在低溫環(huán)境下構(gòu)建VL基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如本節(jié)A所列，加入輕鏈引物混合物2 μ L，用雙蒸水補(bǔ)足100 μ L反應(yīng)體系。將以上反應(yīng)體系除long amp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，擴(kuò)增參數(shù)如本節(jié)A所列。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(32^p)的目的條帶。C. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化回收使用膠純化試劑盒(Takara公司)回收，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將純化回收獲得的VH和VL基因片段，在微量紫外分光光度計(jì)上測(cè)定片段的量。2. 2S OE-PCR 拼接 VH-Linker-VL 基因采取“VH-Linker-VL”形式將VH基因、Linker及VL基因進(jìn)行拼接。采用二步法 SOR-PCR法進(jìn)行。取以上純化獲得的VH和VL基因片段，在低溫環(huán)境下構(gòu)建scFv基因拼接PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系
5xPCR緩沖液IOpL
IOmM dNTP (每種)5 μ νVH基因片段約 50 ngVL基因片段約 50 ngLinker引物混合物4 μLLongamp Taq2 pL雙蒸水補(bǔ)足50 μL將以上反應(yīng)體系加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增 940C Imin，63 °C 4min，7 個(gè)循環(huán)。2. 3引入sfil、NotI酶切位點(diǎn)A.以上反應(yīng)結(jié)束，立即取出反應(yīng)體系，迅速加入預(yù)先配制好的以下反應(yīng)體系
5xPCR緩沖液IOpL
IOmMdNTP (每種)2 pL
RS引物混合物
Long amp Taq2 pL
雙蒸水32 μ 將以上反應(yīng)體系迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增940C lmin，55°C 2min，65°C 2min，30 個(gè)循環(huán)后，65°C 10min，4°C保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(750bp)的目的條帶。B. scFv拼接產(chǎn)物切膠純化回收使用凝膠純化試劑盒Oiiagen)回收，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將純化回收獲得的scFv基因片段，在微量紫外分光光度計(jì)上測(cè)定片段的量。C. scFv 基因連接 pCANTAB5e使用商品化T4DNA連接酶(ftOmega)，將經(jīng)sfil和NotI酶切處理的scFv片段與 pCANTABk載體連接。操作方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取適量pCANTABk載體和scFv基因片段，在低溫環(huán)境下構(gòu)建連接反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)諾氟沙星的SCFv抗體，其包括重鏈和輕鏈，其特征在于，重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，重鏈和輕鏈之間由連接肽段連接。
2.如權(quán)利要求1所述的scFv抗體，其特征在于，重鏈和輕鏈之間的連接肽段為 (Gly4Ser)30
3.編碼權(quán)利要求1或2所述scFv抗體的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，編碼scFv抗體重鏈的基因具有SEQID No. 3 所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，編碼scFv抗體輕鏈的基因具有SEQID No. 4 所示的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述基因的載體。
7.含有6所述載體的宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1或2所述的scFv抗體、權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的基因、權(quán)利要求6所述的載體或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞在檢測(cè)諾氟沙星中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述scFv抗體的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建至表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后進(jìn)行蛋白的表達(dá)及分離純化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為pCANTABk。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)諾氟沙星的scFv抗體，其包括重鏈和輕鏈，重鏈和輕鏈之間由柔性連接肽(Gly4Ser)3連接。重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ ID No.1和2所示。本發(fā)明還提供編碼上述scFv抗體的基因。本發(fā)明檢測(cè)諾氟沙星的scFv抗體，主要采用競(jìng)爭(zhēng)性Elisa方法定性或定量檢測(cè)樣品中諾氟沙星的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；初次建庫(kù)后，該scFv抗體的制備簡(jiǎn)單方便。采用高特異性的抗諾氟沙星scFv抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性好、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102212136SQ20111007436
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者侯曉林, 劉文娟, 趙揚(yáng), 鄭志明, 金社勝 申請(qǐng)人:商務(wù)部流通產(chǎn)業(yè)促進(jìn)中心