專(zhuān)利名稱(chēng):一種固定化脂肪酶制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶的制備方法。
背景技術(shù):
酶與載體間的共價(jià)結(jié)合是基于化學(xué)反應(yīng),即酶表面(A)的活性氨基酸殘基與載體表面(B)的活性官能團(tuán)之間的反應(yīng)。為了達(dá)到有效的共價(jià)連接,必須預(yù)先活化載體或酶上的有關(guān)官能團(tuán)。一般情況下預(yù)先活化載體上的有關(guān)官能團(tuán),然后與酶發(fā)生共價(jià)結(jié)合。在少數(shù)情況下,如當(dāng)需要控制結(jié)合方式或共價(jià)鍵數(shù)目時(shí),則預(yù)先活化酶分子上的有關(guān)官能團(tuán),然后與載體發(fā)生共價(jià)結(jié)合。酶固定化后,既能保持酶的催化活性又能克服游離酶的一些不足,提高酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性能與反應(yīng)物分開(kāi),有效地控制生產(chǎn)過(guò)程;能與產(chǎn)物分開(kāi),可省去熱處理使酶失活的步驟,簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝,使食品等產(chǎn)品更好地保持營(yíng)養(yǎng)成分;固定化酶可在生產(chǎn)中反復(fù)連續(xù)使用,提高了酶的利用率??墒牵腹潭ɑ瘜?duì)載體材料具有很高的要求,如要有良好的機(jī)械強(qiáng)度,良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,良好的抗微生物特性及酶的結(jié)合能力等。載體材料的價(jià)格還直接影響固定化酶能否真正用到實(shí)際生產(chǎn)中。由于難以找到理想的載體材料,再加上酶在固定化過(guò)程中不可避免地?fù)p失部分活力,甚至當(dāng)固定方法不得當(dāng)時(shí)會(huì)損失絕大部分活力等原因,到目前為止也只有十幾種固定化酶應(yīng)用于生產(chǎn)中。我國(guó)的固定化酶研究工作始于70年代初, 在這一領(lǐng)域的研究具有相當(dāng)高的水平,如β 一硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)是我國(guó)首先使用的一種高效雙官能團(tuán)試劑,但我國(guó)尚未見(jiàn)商品的固定化酶專(zhuān)用載體。因此,近十年來(lái),我國(guó)酶學(xué)專(zhuān)家與國(guó)外專(zhuān)家學(xué)者一樣把酶固定化技術(shù)的研究重點(diǎn)集中于固定化方法和載體材料的開(kāi)發(fā)上,以便找到更簡(jiǎn)便實(shí)用的固定化方法和性能優(yōu)良的載體。葡聚糖也是固定化酶常用的載體材料,近年來(lái),不斷有葡聚糖的改性載體及其固定酶的方法被研究和發(fā)現(xiàn)。纖維素是最豐富的天然有機(jī)物,用不同取代基取代羥基可制得多種改性纖維素, 是固定化酶的良載體。日本用二乙氨乙基(DEAE)纖維素載體吸附固定葡萄糖異構(gòu)酶,用于生產(chǎn)高果糖漿,用二乙氨乙基(DEAE)纖維素引入氨基以提供多價(jià)陽(yáng)離子一弱堿性陰離子交換劑.它是最常見(jiàn)的酶固定化載體之一。DOW公司生產(chǎn)的空心纖維為酶固定化的專(zhuān)用載體, 它是由醋酸纖維素和其它纖維素構(gòu)成的。目前商品化的固定化脂肪酶是諾維信公司(Novozymes)用大孔樹(shù)脂吸附的脂肪酶。