番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，它的步驟如下：（1）從番茄上分離的黃萎病病菌分生孢子做侵染源，培養(yǎng)侵染的黃萎病菌分生孢子；（2）用侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片；（3）統(tǒng)計(jì)葉片發(fā)病情況，劃分抗性等級。本發(fā)明根據(jù)植物抗病性研究進(jìn)展和黃萎病發(fā)病特點(diǎn)，采用病菌分生孢子，接種番茄離體葉片，進(jìn)行番茄黃萎病的抗性鑒定，具有方便、快速、簡單易行、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及了一種番前黃萎病抗性的離體鑒定方法，特別涉及一種番前黃萎病抗性離體鑒定的侵染源、接種數(shù)量和方法。

【背景技術(shù)】
[0002]番茄黃萎病是保護(hù)地和露地番茄生產(chǎn)的重要病害之一?？纱蠓冉档头训漠a(chǎn)量和品質(zhì)，是番前生產(chǎn)的一個主要限制因素。病原(Vertillium t/aA7iae)，半知菌亞門、淡色孢科、輪枝菌屬。該病具有潛伏侵染和連續(xù)發(fā)作等特點(diǎn)，一旦發(fā)病，無藥可治，番茄黃萎病多發(fā)生于番茄生長后期，葉片由下向上逐漸變黃，首先是葉緣變色，變色沿葉脈擴(kuò)大，輪廓清晰，成為“V”形黃斑，以后下部葉片明顯枯死。發(fā)病重的結(jié)果小或不能結(jié)果，剖開病株莖部，維管束變淺褐色，病株并不迅速枯死，而是逐漸落葉，表現(xiàn)慢性的向上枯死。因此，鑒定番茄黃萎病抗性種質(zhì)，培育抗性品種，是防治黃萎病的重要舉措。目前黃萎病抗性鑒定多用分生孢子做侵染源侵染活體植株。尤海波等(2003)研宄結(jié)果表明2片真葉接種黃萎病菌，接種濃度為10 7孢子/ ml，采用浸根接種法，浸根20min，溫度為20?30°C，15d調(diào)查。尤海波(2003)對98份番茄材料進(jìn)行了抗病性篩選。篩選出了 2份免疫材料。3份高抗材料及46份抗病材料和21份耐病材料，其中抗病材料占大多數(shù)。苗期鑒定方法由于受環(huán)境因素影響較大，很難快速鑒定出抗病材料。而鑒定栽培品種的抗性資源及抗性基因，通過育種使基因積聚，是今后抗性育種的重要方向。因此，發(fā)展一種合適的抗性鑒定方法，鑒定不同品種的抗性，培育抗性品種，是十分必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所解決的問題是目前黃萎病抗性鑒定多用分生孢子做侵染源，侵染植株幼苗，一方面由于苗期植物生長比較敏感受環(huán)境影響較大，導(dǎo)致鑒定結(jié)果可靠性不高；另一方面是分生孢子的數(shù)量對發(fā)病的速度、發(fā)病程度影響較大，難以控制最佳的分生孢子濃度抗性。本發(fā)明提供一種番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，用培養(yǎng)的分生孢子使之處于萌發(fā)狀態(tài)，侵染離體的組織，不僅符合黃萎病侵染的規(guī)律，而且致病力適中，發(fā)病均勻，植物體選擇番茄生長期的葉片，環(huán)境條件易于控制，可以較好的、快速的鑒定番茄品種對黃萎病的抗性。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，它的步驟如下:
(1)從番茄上分離的黃萎病病菌分生孢子做侵染源，培養(yǎng)侵染的黃萎病菌分生孢子，得到侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液；
(2)用侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片；
(3)統(tǒng)計(jì)葉片發(fā)病情況，劃分抗性等級。
[0005]所述步驟(I)中侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液的方法如下:
①將黃萎病菌分生孢子接種于PDA培養(yǎng)基上，置恒溫光照培養(yǎng)箱中，25°C光照恒溫培養(yǎng)30天； ②將步驟①中成熟的分生孢子取下，在無菌的條件下，置滅菌的研缽中研碎，加入PDA液體培養(yǎng)基；
③將步驟②中PDA液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入45ml離心管中，置離心機(jī)中，再1800轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心5分鐘；
④取步驟③離心管中的PDA液體培養(yǎng)基的上清液，轉(zhuǎn)入滅菌的三角燒瓶中，取少量懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板置400倍顯微鏡計(jì)算黃萎病菌分生孢子濃度，然后將懸浮液調(diào)節(jié)至I X 16個/暈升；
⑤將步驟④中懸浮液置25°c恒溫振蕩搖床中，在200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)12小時(shí)；
