專利名稱：一種高密度培養(yǎng)副豬嗜血桿菌用于疫苗制備的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種高密度培養(yǎng)副豬嗜血桿菌用于疫苗制備的方法。
背景技術(shù)：
目前，在規(guī)?；B(yǎng)豬場中，細(xì)菌感染十分普遍，尤其是在免疫抑制疾病發(fā)生的地區(qū)較為常見。當(dāng)前，副豬嗜血桿菌是三大最主要的細(xì)菌病之一，具有多血清型，加上耐藥性產(chǎn)生頻繁，給臨床免疫防治帶來了困難。該菌在特定條件下可以侵入機(jī)體并引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征。至今從北京、黑龍江、遼寧、河南、湖南、寧夏、湖北、陜西等省分離出了副豬嗜血桿菌，以血清4型和5型最為流行，其次為 13型、14型和12型，局部地區(qū)的流行呈較高發(fā)病率和死亡率，而且在生產(chǎn)中副豬嗜血桿菌致病的情況比鏈球菌還要嚴(yán)重，也更難控制。過去很長一段時間我國豬場對副豬嗜血桿菌的防治，都依賴于國外進(jìn)口疫苗(西班牙海博萊等)，而Hiprasuis又沒有說明它的疫苗是主要是針對哪幾種血清型，所以，對我國當(dāng)前流行的血清型，效果仍不是很清楚。直到2007年，武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司開發(fā)出國內(nèi)第一個獲得批準(zhǔn)文號的針對我國流行血清型的4型和5型二價滅活疫苗，由于其免疫保護(hù)力高，持續(xù)時間長，逐步占領(lǐng)了國內(nèi)副豬嗜血桿菌疫苗市場。但由于我國細(xì)菌性疫苗的關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)中，菌體高密度培養(yǎng)技術(shù)的滯后，尤其對副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)沒有固定的培養(yǎng)基和針對其生長特性的培養(yǎng)條件控制手段，目前國內(nèi)外較多應(yīng)用一種商業(yè)培養(yǎng)基為TSB來培養(yǎng)副豬嗜血桿菌，培養(yǎng)控制方式也簡單化，這種培養(yǎng)基雖然使用方便， 但在培養(yǎng)過程中，具有菌體生長緩慢，對不同血清型的菌株培養(yǎng)差異大，成本高等缺點，其發(fā)酵終點的活菌數(shù)為10 20億，不適合大規(guī)模增菌使用。在本申請?zhí)岢鲆郧?，武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2010 年12月15日已申報了一種副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及應(yīng)用專利(專利申請?zhí)?201010596059.幻，該專利提供了一種針對副豬嗜血桿菌5型高性能的發(fā)酵培養(yǎng)基，保護(hù)內(nèi)容為培養(yǎng)基的組分及配比。本發(fā)明進(jìn)一步嘗試在發(fā)酵罐中試放大中改進(jìn)副豬嗜血桿菌常規(guī)培養(yǎng)的培養(yǎng)方法， 通過在培養(yǎng)基、最適溫度、PH值、溶氧濃度(DO)、代謝產(chǎn)物的調(diào)控等方面進(jìn)行探索，優(yōu)化高密度培養(yǎng)的各種條件，進(jìn)行工業(yè)放大研究，提高培養(yǎng)密度和目的產(chǎn)物含量，最終完成高密度培養(yǎng)的工藝控制參數(shù)的成套技術(shù)定型和規(guī)?；痉渡a(chǎn)線。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在于提供一種高密度培養(yǎng)副豬嗜血桿菌用于疫苗制備的方法，本方法原料來源廣泛、成本低廉，并較常規(guī)的發(fā)酵方法生長快、菌體密度高，易于實現(xiàn)副豬嗜血桿菌抗原的大規(guī)模高密度培養(yǎng)。通過本發(fā)明方法的實施可以解決我國副豬嗜血桿菌全菌體疫苗的關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)中，菌體高密度培養(yǎng)技術(shù)滯后的問題。