由于采用多種改性纖維素、樹(shù)脂作為載體,使固定化酶的成本偏高,而且吸附法存在著酶有效截留率較低、PH及溫度穩(wěn)定性較差、酶易脫落、反應(yīng)擴(kuò)散阻力較大等問(wèn)題。有報(bào)導(dǎo)以纖維素為主要成分的帆布作脂肪酶的固定化載體。相對(duì)于樹(shù)脂而言,纖維素是天然可再生的材料,而且易得、價(jià)廉。纖維素結(jié)構(gòu)中存在著大量的羥基,通過(guò)高碘酸鈉將連接鄰二羥基的碳鍵(C2、C3位鍵)氧化成醛基,繼而與酶蛋白上的胺基進(jìn)行醛胺縮合反應(yīng)形成希夫堿,通過(guò)共價(jià)交聯(lián)得到固定化脂肪酶。當(dāng)以致密的帆布為載體時(shí),醛基與酶的接觸阻礙作用將可能成為影響酶活性的主要因素。一種原因是一部分醛基處于帆布的內(nèi)部,遇水后相鄰的羥基間形成分子內(nèi)氫鍵,阻擋了醛基與酶蛋白的接觸;另一個(gè)原因是致密的纖維充水膨脹后,表面水膜的靜電張力阻擋了酶等大分子的進(jìn)入,影響了傳質(zhì)。且干粉酶中一些不容易去除的吸附性物質(zhì)也粘附于纖維基團(tuán)表面,阻礙了交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是篩選出一種合適、價(jià)廉的固定化載體天然有機(jī)高聚物,它是以天然多年生宿根性草本植物的纖維素特別是天然纖維一苧麻作為載體。本發(fā)明根據(jù)固定化載體特點(diǎn)從上述常用的固定載體中篩選出一種合適、價(jià)廉的固定化載體天然有機(jī)高聚物天然纖維一苧麻。^5) [Boehmeria nivea (Linn.)Gaudich] ^4^Urticaceae, [ ] U 苧麻、白麻、圓麻,是多年生宿根性草本植物,是重要的紡織纖維作物。苧麻纖維成份是纖維素,其單纖維長(zhǎng)、強(qiáng)度最大,單纖維長(zhǎng)度為60-250mm,是麻類(lèi)作物中最長(zhǎng)的。直徑17-64 μ m, 橫斷面呈多角形、橢圓形。采用天然纖維一苧麻為載體材料,利用高碘酸鈉氧化法使苧麻表面纖維相鄰羥基通過(guò)反應(yīng)脫水得到醛基再與酶表面游離氨基酸生成希夫堿,從而達(dá)到固定化酶的目的。本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案如下
一種固定化脂肪酶的制備方法,其特征是以以天然多年生宿根性草本植物特別是天然纖維一苧麻和豬胰脂肪酶為原料,以苧麻為脂肪酶的載體,對(duì)苧麻進(jìn)行活化、豬胰脂肪酶液制備,然后采用共價(jià)交聯(lián)的方法進(jìn)行脂肪酶的固定化; 本發(fā)明以苧麻為載體固定化豬胰脂肪酶的制備方法如下
本發(fā)明選擇天然纖維一苧麻為載體,包括將苧麻的活化、豬胰脂肪酶液制備和交聯(lián)三個(gè)步驟
(1)苧麻的活化剪取若干苧麻,用0. 5—l.Omol/ L KOH煮沸0. 5 — 1. O小時(shí)除去苧麻表面的雜質(zhì),然后用0. 1—0. 6 mol/L濃度的NaI04溶液氧化,5-12小時(shí)后取出用去離子水洗凈,加甘油于苧麻表面靜置30-60 min,以除去未反應(yīng)的NaI04,用去離子水洗凈待用。(2)酶液制備將一定量豬胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸緩沖液(0. 025-0. 500mol/ L,pH 7. 5)中,4°C低溫下攪拌均勻,在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,然后取上清液貯于冰箱內(nèi)備用。(3)交聯(lián)將步驟(1)活化的苧麻置于錐形瓶中與步驟( 得到的酶液在4°C下進(jìn)行交聯(lián),每交聯(lián)30-60分鐘,震蕩10-30分鐘,反應(yīng)2-6個(gè)小時(shí)。交聯(lián)完畢后,用去離子水在室溫下反復(fù)洗滌固定化酶5-10次以上,以確保苧麻表面未交聯(lián)上的游離酶被洗下。為提高醛基的交聯(lián)度,采取重復(fù)步驟C3)的方法進(jìn)行反復(fù)交聯(lián)。每次取出苧麻后,用濾紙吸干苧麻表面水分,再放入酶液中進(jìn)行交聯(lián)。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下 (1)固定化酶的穩(wěn)定性比較
