專利名稱：一種用于煙絲處理的短小芽孢桿菌制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于煙用添加劑的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種微生物制劑。同時還涉及所述微生物制劑的制備方法及其在煙草工業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
煙草是我國財政的重要支柱之一。國家煙草專賣局在“十一五”中國卷煙科技發(fā)展綱要第7條明確指出，要“攻克影響煙葉香氣質(zhì)、香氣量的關(guān)鍵技術(shù)”，縮小與國外煙葉質(zhì)量差距，以提高國內(nèi)外市場競爭力。煙草中的主要成分為碳水化合物和含氮化合物。前者主要包括糖類、淀粉和纖維素、木質(zhì)素、半纖維素、果膠等細(xì)胞壁成分，后者主要包括煙堿、蛋白質(zhì)等，這類大分子物質(zhì)對煙草內(nèi)在品質(zhì)及風(fēng)味均有不利影響。微生物通過生長繁殖，可以產(chǎn)生許多具有生物活性的酶類，加速大分子底物的降解和某些有害物質(zhì)的分解，并通過特定微生物的吸收、利用、 轉(zhuǎn)化形成一系列有益小分子化合物，使煙草成分發(fā)生改變，最終導(dǎo)致煙草品質(zhì)的改變。目前在國內(nèi)外已有較多將生物技術(shù)應(yīng)用于卷煙工業(yè)的研究報道。RayF. Dawson的研究表明，嗜熱性放線菌屬可使陳化煙葉產(chǎn)生一種令人感興趣的香氣，尤其是水果香氣和釀香等。Reid等研究表明，煙葉中的芽孢桿菌、嗜熱細(xì)菌和小球菌對煙葉的香氣和品質(zhì)是有益和必要的。Koller最早進(jìn)行了將微生物接種煙葉以增加煙葉香氣、改善煙葉吸味品質(zhì)的嘗試，之后科研工作者開始了微生物接種煙葉的研究并取得了大量成果。Izquierdo Tamayoa等人研究發(fā)現(xiàn)，用微生物接種的煙葉，香氣和性狀均得到改善，尤其是當(dāng)采用微球菌屬或桿菌屬或兩者的混合物接種煙葉時，效果更為顯著。我國直到20世紀(jì)90年代才開展煙葉香氣物質(zhì)化學(xué)成分分析的研究，關(guān)于煙葉誘香微生物研究還處于探索階段。謝和等研究表明，將煙葉表面的芽孢桿菌接種到烤煙煙葉上，可明顯提高煙葉香氣，改善煙葉品質(zhì)。 陳福星等研究鑒定了烤煙葉面的優(yōu)勢菌種，并表明用優(yōu)勢菌種處理煙葉可縮短發(fā)酵時間并改善煙葉質(zhì)量。迄今為止，關(guān)于微生物在卷煙工業(yè)中應(yīng)用的研究多集中于利用煙葉自身或某些環(huán)境微生物的特定作用來減少煙葉刺激、降低煙堿含量或改善理化品質(zhì)，試圖達(dá)到加速煙草陳化的目的，而應(yīng)用微生物制劑直接處理煙絲以提高卷煙抽吸品質(zhì)的報道卻很少。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有煙絲處理技術(shù)的不足，提供一種新的微生物制劑。本發(fā)明的另一目的是提供所述微生物制劑的制備方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供所述微生物制劑在煙絲處理中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。*除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。A.本發(fā)明提供了一種新的微生物制劑，該微生物制劑是采用下述方法制備獲得取從烤煙葉面上分離得到細(xì)菌Van35的液體菌種，按照0. 1 %的接種量接種于200ml的LB 液體培養(yǎng)基中，在37 °C搖床，轉(zhuǎn)速180r/min振蕩培養(yǎng)至OD值=2. 0 ;3500rpm/min離心 lOmin，用無菌水洗滌沉淀，離心，最后用20mL無菌水振蕩均勻，使用時稀釋10倍即為所需的微生物制劑；其中，所述的細(xì)菌Van35的液體菌種，經(jīng)鑒定屬于短小芽孢桿菌，該菌株命名為 Bacillus pumilus。B.本發(fā)明提供了一種所述微生物制劑的制備方法，該方法采用下述步驟(1)烤煙葉面上分離得到細(xì)菌Van35的液體菌種；(2)取液體菌種，按照0. 1 %的接種量接種于200ml的LB液體培養(yǎng)基中；(3)在 37 "C 搖床，轉(zhuǎn)速 180r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD 值=2. O ； 3500rpm/min 離心 IOmin ；(4)用無菌水洗滌沉淀，離心，最后用20mL無菌水振蕩均勻，使用時稀釋10倍即為所需菌劑。C.本發(fā)明提供了所述微生物制劑在煙絲處理中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(1)本發(fā)明提供的微生物制劑能明顯提高煙絲的香氣量、愉悅性等品質(zhì)，雜氣、刺激性等下降，煙氣濃度和勁頭減少，余味變得舒適。(2)本發(fā)明成本低、可控性強、操作簡單，便于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。保藏生物材料的說明本發(fā)明涉及的短小芽孢桿菌Van35的菌株已經(jīng)保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期2009 年11月5日；保藏號為CGMCC No. 3411。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下通過實施例及試驗數(shù)據(jù)，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍。實施例1——試管斜面培養(yǎng)采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母提取物 5g，瓊脂20g，蒸餾水定容到1000ml。121°C滅菌25分鐘，擺成斜面。接種Van35，28°C培養(yǎng) Mh，獲得試管種。實施例2——種子培養(yǎng)采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母提取物 5g，蒸餾水定容到1000ml。121°C滅菌25分鐘。接種Van35試管種，培養(yǎng)12h，獲得液體菌種。實施例3——制備微生物制劑
