專利名稱：以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因轉(zhuǎn)化方法，特別涉及一種以花生半片成熟種子為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油料兼食用作物，是我國主要油料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一。花生具有豐富的營養(yǎng)價值。在我國，花生產(chǎn)量約占油料作物總產(chǎn)量的1/2。花生屬于雙子葉植物，是農(nóng)桿菌的天然宿主，但表現(xiàn)出與多數(shù)豆科作物相同的弱點——外源基因?qū)腚y度大，這使得花生的轉(zhuǎn)基因育種工作受到一定的限制，進(jìn)展緩慢。國外從二十世紀(jì)四十年代開始花生組織培養(yǎng)研究，我國則從七十年代開始研究， 目前已經(jīng)建立了多種花生離體培養(yǎng)的再生體系。自1983年第一例轉(zhuǎn)基因植物問世以來，雖然只有二十幾年的時間，但植物基因轉(zhuǎn)化的發(fā)展卻日新月異，碩果累累。自1994年Eapen和George首次報道獲得花生轉(zhuǎn)基因植株以來，花生的基因轉(zhuǎn)化方法得到很多改進(jìn)。在花生轉(zhuǎn)基因研究中，花生基因轉(zhuǎn)化方法對遺傳轉(zhuǎn)化是至關(guān)重要的，它決定了如何高效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并再生出轉(zhuǎn)基因植株?；ㄉ霓D(zhuǎn)化方法可以分為基于組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化和非組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化。基于組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化是以外植體，如成熟的胚或胚軸、子葉、幼葉，未成熟胚及其胚軸、子葉等為受體接受外源DNA，通過在添加有不同的外源激素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽或體細(xì)胞胚的發(fā)生，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化，其主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍介導(dǎo)兩種方法。轉(zhuǎn)化后的受體都要經(jīng)過組織培養(yǎng)篩選抗性的轉(zhuǎn)化系和再生抗性的轉(zhuǎn)化植株等過程。此過程需要無菌環(huán)境、人工光照和控制溫度、濕度等培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)化效率一般受到受體基因型、外植體類型、培養(yǎng)篩選方法和再生植株等諸多因素的影響，因此高效組培植株再生技術(shù)是基于組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化的必要的前提條件之一。近十幾年來，花生的遺傳轉(zhuǎn)化隨著再生和轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)步取得了一定的進(jìn)展。目前形成兩種主要的花生基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。一種為農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化，其以花生幼葉、子葉為外植體誘導(dǎo)不定芽或叢生芽，通過卡那霉素篩選、器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)化植株；另一種為基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，以未成熟胚或子葉和成熟胚、胚小葉為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織，通過潮霉素篩選獲得抗性轉(zhuǎn)化體細(xì)胞胚，再生轉(zhuǎn)化植株。但轉(zhuǎn)化及再生率過低，而且同樣的遺傳轉(zhuǎn)化體系在不同基因型的花生中轉(zhuǎn)化效果差異明顯，不能滿足現(xiàn)代基因工程進(jìn)行遺傳育種的需要?；诜墙M織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化方法是不通過組培，其方法有花粉管導(dǎo)入法、子房注射法等，但這些方法的基因轉(zhuǎn)化機制仍存在異議，而且基因的轉(zhuǎn)化受到諸如花期等因素的限制，基因轉(zhuǎn)化時間有一定的局限性。已有不通過組培，直接轉(zhuǎn)化成熟種胚生長點獲得轉(zhuǎn)化植株的報道。美國Mckently 等報道將保留一片子葉的種胚劃傷接種EHAlOl菌株。直接播種于消毒土內(nèi)，由種胚接種后直接長出轉(zhuǎn)化株，獲得轉(zhuǎn)基因花生植株，但種胚存活率只有15%，在800粒種胚中，只有10 株獲得種子，3株為陽性植株。