⑥將步驟⑤中培養(yǎng)后的懸浮液再2000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘，去上清，用蒸餾水重懸沉淀，將黃萎病菌分生孢子濃度調(diào)節(jié)至I X 16個/毫升，得到侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液。
[0006]所述步驟①中PDA培養(yǎng)基的配方為:去皮馬鈴薯:200g，蔗糖20g，瓊脂15_20g，蒸餾水1000ml，操作步驟:將去皮馬鈴薯切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘?jiān)?；向?yàn)V液中分別加入瓊脂和蔗糖加熱融化，定容至100ml ;將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C高壓蒸汽滅菌20min ;在無菌條件下，將25ml融化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固，編號待用。
[0007]所述步驟②中PDA液體培養(yǎng)基的配方為:去皮馬鈴薯:200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml，操作步驟:將去皮馬鈴薯，切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘?jiān)幌驗(yàn)V液中加入葡萄糖，加熱融化，定容至100ml ;將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C高壓蒸汽滅菌20min，待用。
[0008]所述步驟(2)中用侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片的方法如下:選取番茄品種，將番茄的離體葉片葉柄插入步驟⑥中侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液中，待黃萎病菌分生孢子懸浮液液吸收完全后，將離體葉片葉柄插入滅菌水中培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱中25 °C恒溫培養(yǎng)七天。
[0009]通過模式植物研宄表明，抗病性機(jī)制是病原真菌和植物宿主相互作用的結(jié)果；分生孢子萌發(fā)、侵入所產(chǎn)生的一系列誘導(dǎo)因子是影響植物產(chǎn)生抗性的重要因素(Jan A.L.vanKan, 2006)ο根據(jù)植物抗病性研宄進(jìn)展和黃萎病發(fā)病特點(diǎn)，米用病菌分生孢子，接種番前尚體葉片，進(jìn)行番茄黃萎病的抗性鑒定，具有方便、快速、簡單易行、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):根據(jù)植物抗病性研宄進(jìn)展和黃萎病的發(fā)病特點(diǎn)，用經(jīng)過處理的黃萎菌分生孢子，接種經(jīng)過處理的離體葉片，進(jìn)行番茄黃萎病抗性鑒定，具有方便、快速、簡單易行、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。用分生孢子做侵染源，符合黃萎病菌侵染發(fā)病的規(guī)律；用離體葉片做試材，有效避免了用幼苗或成年植株帶來的損失和不便；接種的分生孢子數(shù)量可控
IX 16個/毫升，更能顯示番茄品種抗性的差異。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的黃萎菌和萌發(fā)的分生孢子；
圖2為番茄葉片浸泡分生孢子溶液病情程度分級(自左到右為O?IV級)。

【具體實(shí)施方式】
[0012](—)、用從番前上分離的黃萎病病菌分生孢子做侵染源，侵染的黃萎病菌分生孢子的培養(yǎng)；
1:PDA培養(yǎng)基的配制配方:去皮馬鈴薯:200g
蔗糖(C12H22011 CHG/T3462-1999 北京化工廠):20g
瓊脂(DH0110 — 1.1北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司):15-20g
蒸餾水(GB50172 — 92):1OOOml
操作步驟:
1)將去皮馬鈴薯秤取200g，切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘?jiān)?br> 2)向?yàn)V液中分別加入瓊脂和蔗糖加熱融化，定容至100ml；
3)將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；
4)將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋(TOMY/ES-315，日本TOMY)中，121°C高壓蒸汽滅菌20min;
5)在無菌條件下，將25ml融化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固，編號待用；
2:改良的PDA液體培養(yǎng)基的配制
配方:去皮馬鈴薯:200g
葡萄糖(HG/T3475—1999北京化學(xué)試劑公司): 20g
