一種從南極假絲酵母發(fā)酵上清液中固定脂肪酶b的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固定南極假絲酵母發(fā)酵上清液中脂肪酶B的工藝方法，屬于酶固定化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B，CALB)來源于南極假絲酵母，是一種優(yōu)良的脂肪酶，它對水溶性、非水溶性物質(zhì)都有很強的催化活性，在有機合成、手性化合物拆分、醫(yī)藥中間體等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0003]固定化脂肪酶與其液體酶制劑和粉末酶制劑相比，具有易于從反應(yīng)體系分離、可裝柱連續(xù)反應(yīng)、穩(wěn)定性高、易于控制等優(yōu)勢，適用范圍十分廣泛。酶的固定化方式分為共價結(jié)合、載體交聯(lián)、吸附與包埋法，其中以吸附法最為簡單實用，目前主流的CALB固定方法主要為吸附法。
[0004]吸附法分為水相吸附、有機相吸附、微水相吸附等，由于CALB的活性區(qū)域為疏水區(qū)域，因此有機相吸附能夠保持活性區(qū)域外露，能夠較好的保持脂肪酶活力，但成本較高，有機溶劑用量大，工藝較為復(fù)雜;水相吸附法工藝簡單，成本較低，但會造成CALB活性中心的金屬離子溶出，或在載體表面形成多層吸附而導(dǎo)致疏水區(qū)域疊加掩蔽，使CALB的酶活回收率降低。
[0005]目前諾維信公司生產(chǎn)的Novozyme435是最為成功的CALB固定化商品酶，由重組米曲霉發(fā)酵獲得的CALB固定于大孔丙烯酸樹脂制備，催化效果優(yōu)秀但價格昂貴，限制了其在酶催化工業(yè)中的應(yīng)用。國內(nèi)固定化脂肪酶價格較為低廉，但普遍具有催化活性較低、穩(wěn)定性較差或難以規(guī)?；a(chǎn)的缺點，難以占據(jù)市場優(yōu)勢。中國專利申請?zhí)?01510199817.0公布了一種固定化堿性脂肪酶的制作方法。該方法利用甘氨酸作為助劑，使用吸附法進(jìn)行固定化酶的制備。
[0006]本發(fā)明使用較為廉價的載體，采用水相固定化方式，配合后處理工藝制備固定化南極假絲酵母脂肪酶B，提高了在水相吸附下的酶活回收率，在成本和使用效果方面進(jìn)行平衡，對CALB的工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)通常用為微水相固定化，本發(fā)明為水相直接固定，原理不同，收益在于有機溶劑用量小，使用發(fā)酵液上清，酶僅需初步純化;本發(fā)明固定化載體與現(xiàn)有技術(shù)不屬于同一系列，收益在于固定化效率更高，降低綜合成本;現(xiàn)有技術(shù)后處理不包含本發(fā)明的鋅離子處理內(nèi)容，且步驟、原理均不相同，本發(fā)明收益在于能夠提供酶活性中心，解除酶的相互遮蔽作用，提高酶活收率;現(xiàn)有技術(shù)使用冷凍干燥進(jìn)行處理，本發(fā)明使用沸騰干燥及真空干燥，收益在于設(shè)備要求低，能耗低；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明已進(jìn)行中試、生產(chǎn)級別放大，且容易工業(yè)化操作，收益在于與生產(chǎn)關(guān)聯(lián)程度較高，易于放大規(guī)模。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的問題是:提供工藝流程簡單，生產(chǎn)成本較低，易于工業(yè)化生產(chǎn)的一種固定南極假絲酵母發(fā)酵上清液中脂肪酶B的工藝方法，并通過適當(dāng)?shù)暮筇幚矸椒ㄌ岣吖潭ɑ傅幕盍陀袡C相中使用的穩(wěn)定性。
