專利名稱：草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)Po-5菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一株產(chǎn)果膠酶的草酸青霉菌 oxalicum) Po-5菌株及其液體發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的方法。
背景技術(shù)：
果膠酶的研究應(yīng)用迄今已有七十多年的歷史?，F(xiàn)在許多國家都有商品果膠酶制劑出售，品種也日趨多樣化，其產(chǎn)量己躋身世界四大酶制劑行列。果膠酶用途廣泛，在很多領(lǐng)域中都能得到良好的應(yīng)用。在水果加工業(yè)中，能破壞果汁中懸浮物的穩(wěn)定性，使其凝聚沉淀，果汁得到澄清，降低果汁的粘度。在飼料生產(chǎn)工業(yè)中， 果膠酶可降低飼料的粘度，促進飼料在動物消化道內(nèi)的消化吸收。在紡織工業(yè)中，果膠酶處理過的棉織物被去除了大部分的果膠質(zhì)，同時也去除了大部分的棉蠟物質(zhì)和其他雜質(zhì)，最終達到棉織物精練的目的。另外，果膠酶在木質(zhì)防腐、生物制漿、環(huán)境保護、污物軟化處理等行業(yè)中也有著重要作用?；诠z酶特有的這些特點和用途，目前有關(guān)果膠酶高產(chǎn)菌株的篩選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等的研究異?；钴S，成為生物酶學(xué)領(lǐng)域中一個新的研究熱點。但目前可用于果膠酶生產(chǎn)且有自主產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)菌株還很缺乏。中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)?0081008擬48. 2申請日2008-04-26)公開了動物源草酸青霉發(fā)酵產(chǎn)飼料級果膠酶工藝，一種以鵝體內(nèi)分離所得到的草酸青霉發(fā)酵產(chǎn)飼料級果膠酶工藝，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。通過固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)出酶活力大，保存期長，耐貯性好， 各組分百分含量穩(wěn)定和純度高的酶制劑。生產(chǎn)的果膠酶制劑總酶活力達10123. 22U · G-1 ； 聚半乳糖醛酸酶活力5101. 23U .G—1，為總酶活力的50% ；果膠酯酶活力6986. 52U .G—1，為總酶活力的69% ；果膠裂解酶0. 56U · G-1，為總酶活力的0. 005%。中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)?3120793.6申請日2003-03-20)公開了草酸青霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶，發(fā)明以甜菜廢渣作為碳源，以硫酸氨作為氮源，接種草酸青霉 BZH-2002菌株，在接觸空氣條件下，于溫度30°C左右，環(huán)境相對濕度70%左右固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)72小時左右達到產(chǎn)酶高峰。用水浸提培養(yǎng)物，過濾，濾液即果膠酶液。經(jīng)脫膠法測定酶活力，果膠酶產(chǎn)率達到1. 2 X IO5單位/克甜菜渣。

發(fā)明內(nèi)容
基于現(xiàn)今市場上高活性果膠酶的價格昂貴，且主要被國外市場壟斷，本發(fā)明的第一個目的是提供一種草酸青霉菌oxalicum) Po-5菌株，該草酸青霉菌 iPenicillium oxalicum)Vo-h菌株為從自然生境中篩選得到的高產(chǎn)果膠酶的菌株，并用液體發(fā)酵的形式來生產(chǎn)果膠酶，以期降低果膠酶的生產(chǎn)成本、優(yōu)化工藝、降低環(huán)境壓力。本發(fā)明的第二個目的是提供上述的草酸青霉菌、PeniCillium oxalicum) Po-5菌株制備果膠酶的方法。為了實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案草酸青霉菌milliwn oxalicum) o-^菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO: M 2010350，保藏日期是2010年12月14日。該菌株篩自金華東陽荷塘中的污泥，其ITS基因序列已登錄于Genbank，登錄號為HQ680452。上述草酸青霉菌iPenicillium oxalicum) Po_5菌株的培養(yǎng)特征草酸青霉Po_5 菌株在PDA培養(yǎng)基上，28°C，3 d即形成典型菌落，菌落呈藍綠色，邊緣為白色，直徑19 mm, 輪廓規(guī)則，外觀呈絨毛狀；顯微鏡下觀察，菌絲細胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，藍綠色。為了實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明還公開了采用上述的草酸青霉菌 oxalicum) Po-5菌株用于制備果膠酶。該方法采用包括桔皮與米糠的培養(yǎng)基基質(zhì)，在溫度 26 30°C、pH5. 5 6. 5、搖床轉(zhuǎn)速140 200 PmirT1的條件下，發(fā)酵后獲發(fā)酵液；取發(fā)酵液經(jīng)離心，其上清液即為果膠粗酶液。作為進一步的改進，該方法包括以下的步驟
1)草酸青霉菌(/^ iciBi 菌種使用前菌株經(jīng)固體 PDA斜面培養(yǎng)基活化后，用無菌水配成0. 5 X IO6 2. OX IO6個每毫升的孢子懸浮液；