Brar等報道成熟種胚頂端分生組織，經(jīng)過基因槍用包被含 ⑶S、Bar和番茄斑萎病毒外源基因的金粉轟擊，獲得8和3個轉(zhuǎn)基因系。不通過組培，通過農(nóng)桿菌和基因槍轉(zhuǎn)化成熟種胚，由生長點直接獲得轉(zhuǎn)化植株獲得成功，該項技術(shù)不需要組培設(shè)備，技術(shù)簡單，并可縮短選育時間的優(yōu)點，但仍需要解決存活率低，篩選效率低的問題。綜上所述，不管是基于組培或現(xiàn)有的非組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化法，都存在缺陷如再生周期長、存活率低、篩選難度大、在不同基因型花生品種間不穩(wěn)定和設(shè)備昂貴等問題。目前還沒有一種高通量、高效率、簡便易操作、成本低的花生轉(zhuǎn)基因方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種以花生半片成熟種子為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法，以解決現(xiàn)有的花生基因轉(zhuǎn)化方法中再生周期長、轉(zhuǎn)化及再生率低、轉(zhuǎn)化效果不穩(wěn)定等問題，本發(fā)明方法通量高、轉(zhuǎn)化效果好、不存在基因型依賴，而且操作簡便，成本低。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟(1)制備轉(zhuǎn)化的受體將花生種子去殼，用蒸餾水沖洗，再在蒸餾水中浸泡30-60 分鐘；然后消毒，去種皮，沿子葉間縫隙切開種子，取含胚的半粒種子，再沿胚的子葉節(jié)點切去胚芽(圖lc、圖2)，得到待轉(zhuǎn)化的外植體；(2)侵染液制備將含有待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種至YEP液體培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；將YEP液體培養(yǎng)液離心收集農(nóng)桿菌菌體，并將農(nóng)桿菌菌體重懸于含有乙酰丁香酮的液體MS培養(yǎng)基中，得到侵染液；(3)轉(zhuǎn)化將待轉(zhuǎn)化的外植體浸浮于侵染液中10-20分鐘，然后將外植體和侵染液在真空條件下靜置10-20分鐘；取出外植體，濾干菌液后平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng) 2-3天；再在光照Wh/d的條件下培養(yǎng)7-10天，得到共培養(yǎng)后的外植體；(4)移植將外植體移至滅菌砂土中，培養(yǎng)馴化后，移入溫室中繁殖。步驟(1)所述消毒是指將去殼后的花生種子在無菌環(huán)境下置于75% (V/V)乙醇中浸泡消毒20-30秒，然后用無菌水沖洗1-2次，再置于0. 1% (W/V) HgCl2溶液中浸泡消毒 8-10min,無菌水沖洗4_5次，濾干；步驟(2)所述農(nóng)桿菌為菌株EHA105 ；步驟(2)所述待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為植物表達(dá)載體PCAMBIA3301或 pCAMBIA1301-GmFAD3C ；步驟(2)所述液體MS培養(yǎng)基含有100m mol/L的乙酰丁香酮；步驟⑵所述侵染液的濃度為OD6tltl = 0. 6 1. 0 ；步驟( 所述真空條件是指真空度為25_40Kpa ；步驟(3)所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為MS+100uM Acetosyringone (乙酰丁香酮)；步驟(3)所述黑暗培養(yǎng)，其環(huán)境溫度為M ；步驟⑷所述滅菌砂土的濕度為70 85% ；步驟(4)所述溫室，其溫度M-30 V、濕度40-60 %。
本發(fā)明原理是子葉節(jié)點的細(xì)胞層具有高度分化能力，且分裂速度快，此時正是導(dǎo)入外源基因的最佳時期(稱之為植細(xì)細(xì)胞的感受態(tài))。利用植物本身的內(nèi)源激素使其分化成苗，可以避免外源激素對植物細(xì)胞的影響，減少變異，這樣具有獲得再生植株周期短、不經(jīng)過脫分化，體細(xì)胞無性系變異小、能較好保持受體細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)化的外源基因能實現(xiàn)穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明方法只需常規(guī)的菌株培養(yǎng)，無須基因槍等貴重儀器，不需要金粉等昂貴的實驗耗材，操作簡便易行，實驗周期短，轉(zhuǎn)化效率和存活率高，在不同基因型花生品種間的轉(zhuǎn)化效果穩(wěn)定。(2)本發(fā)明采用花生半片成熟種子作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，避免了傳統(tǒng)農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法所要求的嚴(yán)格的組織培養(yǎng)技術(shù)，而且種子具有自然的形態(tài)建成能力和遺傳傳遞能力，不存在再生植物的困難。