[0009]本發(fā)明提供一種從南極假絲酵母發(fā)酵上清液中固定脂肪酶B的方法，，具體步驟如下:
[0010]1)發(fā)酵液預(yù)處理
[0011]所述方法中，南極假絲酵母發(fā)酵上清液中脂肪酶B的活力范圍為2000?2400U/mL，降溫預(yù)冷至15?20°C。
[0012]2)樹脂的預(yù)處理
[0013]使用NKA-1I大孔樹脂作為預(yù)柱填料，按照樹脂與發(fā)酵上清液體積比1:5?8，使用甲醇進(jìn)行濕法裝柱，裝柱量0.7?0.8BV，預(yù)柱徑高比1:5?10，使用2倍樹脂體積甲醇作為流動相進(jìn)行清洗，流速1?1.5BV/h，甲醇清洗后使用3倍柱體積的蒸餾水將甲醇洗出，流速1?1.5BV/ho
[0014]使用HPD600大孔樹脂作為吸附柱填料，按照樹脂與發(fā)酵上清液體積比1:8?15，使用甲醇進(jìn)行濕法裝柱，裝柱量0.7?0.8BV，吸附柱徑高比1:5?15，使用2倍樹脂體積甲醇作為流動相進(jìn)行清洗，流速1?1.5BV/h，甲醇清洗后使用3倍柱體積的蒸餾水將甲醇洗出，流速1?1.5BV/h。
[0015]3)吸附操作
[0016]吸附條件:使用預(yù)冷的發(fā)酵上清液，上樣流速以吸附柱計為0.2?0.4BV/h，先后通過預(yù)柱和吸附柱。
[0017]終點判斷:預(yù)柱出口處取樣檢測過柱液的總蛋白濃度，觀察樹脂顏色，蛋白濃度發(fā)生階躍，樹脂完全變色時預(yù)柱飽和，應(yīng)切換至未使用的預(yù)柱，并對使用后的預(yù)柱進(jìn)行再生。吸附柱出口處取樣檢測過柱液的脂肪酶B活力，當(dāng)酶活力發(fā)生階躍，樹脂完全變色時判斷為終點，切換至未使用的吸附柱，并對當(dāng)前吸附柱進(jìn)行后處理。
[0018]4)吸附柱的后處理
[0019]堿洗:使用蒸餾水配制NaOH稀溶液，使NaOH稀溶液的pH = 8.0?8.5，使用0.8?1.0BV的NaOH稀溶液，以1.0?1.5BV/h的流速沖洗已經(jīng)至吸附終點的吸附柱。
[0020]鋅離子緩沖液浸洗:使用pH=6.0?6.5，濃度為0.lmol/L的磷酸緩沖系，配制鋅離子濃度為0.0lmol/L的氯化鋅溶液，使用1.0?1.2BV的上述含鋅離子緩沖液將樹脂從吸附柱中洗出，浸洗10?15min，過濾并收集樹脂。
[0021 ]水洗:收集的樹脂置于抽濾器中，用0.2?0.5倍樹脂體積的蒸餾水進(jìn)行漂洗，抽濾，收集樹脂。
[0022]干燥:濕樹脂在45°C下進(jìn)行沸騰干燥，干燥時間30?75min，收集干燥樹脂。
[0023]5)干燥樹脂的有機相處理
[0024]配制十八烷與石油醚比例為1:100(v: V)的石油醚體系，使用1.0?1.5倍干燥樹脂體積的上述石油醚與干燥樹脂混合，攪拌30?45min，過濾收集樹脂，30°C下進(jìn)行真空干燥，干燥時間30?75min，收集干燥樹脂，即得固定化南極假絲酵母脂肪酶B。
[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026]1、本發(fā)明利用NKA-1I大孔樹脂對蛋白質(zhì)的吸附性以及其對脂肪酶B吸附能力極弱的特性對南極假絲酵母發(fā)酵上清液進(jìn)行初步純化，利用HPD600大孔樹脂對雜蛋白吸附能力低但對脂肪酶B吸附能力高的特性進(jìn)行脂肪酶B的固定，簡化了酶的純化步驟，降低處理成本。