2)然后取搖瓶裝液量的1% 8%的孢子懸浮液接入種子培養(yǎng)基，在洸 30°C，140 200 rmirr1,培養(yǎng)M h后作為種子液；
3)取搖瓶裝液量的5% 15%的種子液接入搖瓶培養(yǎng)基中，在沈 30°C，繼續(xù)培養(yǎng)70 h后獲發(fā)酵液；
4)取發(fā)酵液經(jīng)5000 20000 r*min_1離心8 20 min，其上清液即為粗酶液。作為優(yōu)選，上述的PDA斜面培養(yǎng)基包括馬鈴薯150 250份、葡萄糖15 25份、 瓊脂15 20份、水1 000份，ρΗ5· 5 6. 5。作為優(yōu)選，上述的種子培養(yǎng)基包括果膠30 50份，(NH4)2SO4 8 15份，KH2PO4 35 40 份，K2HPO4 · 3Η20 1 3 份，水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。作為優(yōu)選，上述的搖瓶培養(yǎng)基包括桔皮粉30 80份，米糠40 100份， (NH4)2SO4 8 15 份，KH2PO4 35 40 份，K2HPO4 ·3Η20 1 3 份，水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，從自然生境中篩選高產(chǎn)果膠酶的菌株，并用液體發(fā)酵的形式來生產(chǎn)果膠酶，以期降低果膠酶的生產(chǎn)成本、優(yōu)化工藝、降低環(huán)境壓力。該菌株利用天然廉價的桔皮與米糠等作為培養(yǎng)基基質(zhì)，發(fā)酵得到的果膠酶活可達1. 39X IO5 UmirT^mr1，屬高產(chǎn)果膠酶菌株。Po-5菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶在30 50°C，pH 5.0 左右時能夠保持良好的穩(wěn)定性。


圖1為基于Po-5菌株的ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2為Po-5菌株黃色水解圈的培養(yǎng)特征。圖3為Po-5菌株在PDA上的菌落培養(yǎng)特征。圖4為Po-5菌株有隔菌絲的顯微形態(tài)特征。圖5為Po-5菌株分生孢子梗和分生孢子的顯微形態(tài)特征。圖6為Po-5菌株分分生孢子的顯微形態(tài)特征。
圖7為采用本發(fā)明Po-5菌株制備的果膠酶的熱穩(wěn)定性測試圖。圖8為采用本發(fā)明Po-5菌株制備的果膠酶的pH穩(wěn)定性。生物材料保藏說明
草酸青霉菌、PeniCilliim oxalicum)Vo-h菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，其保藏編號為=CCTCC NO: M 2010；350，保藏日期是2010年12月14日。
具體實施例方式一、Po-5 菌株。用來液體發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的菌株是草酸青霉菌oxalicum) Po-5 菌株，該菌株篩自金華東陽荷塘中的污泥，其ITS基因序列已登錄于Genbank，登錄號為 HQ680452?；赑o_5菌株的ITS序列建立了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。本發(fā)明所用的草酸青霉菌iPenicillium oxalicum) Po-5菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCC M 2010350，保藏日期為2010年12月14日。Po-5菌株的培養(yǎng)特征草酸青霉Po-5菌株在PDA培養(yǎng)基上，28°C,3 d即形成典型菌落，菌落呈藍綠色，邊緣為白色，直徑19 mm，輪廓規(guī)則，外觀呈絨毛狀。顯微鏡下觀察，菌絲細胞絲狀交織，具橫隔。分生孢子梗不具足細胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，藍綠色。經(jīng)數(shù)代連續(xù)培養(yǎng)，生物學(xué)性狀和產(chǎn)酶特性基本穩(wěn)定(圖2 圖 6所示)。二、用Po-5菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶。(一)培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 20 g、水1 000 mL, pH 6. 0。種子培養(yǎng)基果膠40 g, (NH4)2SO4 10 g,KH2PO4 38 g，K2HPO4 ·3Η20 2 g，水 1 000 mL, pH 6· O。搖瓶培養(yǎng)基桔皮粉50 g，米糠 60 g, (NH4)2SO4 10 g, KH2PO4 38 g, K2HPO4 · 3H20 2 g,7jC 1 000 mL, pH 6. 0。(二)液體發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶實例。草酸青霉菌(/^ iciBi oxalicum) Po-5菌種用甘油保藏于_20°C冰箱中，使用前菌株經(jīng)固體PDA斜面培養(yǎng)基活化后，用無菌水配成1. OX IO6的孢子懸浮液，然后取2 mL (搖瓶裝液量的5%)孢子懸浮液接入種子培養(yǎng)基(250 mL三角瓶裝40 !^)，在^°C，160 !■ mirT1，培養(yǎng)M h后作為種子液。取3. 6 mL (搖瓶裝液量的9%)種子液接入搖瓶培養(yǎng)基中 (250 mL三角瓶裝40 mL)，繼續(xù)培養(yǎng)70 h后獲發(fā)酵液。取發(fā)酵液經(jīng)10 000 r-min"1離心10 min，其上清液即為粗酶液。粗酶液酶活利用DNS (3，5—二硝基水楊酸)法，在MO nm處用紫外分光光度計測定其酶活性。最終得到粗酶液果膠酶酶活約為1.39X 105 UmirT^mr1。三、Po-5菌株生產(chǎn)的果膠酶性質(zhì)。(一)熱穩(wěn)定性將粗酶液分別在301、401、501、601、701水浴下保溫1 h、2 h、3 h、4 h，然后按照