為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施所說的高密度培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的方法如下將凍干保存的副豬嗜血桿菌野生種和(或)突變種在TSA平皿上活化后，用TSB搖瓶種子培養(yǎng)基進(jìn)行一次擴(kuò)增，再用自配優(yōu)化搖瓶種子培養(yǎng)基進(jìn)行二次擴(kuò)增，然后接種到3L至100L發(fā)酵罐自配優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，通過PH控制、溶氧控制等手段維持菌體的對數(shù)生長，當(dāng)pH值穩(wěn)定及溶氧回升時，放罐收菌。上述至病豬分離的各種血清型副豬嗜血桿菌野生種和(或)經(jīng)過減毒改造的突變種，具體涉及副豬嗜血桿菌4型、5型、13型等，上述菌種由由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)(蔡旭旺，劉正飛，陳煥春等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，M(I) 55 58.)提供。一種高密度培養(yǎng)副豬嗜血桿菌用于疫苗制備的方法，其步驟是A、將凍干種子菌4型、5型和(或)13型用TSA平板活化10 16h，至明顯單菌落長出。所述的種子菌為4型、5型或13型中的一種或1-3種的任意組合。B、挑取3 6個單菌落至TSB搖瓶一級種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 14h至0D_值達(dá)到0. 4 0. 6C、以 5% (V/V)接種量將一級種子液轉(zhuǎn)接自配二級搖瓶種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 8 Ia1至對數(shù)生長期。D、以 3% (V/V)接種量將二級種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，通過pH控制 (pH*6.8 7. 2)、OD控制(0D為40% 60% )維持菌體對數(shù)生長，至pH值穩(wěn)定及溶氧回升時，放罐收菌，得到高密度的副豬嗜血桿菌菌體抗原。所述的二級種子培養(yǎng)基成分為酵母粉(10 30g/L)、谷氨酸鈉(3 6g/L)、氯化鈉(2 5g/L)、硫酸鎂(0. 1 0. 3g/L)、pH為7. 2的IM磷酸緩沖液3% V/V)及添加一定量的牛血清(5% 10% V/V)和少量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(0. 001% 0. 01% m/ V)。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉OO 40g/L)、谷氨酸鈉(3 6g/L)、氯化鈉O 5g/L)、磷酸氫二鉀(1 4g/L)、硫酸鎂(0. 1 0. 3g/L)及添加一定量的牛血清 (2% 7% V/V)和少量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(0. 001% 0. 01%m/V)。上述在培養(yǎng)過程中控制pH下降，其pH控制手段為在培養(yǎng)過程中在線流加氨水溶液控PH值在6. 8 7. 2上述在對數(shù)生長期控制一定的氧濃度，其特征在于通過加速攪拌和提高通氣量維持DO值在40% 60%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果菌體生長快、菌體密度高，易于規(guī)模化放大生產(chǎn)，且原料簡單，成本低廉，適用于多種血清型菌株的培養(yǎng)。本發(fā)明通過對副豬嗜血桿菌的高密度培養(yǎng)，可以較商業(yè)化TSB培養(yǎng)基常規(guī)發(fā)酵，在降低成本的同時，大大提高發(fā)酵終點的活菌密度。