[0027]2、本發(fā)明中制備固定化酶的方法，采用固定床的方式對酶進(jìn)行吸附，易于判斷終點，并可以通過色譜柱之間的切換進(jìn)行連續(xù)操作，同時解決了水相固定條件下酶活收率低，母液中游離酶利用率低的問題。
[0028]3、本發(fā)明利用鋅離子為脂肪酶B提供活性中心，利用含十八烷石油醚的疏水作用減弱了酶活性中心的排阻作用，提高了固定化酶的活力，增強了其在有機介質(zhì)中的催化能力。
[0029]4、本發(fā)明中所制備的固定化脂肪酶粒徑分布為0.3?1.25mm，便于從反應(yīng)體系中分咼。
[0030]5、本發(fā)明中所制備固定化脂肪酶穩(wěn)定性良好，適合循環(huán)使用。
[0031]6、本發(fā)明中制備固定化酶的工藝流程簡單，使用材料價格低廉，成本較低。
【附圖說明】
[0032]圖1:本發(fā)明的反應(yīng)流程圖
【具體實施方式】
[0033]以下實施例將對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0034]實施例1
[0035]南極假絲酵母發(fā)酵上清液中脂肪酶B的活力為2256U/mL，體積500L，使用帶夾套攪拌罐降溫預(yù)冷至20°C。
[0036]預(yù)柱直徑30cm，高200cm(徑高比1:6.67)，取爾4-11大孔樹脂1001^乍為預(yù)柱填料(樹脂與發(fā)酵上清液體積比為1:5)，加入50L甲醇浸泡，使用50L甲醇進(jìn)行濕法裝柱(裝柱量0.71BV)，使用200L甲醇作為流動相進(jìn)行清洗，流速150L/h(流速1.06BV/h)，甲醇清洗后使用300L蒸餾水將甲醇洗出，流速150L/h(流速1.06BV/h)。
[0037]吸附柱直徑20cm，高200cm(徑高比1:10)取HPD600大孔樹脂50L作為吸附柱填料(樹脂與發(fā)酵上清液體積比為1:10)，加入30L甲醇浸泡，使用20L甲醇進(jìn)行濕法裝柱(裝柱量0.80BV)，使用100L甲醇作為流動相進(jìn)行清洗，流速75L/h(流速1.19BV/h)，甲醇清洗后使用150L蒸餾水將甲醇洗出，流速75L/h(流速1.19BV/h)。
[0038]使用預(yù)冷的發(fā)酵上清液上樣，上樣流速20L/h(以吸附柱計為0.32BV/h)，先后通過預(yù)柱和吸附柱。
[0039]吸附開始每隔lh測定預(yù)柱出口處收集液的總蛋白含量。
[0040]吸附開始每隔2h測定吸附柱出口處液體的脂肪酶B活力，吸附時間超過12h時每15min對上述參數(shù)進(jìn)行測定。
[0041 ] 吸附前14h吸附柱出口處液體的脂肪酶B活力為5?15U/mL，吸附至14.5h時酶活力階躍至1951U/mL，樹脂已由白色變?yōu)闇\黃綠色，此時已處理295L發(fā)酵上清液，判斷為終點，停止上樣。
[0042]預(yù)柱出口處的蛋白含量未發(fā)生階躍，樹脂未完全變色，可繼續(xù)使用。
[0043]配制pH = 8.0的NaOH稀溶液60L(0.96BV)，以流速75L/h(流速1.19BV/h)沖洗吸附柱。
[0044]配制氯化鋅濃度為0.01mol/L，pH=6.5的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液65L(1.05BV)，使用40L此溶液以流速75L/h(流速1.19BV/h)沖洗吸附柱，之后用剩余25L溶液將柱內(nèi)樹脂洗出至濾筒，浸洗攪拌I Omin，抽去液體。
[00