圖1是花生半片成熟種子外植體的制備示意圖；其中，Ia-消毒后的完整花生種子；Ib-花生兩片子葉；Ic-含胚的子葉，沿子葉節(jié)點的位置切開；Id-用作外植體的半片成熟種子。圖2是花生成熟種子胚的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1-子葉，2-胚，3-未成熟小葉，4-頂端分生組織，5-葉腋分生組織，6-子葉節(jié)點，7-胚軸，8-胚根，9-胚根尖。圖3是植物表達(dá)載體pCAMBIA3301的質(zhì)粒圖。圖4是實施例1中轉(zhuǎn)抗除草劑(bar)基因的粵油7號T1代植株P(guān)CR鑒定電泳圖。圖5是實施例1中轉(zhuǎn)抗除草劑(bar)基因的珍珠紅一號T1代植株P(guān)CR鑒定電泳圖。圖6是重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-GmFAD3C的質(zhì)粒圖。圖7是實施例2中轉(zhuǎn)GmFAD3C基因的粵油7號T2代植株P(guān)CR鑒定電泳圖。圖8是實施例2中轉(zhuǎn)GmFAD3C基因的粵油13號T2代植株P(guān)CR鑒定電泳圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1 以花生半片成熟種子為外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法用于抗除草劑(bar)基因的轉(zhuǎn)化(1)選取成熟飽滿的花生(粵油7號、珍珠紅一號)種子，將花生種子去殼后用蒸餾水沖洗三次，再在蒸餾水中浸泡30分鐘。在超凈工作臺上用75% (V/V)乙醇浸泡消毒 30秒，無菌水沖洗1-2次，置于0. 1 % (WA)HgCl2溶液中浸泡消毒lOmin，無菌水沖洗4_5 次，用無菌濾紙吸干表面的水分，去種皮，沿子葉間縫隙切開種子，取含胚的半粒種子，再沿胚的子葉節(jié)點切去胚芽(如圖lc、圖2所示)，得到待轉(zhuǎn)化的外植體。(2)以抗除草劑(bar)基因為待轉(zhuǎn)基因，該基因的序列包含在植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301 (如圖3)中。將該載體采作電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株中，然后將
5EHA105菌株按照1 100的體積比接種至200ml Y^液體培養(yǎng)液中(含50mg/L卡那霉素) 中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物于3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘收集菌體，將農(nóng)桿菌菌體重懸于4°C預(yù)冷的液體MS培養(yǎng)基(含有l(wèi)OOmmol/L乙酰丁香酮)，使MS培養(yǎng)基的0D_ = 0.6，得到侵染液。(3)將外植體浸浮在上述的侵染液中，使農(nóng)桿菌與外植體充分接觸，浸浮20分鐘， 再在真空條件下靜置(真空度為25-40Kpa) 10分鐘，取出外植體，濾干菌液后平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+lOOuM乙酰丁香酮)中，于黑暗培養(yǎng)3天，再在光照16h/d的培養(yǎng)條件下， 繼續(xù)培養(yǎng)一周，得到共培養(yǎng)后的外植體；(4)將步驟C3)中共培養(yǎng)好外植體移至濕度為70 85%的滅菌砂土中，培養(yǎng)馴化后；便可將其移入溫室(溫度M°C、濕度60% )生長、開花、結(jié)實。從外植體制備至T1代種子的收獲總用時與現(xiàn)有的通過組培方法得到的轉(zhuǎn)基因種子提前了 3個月至半年時間，與現(xiàn)有的非組培的轉(zhuǎn)基因方法提前1-3個月。按上述轉(zhuǎn)化方法，對供試材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化處理，共處理了不同花生種子300粒， 存活率為56%，所有生存下來的種胚都能結(jié)果，并篩選出T1 Rpcr陽性植株19株。篩選結(jié)果見表1。對本實例轉(zhuǎn)抗除草劑(bar)基因的粵油7號T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖4所示。其中，M:DL2000 ； 1-22 不同轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定結(jié)果，可見其中1、3、5、6、10、 13、16、17、19、22呈陽性?！癬”:以非轉(zhuǎn)化植株為模板的陰性對照；“ + ”:以pCAMBIA3301質(zhì)粒為模板的陽性對照；PCR引物為篩選標(biāo)記基因bar基因的特異性引物。對轉(zhuǎn)抗除草劑(bar)基因的珍珠紅一號T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖 5所示。其中，M:DL2000 ；1-21 不同轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定結(jié)果，可見其中2、3、8、11、12、17 呈陽性；“ + ” 以PCAMBIA3301質(zhì)粒為模板的陽性對照；“_”以非轉(zhuǎn)化植株為模板的陰性對照。PCR引物為篩選標(biāo)記基因bar基因的特異性引物。引物序列為