與游離豬胰脂肪酶相比,固定化后的酶對(duì)溫度、PH和離子強(qiáng)度等的穩(wěn)定性都得到了提高。如圖1所示,固定化酶在較高溫度下仍具有較高的催化活性(為初活的70%左右),而游離酶的活性則只有原來(lái)的40%。溫度越高則對(duì)比越明顯。由此說(shuō)明酶固定化后提升了其使用空間。由圖2可以看出,游離酶在強(qiáng)堿條件下,出現(xiàn)了酶蛋白必需基團(tuán)的電離,使酶出現(xiàn)膚鍵水解、脫氨基等現(xiàn)象,導(dǎo)致酶的速速失活。固定化后的豬胰脂肪酶對(duì)PH值的靈敏度降低,提高了運(yùn)用范圍。金屬離子對(duì)酶具有激活作用,但是游離酶對(duì)金屬離子的濃度比較敏感,高濃度的金屬離子濃度反而會(huì)抑制酶的活性。固定化酶在強(qiáng)金屬離子濃度中表現(xiàn)出了較高的穩(wěn)定性。添加有機(jī)溶劑可以促使反應(yīng)體系中油水兩相的互溶,并且可以降低甲醇對(duì)酶的毒性,但是由于有機(jī)溶劑會(huì)改變酶的疏水基團(tuán)微環(huán)境,從而影響酶活。從圖4可以看出,游離豬胰脂肪酶受有機(jī)溶劑添加的影響顯著。與游離酶相比較,固定化后的豬胰脂肪酶幾乎沒(méi)受到影響。這點(diǎn)在生物柴油的制備過(guò)程中尤為重要。實(shí)驗(yàn)表明,以天然纖維一苧麻為載體,利用高碘酸鈉將其氧化成醛殘基。通過(guò)在載體上的醛基與酶分子中的氨基之間形堿而實(shí)現(xiàn)固定化的方法是可行的。通過(guò)氧化劑的濃度和氧化時(shí)間的實(shí)驗(yàn),是載體表面的醛殘基達(dá)到較高的濃度。并比較了游離豬胰脂肪酶與固定化后的豬胰脂肪酶在溫度、PH、金屬離子、有機(jī)溶劑等方面的差異性。實(shí)驗(yàn)證明固定后的豬胰脂肪酶在各方面的特性明顯優(yōu)于游離的豬胰脂肪酶。將固定化脂肪酶在酯化反應(yīng)后回收連續(xù)重復(fù)使用13次,脂肪酶的活性保持率大于80.096,提高了脂肪酶的利用率,降低了因脂肪酶所致的產(chǎn)品成本。而未固定化的脂肪酶則無(wú)法回收重復(fù)使用。本發(fā)明技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果
本發(fā)明采用天然纖維一苧麻為載體材料,利用高碘酸鈉氧化法使苧麻表面纖維相鄰羥基通過(guò)反應(yīng)脫水得到醛基再與酶表面游離氨基酸生成希夫堿,從而達(dá)到固定化酶的目的。固定化酶的穩(wěn)定性是實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)重要的特征參數(shù),因?yàn)檩^好的穩(wěn)定性可以使固定化酶具有較長(zhǎng)的使用壽命,并可以重復(fù)使用。固定化酶的重復(fù)利用使催化劑的成本在最終生產(chǎn)成本中占很低的比列。由于所用苧麻來(lái)源廣泛,價(jià)格低廉。固定化脂肪酶催化制備生物柴油,可以反復(fù)使用,可大大提高固定化脂肪酶的使用穩(wěn)定性和催化效果,降低生產(chǎn)生物柴油的生產(chǎn)成本。