取液體菌種，按照0. 1 %的接種量接種于200ml的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床， 轉(zhuǎn)速180r/min振蕩培養(yǎng)至OD值=2. 0。3500rpm/min離心lOmin，用無菌水洗滌沉淀，離心，然后用20mL無菌水振蕩均勻，使用時稀釋10倍即為菌劑。應(yīng)用實施例——微生物制劑對煙絲的作用用制備好的微生物制劑對煙絲進(jìn)行處理，具體實驗步驟如下1)稱取含水率在11% -13%的煙絲100g。2)取菌劑20ml，用小型噴霧器將其均勻地噴灑到IOOg煙絲上，密封，以防止水分蒸發(fā)。3)直接噴灑等量的無菌水作為對照。4)將樣品封入密封袋，以防止水分蒸發(fā)，30°C恒溫乩。5)將煙絲置于120°C烘箱中烘干，使含水率達(dá)到11^-13 ^
6)將煙絲于22°C相對濕度為60 %的恒溫恒濕箱平衡48h。7)取出部分煙絲，檢測主要化學(xué)成分含量和致香物質(zhì)。8)將剩余的煙絲手工卷制成煙支，樣品和對照隨機編號，由評吸專家組成的評吸小組進(jìn)行感官評吸。常規(guī)化學(xué)成分的檢測結(jié)果表明經(jīng)所述的微生物制劑處理后，煙絲的生物大分子化合物的含量發(fā)生了較大的改變，其中還原糖和總糖的含量發(fā)生了明顯的提高，總氮、纖維素和煙堿的含量發(fā)生了下降，揮發(fā)堿和石油醚提取物總量有所下降，這些化合物的含量的變化有利于煙葉的吸食品質(zhì)。致香成分檢測結(jié)果表明經(jīng)微生物制劑處理后，煙絲的致香成分，包括糠醇、香蘭素、二氫獼猴桃內(nèi)酯、苯甲醇、茄酮、巨豆三烯酮、大馬酮、西柏三烯二醇和新植二烯等的含量較對照顯著提高。感官評吸結(jié)果表明煙絲經(jīng)微生物制劑處理后，香氣量、愉悅性較對照顯著提升， 雜氣、刺激性等下降，煙氣濃度和勁頭減少，余味變得舒適。試驗結(jié)果表明該發(fā)明的微生物制劑具有明顯促進(jìn)煙絲化學(xué)成分變化，從而降低煙絲刺激性、細(xì)膩醇和煙氣，能夠達(dá)到提高煙絲抽吸品質(zhì)的目的。
權(quán)利要求
1.一種微生物制劑，其特征在于，該微生物制劑是采用下述方法制備獲得取從烤煙葉面上分離得到細(xì)菌Van35的液體菌種為原料，按照0. 的接種量接種于200ml的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床，轉(zhuǎn)速180r/min振蕩培養(yǎng)至OD值=2. 0 ；3500rpm/min離心lOmin， 用無菌水洗滌沉淀，離心，然后用20mL無菌水振蕩均勻，使用時稀釋10倍即為所需的微生物制劑；其中，所述的細(xì)菌Van35的液體菌種，經(jīng)鑒定屬于短小芽孢桿菌，該菌株命名為 Bacillus pumilus。
2.—種權(quán)利要求1所述的微生物制劑的制備方法，該方法采用下述步驟(1)烤煙葉面上分離得到細(xì)菌Van35的液體菌種；(2)取液體菌種，按照0.的接種量接種于200ml的LB液體培養(yǎng)基中；(3)在37°C搖床，轉(zhuǎn)速 180r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD 值=2. O ；3500rpm/min 離心 IOmin ；(4)用無菌水洗滌沉淀，離心，最后用20mL無菌水振蕩均勻，使用時稀釋10倍即為所需菌劑。
3.—種權(quán)利要求1所述的微生物制劑在煙絲處理中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙用微生物制劑及其制備方法和應(yīng)用，屬于煙用添加劑的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明由生產(chǎn)菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后得到相應(yīng)的微生物制劑。所述的生產(chǎn)菌株為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus.Van35)，該菌株已于2009年11月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3411。本發(fā)明的微生物制劑，能夠明顯提高煙絲的香氣量、愉悅性等品質(zhì)，雜氣、刺激性等下降，煙氣濃度和勁頭減少，余味變得舒適，從而達(dá)到提高煙絲抽吸品質(zhì)的目的。
文檔編號C12N1/20GK102286403SQ201110199380
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月17日
發(fā)明者何華, 葉靈, 李先毅, 李慶華, 楊麗萍, 段焰青, 王文元, 蔣舉興, 陳興 申請人:紅云紅河煙草(集團)有限責(zé)任公司