酶活力測定方法分別測定其酶活。結(jié)果顯示Po-5菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶在30°C 50°C溫度范圍內(nèi)維持穩(wěn)定(圖7)。
(二)pH 穩(wěn)定性
將粗酶液分別在PH值為4.0 8.0的緩沖液中處理1 h、2 h、3 h、4h，然后按照酶活力測定方法分別測定其酶活。結(jié)果顯示Po-5菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶在pH 5.0左右時穩(wěn)定性最好(圖8)。
權(quán)利要求
1.草酸青霉菌菌株，其特征在于該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為=CCTCC NO: M 2010350，保藏日期是2010年12月14日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌(/^fliciBiy oxalicum) Po-5菌株，其特征在于草酸青霉Po-5菌株在PDA培養(yǎng)基上，28°C,3 d即形成典型菌落，菌落呈藍綠色，邊緣為白色，直徑19 mm，輪廓規(guī)則，外觀呈絨毛狀；顯微鏡下觀察，菌絲細胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，藍綠色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌(/^fliciWi腫oxalicum) o~^菌株用于制備果膠酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌iPenicilliwnoxalicum ) Po-5菌株制備果膠酶的方法，其特征在于該方法采用包括桔皮與米糠的培養(yǎng)基基質(zhì)，在溫度26 30°C、 pH5. 5 6. 5、搖床轉(zhuǎn)速140 200 r-min"1的條件下，發(fā)酵后獲發(fā)酵液；取發(fā)酵液經(jīng)離心，其上清液即為果膠粗酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的草酸青霉菌腫菌株制備果膠酶的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟(1)草酸青霉菌、PeniciIliumoxalicum) Po-5菌種使用前菌株經(jīng)固體PDA斜面培養(yǎng)基活化后，用無菌水配成0. 5 X IO6 2. OX IO6個每毫升的孢子懸浮液；(2)然后取搖瓶裝液量的1% 8%的孢子懸浮液接入種子培養(yǎng)基，在沈 30°C，140 200 rmiiT1,培養(yǎng)24 h后作為種子液;(3)取搖瓶裝液量的5% 15%的種子液接入搖瓶培養(yǎng)基中，在沈 30°C，繼續(xù)培養(yǎng)70 h后獲發(fā)酵液；(4)取發(fā)酵液經(jīng)5000 20000r-min"1離心8 20 min，其上清液即為粗酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的草酸青霉菌腫菌株制備果膠酶的方法，其特征在于PDA斜面培養(yǎng)基包括馬鈴薯150 250份、葡萄糖15 25份、瓊脂 15 20 份、水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的草酸青霉菌腫菌株制備果膠酶的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基包括果膠30 50份，(NH4)2SO4 8 15份，KH2PO4 35 40 份，K2HPO4 · 3H20 1 3 份，水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的草酸青霉菌腫菌株制備果膠酶的方法，其特征在于搖瓶培養(yǎng)基包括桔皮粉30 80份，米糠40 100份，(NH4)2SO4 8 15 份，KH2PO4 35 40 份，K2HPO4 · 3H20 1 3 份，水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一株產(chǎn)果膠酶的草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)Po-5菌株及其液體發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的方法。草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)Po-5菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO:M2010350，保藏日期是2010年12月14日。本發(fā)明從自然生境中篩選高產(chǎn)果膠酶的菌株，并用液體發(fā)酵的形式來生產(chǎn)果膠酶，以期降低果膠酶的生產(chǎn)成本、優(yōu)化工藝、降低環(huán)境壓力。該菌株利用天然廉價的桔皮與米糠等作為培養(yǎng)基基質(zhì)，發(fā)酵得到的果膠酶活可達1.39×105U min-1 ml-1，屬高產(chǎn)果膠酶菌株。Po-5菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶在30～50℃，pH5.0左右時能夠保持良好的穩(wěn)定性。
文檔編號C12R1/80GK102154124SQ20111007468
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者宋迤明, 蔣冬花, 藍麗精, 韋風(fēng) 申請人:浙江師范大學(xué)