圖1是溫度對(duì)固定化酶及游離酶的影響。圖2是不同pH值對(duì)固定化豬胰脂肪酶及游離豬胰脂肪酶的影響。圖3是不同濃度的Ca2+對(duì)固定化豬胰脂肪酶和游離豬胰脂肪酶的影響。圖4是游離豬胰脂肪酶和固定化豬胰脂肪酶在有機(jī)溶劑中的相對(duì)穩(wěn)定性比較。
具體實(shí)施例實(shí)施例1
本發(fā)明選擇天然纖維一苧麻為載體,將苧麻的活化、豬胰脂肪酶液制備和交聯(lián)三個(gè)步驟
(1)苧麻的活化剪取若干苧麻,用0. 5mol/ L KOH煮沸0.5小時(shí)除去苧麻表面的雜質(zhì),然后用0. 1 mol/L濃度的NaI04溶液氧化,6小時(shí)后取出用去離子水洗凈,加甘油于苧麻表面靜置40 min,以除去未反應(yīng)的NaI04,用去離子水洗凈待用。(2)酶液制備將一定量豬胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸緩沖液(0. 025mol/ L, PH 7.5)中,4°C低溫下攪拌均勻,在lOOOOr/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,然后取上清液貯于冰箱內(nèi)備用。(3)交聯(lián)將步驟(1)活化的苧麻置于錐形瓶中與步驟( 得到的酶液在4°C下進(jìn)行交聯(lián),每交聯(lián)35分鐘,震蕩15分鐘,反應(yīng)3個(gè)小時(shí)。交聯(lián)完畢后,用去離子水在室溫下反復(fù)洗滌固定化酶5次以上,以確保苧麻表面未交聯(lián)上的游離酶被洗下。為提高醛基的交聯(lián)度,采取重復(fù)步驟(3)的方法進(jìn)行反復(fù)交聯(lián)。每次取出苧麻后,用濾紙吸干苧麻表面水分, 再放入酶液中進(jìn)行交聯(lián)。實(shí)施例2
本發(fā)明選擇天然纖維一苧麻為載體,將苧麻的活化、豬胰脂肪酶液制備和交聯(lián)三個(gè)步
驟
(1)苧麻的活化剪取若干苧麻,用0. 8mol/ L KOH煮沸0.6小時(shí)除去苧麻表面的雜質(zhì),然后用0.3 mol/L濃度的NaI04溶液氧化,8小時(shí)后取出用去離子水洗凈,加甘油于苧麻表面靜置50 min,以除去未反應(yīng)的NaI04,用去離子水洗凈待用。(2)酶液制備將一定量豬胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸緩沖液(0. 0. 500mol/ L,pH 7.5)中,4°C低溫下攪拌均勻,在lOOOOr/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,然后取上清液貯于冰箱內(nèi)備用。(3)交聯(lián)將步驟(1)活化的苧麻置于錐形瓶中與步驟( 得到的酶液在4°C下進(jìn)行交聯(lián),每交聯(lián)50分鐘,震蕩30分鐘,反應(yīng)5個(gè)小時(shí)。交聯(lián)完畢后,用去離子水在室溫下反復(fù)洗滌固定化酶8次以上,以確保苧麻表面未交聯(lián)上的游離酶被洗下。為提高醛基的交聯(lián)度,采取重復(fù)步驟(3)的方法進(jìn)行反復(fù)交聯(lián)。每次取出苧麻后,用濾紙吸干苧麻表面水分, 再放入酶液中進(jìn)行交聯(lián)。實(shí)施例3
本發(fā)明選擇天然纖維一苧麻為載體,將苧麻的活化、豬胰脂肪酶液制備和交聯(lián)三個(gè)步驟 (1)苧麻的活化剪取若干苧麻,用1. Omol/ L KOH煮沸1.0小時(shí)除去苧麻表面的雜質(zhì), 然后用0.6 mol/L濃度的NaI04溶液氧化,12小時(shí)后取出用去離子水洗凈,加甘油于苧麻表面靜置60 min,以除去未反應(yīng)的NaI04,用去離子水洗凈待用。(2)酶液制備將一定量豬胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸緩沖液(0. 