圖1為一種在常規(guī)TSB培養(yǎng)條件下和本發(fā)明優(yōu)化培養(yǎng)條件下，副豬嗜血桿菌5型菌體生長曲線的比較。
圖2為一種在常規(guī)TSB培養(yǎng)條件下和本發(fā)明優(yōu)化培養(yǎng)條件下，副豬嗜血桿菌4型菌體生長曲線的比較。
具體實施例方式實施例1 :3L 二級發(fā)酵罐發(fā)酵菌株豬嗜血桿菌5型SH0165株，于2001年4月從河北省石家莊市的發(fā)病豬場分離(請見蔡旭旺，劉正飛，陳煥春等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，M(I) 55 58.)種子培養(yǎng)TSB培養(yǎng)基(美國BD公司，按3%濃度配制)，加7% (V/V)牛血清和 10 μ g/L的NAD，從平皿上調(diào)取3 5個單菌落接種后，放入搖床發(fā)酵1 后，測OD值約為 0. 461.發(fā)酵培養(yǎng)酵母粉(30g/L)、谷氨酸鈉(3g/L)、氯化鈉(2. 5g/L)、硫酸鎂(0. 15g/ L)，用NaOH調(diào)pH至7. 2左右，121滅菌20min,再加pH為7. 2的IM磷酸緩沖液(3% V/V)、 牛血清(7% V/V)、NADdOy g/L)，以2% V/V接種量接入種子培養(yǎng)基后，在160r/min的攪拌及0. 7VVM的通氣條件下發(fā)酵。發(fā)酵6小時后每隔1小時取樣測活菌數(shù)，結(jié)果顯示，發(fā)酵 14小時活菌數(shù)達(dá)到最大值41. 5億。實施例2 :3L 二級發(fā)酵罐發(fā)酵菌株豬嗜血桿菌5型，來源同實施例1種子培養(yǎng)TSB培養(yǎng)基(美國BD公司，按3%濃度配制)，加7% (V/V)牛血清和 10 μ g/L的NAD，從平皿上調(diào)取3 5個單菌落接種后，放入搖床發(fā)酵1 后，測OD值約為 0. 454。發(fā)酵培養(yǎng)酵母粉(30g/L)、谷氨酸鈉(3g/L)、氯化鈉(2. 5g/L)、硫酸鎂(0. 15g/ L)，用NaOH調(diào)pH至7. 2左右，121滅菌20min,再加pH為7. 2的IM磷酸緩沖液(3% V/V)、 牛血清(5% V/V)、NAD (20 μ g/L)，以4% V/V接種量接入種子培養(yǎng)基后，在160r/min的攪拌及0. 7VVM的通氣條件下發(fā)酵。發(fā)酵6小時后每隔1小時取樣測活菌數(shù)，結(jié)果顯示，發(fā)酵 12小時活菌數(shù)達(dá)到最大值49. 5億。實施例3 :3L 二級發(fā)酵罐發(fā)酵菌株豬嗜血桿菌5型，來源同實施例1種子培養(yǎng)TSB培養(yǎng)基(美國BD公司，按3%濃度配制)，加7% (V/V)牛血清和 10 μ g/L的NAD，從平皿上調(diào)取3 5個單菌落接種后，放入搖床發(fā)酵1 后，測OD值約為 0. 410.發(fā)酵培養(yǎng)酵母粉(30g/L)、谷氨酸鈉(3g/L)、氯化鈉(2. 5g/L)、硫酸鎂(0. 15g/ L)，磷酸氫二鉀(2g/L)，用NaOH調(diào)pH至7. 2左右，121滅菌20min，再加入牛血清(5% V/ V)、NAD (20 μ g/L)，以4% V/V接種量接入種子培養(yǎng)基，在180r/min的攪拌及0. 8VVM的通氣條件下發(fā)酵，流加1 4稀釋的濃氨水控制pH值在7. 2士0.1，發(fā)酵6小時后每隔1小時取樣測活菌數(shù)，結(jié)果顯示，發(fā)酵13小時活菌數(shù)達(dá)到最大值58. 3億。實施例4 3L 二級發(fā)酵罐發(fā)酵菌株豬嗜血桿菌5型，來源同實施例1種子培養(yǎng)TSB培養(yǎng)基(美國BD公司，按3%濃度配制)，加7% (V/V)牛血清和10 μ g/L的NAD，從平皿上調(diào)取3 5個單菌落接種后，放入搖床發(fā)酵1 后，測OD值約為 0. 