蒸餾水(GB50172 — 92):1OOOml
1)將去皮馬鈴薯秤取200g，切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘?jiān)?br> 2)向?yàn)V液中加入葡萄糖，加熱融化，定容至100ml；
3)將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；
4)將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋(TOMY/ES-315，日本TOMY)中，121°C高壓蒸汽滅菌20min，待用；
3:將菌塊接種于PDA培養(yǎng)基上，置恒溫光照培養(yǎng)箱(RXZ，寧波江南儀器廠)中，25°C光照恒溫培養(yǎng)30天；
4:將成熟的分生孢子取下，在無菌的條件(EN-12469-2000生物安全柜)下，置滅菌的研缽中研碎，加入PDA液體培養(yǎng)基；
5:將PDA液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入45ml離心管(海門市博陽實(shí)驗(yàn)器材廠)中，置離心機(jī)(eppendorf 5480R) 1800 轉(zhuǎn) / 分鐘離心 5 分鐘；
6:取上清，轉(zhuǎn)入滅菌的三角燒瓶中，取少量懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板置400倍顯微鏡(36XL上海宙山精密光學(xué)儀器有限公司)下計(jì)算分生孢子濃度，然后將懸浮液調(diào)節(jié)至
IX 16個/毫升;
7:將懸浮液置25°C恒溫振蕩搖床(THERMO 420,賽默飛/Thermo Fisher)中，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)12小時(shí)；
8:將懸浮液2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清，用蒸餾水重懸沉淀，將分生孢子濃度調(diào)節(jié)至I X 16個/毫升； (二)、用一定量濃度分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片；
9:番前品種:選取12個番前品種進(jìn)行鑒定，抗病性最強(qiáng)的1221，抗病性最弱的MoneyMarker，及太空99F1、GBS-改良908、重茬帝龍F(tuán)1、白果強(qiáng)豐、上海908、寶冠一號F1、經(jīng)典F1、金盾、粉鉆石、達(dá)利寶；
10:將離體葉片葉柄插入上述第8步制備好的分生孢子懸浮液中，待溶液吸收完全后，將離體葉片葉柄插入滅菌水中培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱(RXZ，寧波江南儀器廠)中25°C恒溫培養(yǎng)(葉片取生長部位一致，表現(xiàn)一致的健康葉片)；
11:七天后取出葉片，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，劃分抗性等級；
(三)、統(tǒng)計(jì)葉片發(fā)病情況，劃分抗性等級
12:抗病性分級:
按接種點(diǎn)病斑擴(kuò)展情況劃分:
O級:葉片正常，無病癥
I級:葉片稍微有些變軟
II級:發(fā)病部位面積小于整個葉片的1/4或中度萎蔫
III級:發(fā)病部位面積大于1/4小于3/4或出現(xiàn)嚴(yán)重萎蔫
IV級:葉片枯死或發(fā)病部位面積大于3/4
根據(jù)抗病等級的劃分對12份品種做抗病性分析，番茄品種1221、GBS-改良和上海908病情指數(shù)為0，表現(xiàn)為免疫；寶冠一號、金盾病情指數(shù)為16.7，表現(xiàn)為抗??；太空99F1和粉鉆石病情指數(shù)為33.3，表現(xiàn)為中抗；經(jīng)典F1、達(dá)利寶和重茬帝龍F(tuán)l病情指數(shù)為50?55，表現(xiàn)為感??；白果強(qiáng)豐病情指數(shù)為75，Money Marker病情指數(shù)為85感病。本研宄就12個品種分別用幼苗灌根法進(jìn)行抗病性鑒定，兩種鑒定方法在鑒定結(jié)果上具有高度一致性。
[0013]圖2為黃萎菌侵染后抗病的表現(xiàn)，自左到右為O:葉片正常，無病癥；I級:葉片稍微有些變軟；II級:發(fā)病部位面積小于整個葉片的1/4或中度萎蔫；III級:發(fā)病部位面積大于1/4小于3/4或出現(xiàn)嚴(yán)重萎蔫；IV級:葉片枯死或發(fā)病部位面積大于3/4。便于統(tǒng)計(jì)和觀察。符合黃萎病菌侵染發(fā)病的規(guī)律；用離體葉片做試材，有效避免了用幼苗或成年植株帶來的損失和不便。
【權(quán)利要求】