025-0. 500mol/ L,pH 7. 5)中,4°C低溫下攪拌均勻,在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,然后取上清液貯于冰箱內(nèi)備用。(3)交聯(lián)將步驟(1)活化的苧麻置于錐形瓶中與步驟( 得到的酶液在4°C下進(jìn)行交聯(lián),每交聯(lián)60分鐘,震蕩30分鐘,反應(yīng)6個(gè)小時(shí)。交聯(lián)完畢后,用去離子水在室溫下反復(fù)洗滌固定化酶10次,以確保苧麻表面未交聯(lián)上的游離酶被洗下。為提高醛基的交聯(lián)度, 采取重復(fù)步驟C3)的方法進(jìn)行反復(fù)交聯(lián)。每次取出苧麻后,用濾紙吸干苧麻表面水分,再放入酶液中進(jìn)行交聯(lián)。
權(quán)利要求
1.一種固定化脂肪酶的制備方法,其特征是以以天然多年生宿根性草本植物天然纖維比如苧麻和豬胰脂肪酶為原料,以天然纖維為脂肪酶的載體,對(duì)天然纖維進(jìn)行活化、豬胰脂肪酶液制備,然后采用共價(jià)交聯(lián)的方法進(jìn)行脂肪酶的固定化。
2.如權(quán)利要求1所述固定化脂肪酶的制備方法,其特征是,用苧麻為載體,包括將苧麻的活化、豬胰脂肪酶液制備和交聯(lián)三個(gè)步驟(1)苧麻的活化剪取若干苧麻,用0.5—1. Omol/ L KOH煮沸0. 5—1. 0小時(shí)除去苧麻表面的雜質(zhì),然后用0. 1—0. 6 mol/L濃度的NaI04溶液氧化,5-12小時(shí)后取出用去離子水洗凈,加甘油于苧麻表面靜置30-60 min,以除去未反應(yīng)的NaI04,用去離子水洗凈待用,(2)酶液制備將一定量豬胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸緩沖液(0.025-0. 500mol/ L,pH 7. 5)中,4°C低溫下攪拌均勻,在lOOOOr/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,然后取上清液貯于冰箱內(nèi)備用;(3)交聯(lián)將步驟(1)活化的苧麻置于錐形瓶中與步驟( 得到的酶液在4°C下進(jìn)行交聯(lián),每交聯(lián)30—60分鐘,震蕩10—30分鐘,反應(yīng)2-6個(gè)小時(shí);交聯(lián)完畢后,用去離子水在室溫下反復(fù)洗滌固定化酶5-10次以上,以確保苧麻表面未交聯(lián)上的游離酶被洗下,為提高醛基的交聯(lián)度,采取重復(fù)步驟(3)的方法進(jìn)行反復(fù)交聯(lián);每次取出苧麻后,用濾紙吸干苧麻表面水分,再放入酶液中進(jìn)行交聯(lián)。
全文摘要
一種固定化脂肪酶的制備方法,其特征是以以天然多年生宿根性草本植物特別是天然纖維-苧麻和豬胰脂肪酶為原料,以苧麻為脂肪酶的載體,對(duì)苧麻進(jìn)行活化、豬胰脂肪酶液制備,然后采用共價(jià)交聯(lián)的方法進(jìn)行脂肪酶的固定化。苧麻來(lái)源廣泛,價(jià)格低廉。固定化脂肪酶催化制備生物柴油,可以反復(fù)使用,可大大提高固定化脂肪酶的使用穩(wěn)定性和催化效果,降低生產(chǎn)生物柴油的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N11/02GK102191236SQ201110092848
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者劉光斌, 劉苑秋, 張露, 杜天真, 胡冬南, 邱自兵, 黃忠, 黃長(zhǎng)干 申請(qǐng)人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)