權(quán)利要求
1.一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括如下步驟(1)將花生種子去殼，用蒸餾水沖洗，再在蒸餾水中浸泡30-60分鐘；然后消毒，去種皮，沿子葉間縫隙切開種子，取含胚的半粒種子，再沿胚的子葉節(jié)點切去胚芽，得到待轉(zhuǎn)化的外植體；(2)將含有待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種至YEP液體培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；將YEP 液體培養(yǎng)液離心收集農(nóng)桿菌菌體，并將農(nóng)桿菌菌體重懸于含有乙酰丁香酮的液體MS培養(yǎng)基中，得到侵染液；(3)將待轉(zhuǎn)化的外植體浸浮于侵染液中10-20分鐘，然后將外植體和侵染液在真空條件下靜置10-20分鐘；取出外植體，濾干菌液后平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)2-3天； 再在光照16h/d的條件下培養(yǎng)7-10天，得到共培養(yǎng)后的外植體；(4)將共培養(yǎng)后的外植體移至滅菌砂土中，培養(yǎng)馴化后，移入溫室中繁殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法， 其特征在于步驟(1)所述消毒是指將去殼后的花生種子在無菌環(huán)境下置于體積分?jǐn)?shù)為 75%的乙醇中浸泡消毒20-30秒，然后用無菌水沖洗1-2次，再置于質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0. 1% 的HgCl2溶液中浸泡消毒8-lOmin，然后用無菌水沖洗4_5次，濾干。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法， 其特征在于步驟(2)所述農(nóng)桿菌為菌株EHA105。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟⑵所述待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為植物表達(dá)載體PCAMBIA3301或 pCAMBIA1301-GmFAD3C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法， 其特征在于步驟(2)所述液體MS培養(yǎng)基含有l(wèi)OOmmol/L的乙酰丁香酮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法， 其特征在于步驟( 所述侵染液的濃度為0D_ = 0. 6 1. 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法， 其特征在于步驟(3)所述真空條件是指真空度為25-40Kpa。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法， 其特征在于步驟( 所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是含有IOOuM乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法， 其特征在于步驟C3)所述黑暗培養(yǎng)，其環(huán)境溫度為M ^°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(4)所述滅菌砂土的濕度為70 85%;所述溫室，其溫度為M-30°C、 濕度為40-60%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法，該方法包括(1)將花生種子去殼，用蒸餾水沖洗和浸泡；然后消毒，去種皮，切開種子，取含胚的半粒種子，沿胚的子葉節(jié)點切去胚芽，得到外植體；(2)將農(nóng)桿菌接種至YEP液體培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜；離心收集農(nóng)桿菌菌體，并重懸于包含乙酰丁香酮的液體MS培養(yǎng)基中，得到侵染液；(3)將待外植體浸浮于侵染液中；取出外植體平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)2-3天；再在光照下培養(yǎng)7-10天，得到共培養(yǎng)后的外植體；(4)將共培養(yǎng)后的外植體移至滅菌砂土中，培養(yǎng)馴化后，移入溫室中繁殖。本發(fā)明方法實驗周期短，轉(zhuǎn)化效率和存活率高，在不同基因型花生品種間的轉(zhuǎn)化效果穩(wěn)定；避免了傳統(tǒng)共培養(yǎng)法所要求的嚴(yán)格的組織培養(yǎng)技術(shù)。
文檔編號C12N15/84GK102191269SQ20111007492
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者劉海燕, 梁炫強, 溫世杰 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所