1.一種番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于，它的步驟如下: (1)從番茄上分離的黃萎病病菌分生孢子做侵染源，培養(yǎng)侵染的黃萎病菌分生孢子，得到侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液； (2)用侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片； (3)統(tǒng)計(jì)葉片發(fā)病情況，劃分抗性等級。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番前黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于:所述步驟(I)中侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液的方法如下: ①將黃萎病菌分生孢子接種于PDA培養(yǎng)基上，置恒溫光照培養(yǎng)箱中，25°C光照恒溫培養(yǎng)30天； ②將步驟①中成熟的分生孢子取下，在無菌的條件下，置滅菌的研缽中研碎，加入PDA液體培養(yǎng)基； ③將步驟②中PDA液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入45ml離心管中，置離心機(jī)中，再1800轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心5分鐘； ④取步驟③離心管中的PDA液體培養(yǎng)基的上清液，轉(zhuǎn)入滅菌的三角燒瓶中，取少量懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板置400倍顯微鏡計(jì)算黃萎病菌分生孢子濃度，然后將懸浮液調(diào)節(jié)至I X 16個/暈升； ⑤將步驟④中懸浮液置25°c恒溫振蕩搖床中，在200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)12小時(shí)； ⑥將步驟⑤中培養(yǎng)后的懸浮液再2000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘，去上清，用蒸餾水重懸沉淀，將黃萎病菌分生孢子濃度調(diào)節(jié)至I X 16個/毫升，得到侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于:所述步驟①中PDA培養(yǎng)基的配方為:去皮馬鈴薯:200g，蔗糖20g，瓊脂15-20g，蒸餾水1000ml，操作步驟:將去皮馬鈴薯切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘?jiān)?；向?yàn)V液中分別加入瓊脂和蔗糖加熱融化，定容至100ml ;將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C高壓蒸汽滅菌20min ;在無菌條件下，將25ml融化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固，編號待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于:所述步驟②中PDA液體培養(yǎng)基的配方為:去皮馬鈴薯:200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml，操作步驟:將去皮馬鈴薯，切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘?jiān)?；向?yàn)V液中加入葡萄糖，加熱融化，定容至100ml ;將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C高壓蒸汽滅菌20min，待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番前黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于:所述步驟(2)中用侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片的方法如下:選取番茄品種，將番前的離體葉片葉柄插入步驟⑥中侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液中，待黃萎病菌分生孢子懸浮液液吸收完全后，將離體葉片葉柄插入滅菌水中培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱中25°C恒溫培養(yǎng)七天。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的番前黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于:所述步驟(3)中用抗性等級劃分如下: O級:葉片正常，無病癥；I級:葉片稍微有些變軟；II級:發(fā)病部位面積小于整個葉片的1/4或中度萎蔫；III級:發(fā)病部位面積大于1/4小于3/4或出現(xiàn)嚴(yán)重萎蔫；IV級:葉片枯死或發(fā)病部位面積大于3/4。
【文檔編號】C12R1/645GK104480189SQ201410671396
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】丁錦平, 裴冬麗, 李成偉, 洪權(quán)春, 侯穎, 張慶琛, 李瑞麗 申請人:商丘師范學(xué)院