470.發(fā)酵培養(yǎng)酵母粉(30g/L)、谷氨酸鈉(3g/L)、氯化鈉(2. 5g/L)、硫酸鎂(0. 15g/ L)，磷酸氫二鉀(2g/L)，用NaOH調(diào)pH至7. 2左右，121滅菌20min，再加入牛血清(5%V/V), NAD (20 μ g/L)，以4% V/V接種量接入種子培養(yǎng)基，在120 200 (r/min)的攪拌及0. 5 I(VVM)的通氣條件下控制DO值為50% 60%，流加1 4稀釋的濃氨水控制pH值在 7.2士0. 1，發(fā)酵6小時后每隔1小時取樣測活菌數(shù)，結(jié)果顯示，發(fā)酵15小時活菌數(shù)達(dá)到最大值62. 3億。實施例5 :50L三級發(fā)酵罐發(fā)酵菌株豬嗜血桿菌5型，來源同實施例1一級種子培養(yǎng)一級種子液為TSB培養(yǎng)基(美國BD公司，按3%濃度配制)，加7% (V/V)牛血清和10 μ g/L的NAD，從平皿上調(diào)取3 5個單菌落接種后，放入搖床發(fā)酵1 后，測OD值約為0. 427二級種子培養(yǎng)以4% V/V的接種量轉(zhuǎn)接二級種子培養(yǎng)基，其組分為酵母粉 (30g/L)、谷氨酸鈉(3g/L)、氯化鈉(2. 5g/L)、硫酸鎂(0. 15g/L)，pH為7. 2的IM磷酸緩沖液(2% V/V)、牛血清(7% V/V)、NAD (10 μ g/L)，發(fā)酵 10h，測 OD 值約為 1. 11。發(fā)酵培養(yǎng)酵母粉(40g/L)、谷氨酸鈉(3g/L)硫酸鎂(0. 15g/L)，磷酸氫二鉀Qg/ L)，氯化鈉(2. 5g/L)，用NaOH調(diào)pH至7. 2左右，121滅菌20min,再加牛血清(5 % V/V)、 NAD (20 μ g/L)，以2 % V/V接種量接入二級種子培養(yǎng)基，通過攪拌控制轉(zhuǎn)速(150 170r/ min)及通氣量(0. 5 1VVM)維持溶解氧OD值為40% 60%，在線流加濃氨水控制pH值在7. 2士0. 1，發(fā)酵4小時后每隔1小時取樣測活菌數(shù)，結(jié)果顯示，發(fā)酵12小時活菌數(shù)達(dá)到最大值70億。實施例6 100L三級發(fā)酵罐發(fā)酵菌株豬嗜血桿菌5型，來源同實施例1一級種子培養(yǎng)一級種子液為TSB培養(yǎng)基(美國BD公司，按3%濃度配制)，加7% (V/V)牛血清和10 μ g/L的NAD，從平皿上調(diào)取3 5個單菌落接種后，放入搖床發(fā)酵1 后，測OD值約為0.418二級種子培養(yǎng)以4% V/V的接種量轉(zhuǎn)接二級種子培養(yǎng)基，其組分為酵母粉 (30g/L)、谷氨酸鈉(3g/L)、氯化鈉(2. 5g/L)、硫酸鎂(0. 15g/L)，pH為7. 2的IM磷酸緩沖液(2%V/V)、牛血清(7% V/V)、NAD (10 μ g/L)，發(fā)酵 10h，測 OD 值約為 0.978。發(fā)酵培養(yǎng)酵母粉(40g/L)、硫酸鎂(0. 15g/L)，磷酸氫二鉀Og/L)，氯化鈉(2. 5g/ L)，用 NaOHi周 pH 至 7. 2 左右，121 滅菌 20min,再加牛血清(5% V/V)、NAD (20 μ g/L)，以 3% V/V接種量接入二級種子培養(yǎng)基，通過攪拌控制轉(zhuǎn)速(180 220r/min)及通氣量(0. 5 1VVM)維持溶解氧OD值為40% 50%，在線流加濃氨水控制pH值在7. 2 士 0. 1，發(fā)酵6小時后每隔1小時取樣測活菌數(shù)，結(jié)果顯示，發(fā)酵12小時活菌數(shù)達(dá)到最大值56億。實施例7 100L三級發(fā)酵罐發(fā)酵菌株豬嗜血桿菌4型MD0322株，于2001年8月分離自湖北枝江市某發(fā)病豬場 (請見蔡旭旺，劉正飛，陳煥春等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，24(1) 55 58.)
一級種子培養(yǎng)一級種子液為TSB培養(yǎng)基(美國BD公司，按3%濃度配制)，加7% (V/V)牛血清和10 μ g/L的NAD，從平皿上調(diào)取3 5個單菌落接種后，放入搖床發(fā)酵IOh 后，測OD值約為0. 574，二級種子培養(yǎng)以4% V/V的接種量轉(zhuǎn)接二級種子培養(yǎng)基，其組分為酵母粉 (30g/L)、谷氨酸鈉(3g/L)、氯化鈉(2. 5g/L)、硫酸鎂(0. 15g/L)，pH為7. 2的IM磷酸緩沖液(2%V/V)、牛血清(7% V/V)、NAD (10 μ g/L)，發(fā)酵 10h，測 OD 值約為 1.556。發(fā)酵培養(yǎng)酵母粉(40g/L)、硫酸鎂(0. 15g/L)，磷酸氫二鉀Og/L)，氯化鈉(1. 5g/ L)，用 NaOHi周 pH 至 7. 2 左右，121 滅菌 20min,再加牛血清(5% V/V)、NAD (20 μ g/L)，以 2% V/V接種量接入二級種子培養(yǎng)基，通過攪拌控制轉(zhuǎn)速(160 200r/min)及通氣量(0. 5 1VVM)維持溶解氧OD值為40% 50%，在線流加濃氨水控制pH值在7. 2 士 0. 1，發(fā)酵4小時后每隔1小時取樣測活菌數(shù)，結(jié)果顯示，發(fā)酵10小時活菌數(shù)達(dá)到最大值41億。
權(quán)利要求
1. 一種高密度培養(yǎng)副豬嗜血桿菌用于疫苗制備的方法，其步驟是 A、將凍干種子菌4型、5型和或13型用TSA平板活化l(Tl6h，至單菌落長出； 挑取3飛個單菌落至TSB搖瓶一級種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)纊14h至0D_值達(dá)到0. 4^0. 6 ； 以19T5%V/V接種量將一級種子液轉(zhuǎn)接自配二級搖瓶種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)81 至對數(shù)生長期；以19T3%V/V接種量將二級種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，通過ρΗ控制，ρΗ為 6. 8^7. 2、0D控制，OD為40%飛0%，維持菌體對數(shù)生長，至ρΗ值穩(wěn)定及溶氧回升時，放罐收菌， 得到高密度的副豬嗜血桿菌菌體抗原；所述的二級種子培養(yǎng)基成分為酵母粉1(T30 g/L、谷氨酸鈉；Γ6 g/L、氯化鈉2、g/ L、硫酸鎂0. Γ0. 3 g/L、pH為7. 2的IM磷酸緩沖液1% 3 % V/V及添加牛血清5% 10% V/V 和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0. 0001% m/V ；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉2(T40g/L、谷氨酸鈉;Γ6 g/L、氯化鈉2、g/L、磷酸氫二鉀廣4 g/L、硫酸鎂0. Γ0. 3 g/L及添加牛血清29T7%V/V和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0. 001% 0· 01% m/V ；所述的種子菌為4型、5型或13型中的一種或1-3種的任意組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高密度培養(yǎng)副豬嗜血桿菌用于疫苗制備的方法，其步驟是A、將凍干種子菌4型、5型和(或)13型用TSA平板活化10~16h，至單菌落長出；B、挑取3~6個單菌落至TSB搖瓶一級種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8~14h至OD600值達(dá)到0.4~0.6；C、以1%~5%V/V接種量將一級種子液轉(zhuǎn)接自配二級搖瓶種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)8~12h至對數(shù)生長期；D、以1%~3%V/V接種量將二級種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，通過pH控制，pH為6.8~7.2、OD控制，OD為40%~60%，維持菌體對數(shù)生長，至pH值穩(wěn)定及溶氧回升時，放罐收菌，得到高密度的副豬嗜血桿菌菌體抗原。本發(fā)酵方法原料來源廣泛、成本低廉，菌體生長快、密度高，易于實現(xiàn)副豬嗜血桿菌抗原的大規(guī)模高密度培養(yǎng)。
文檔編號C12R1/21GK102220272SQ201110145940
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者尹爭艷, 徐高原, 方玉林, 曹毅, 王楊波, 金梅林, 陳關(guān)平, 陳煥春, 韓進(jìn) 申請人:武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司