專利名稱：一種利用抗氧化劑篩選牛核移植供體細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動 物生殖生理與生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及牛體細(xì)胞核移植中供體細(xì)胞的選擇方法。
背景技術(shù)：
目前核移植的效率平均不到10%。體細(xì)胞核移植效率的提高，有賴于各環(huán)節(jié)的進(jìn)一步完善，而供體細(xì)胞的準(zhǔn)備是核移植關(guān)鍵的一步。供體細(xì)胞的來源和種類，不同發(fā)育階段的供體核，以及供體細(xì)胞體外培養(yǎng)的代數(shù)和供體細(xì)胞來自個體的年齡等的不同，其核移植效果都存在著很大差異。當(dāng)前一些研究是從細(xì)胞的代數(shù)上進(jìn)行選擇，研究結(jié)果尚無定論(高國龍，牛體細(xì)胞克隆中供體和受體細(xì)胞制備及重構(gòu)胚構(gòu)建的影響因素研究；博士論文，2007)，但是在目前很多核移植研究中，大多數(shù)使用的是傳代次數(shù)較少的細(xì)胞，一般為4-6代，很多學(xué)者認(rèn)為這類細(xì)胞利于核移植胚的發(fā)育。在注入受體細(xì)胞前，供體細(xì)胞的體外傳代培養(yǎng)，極有可能造成遺傳損傷。所以，研究者們一般采用短期培養(yǎng)的細(xì)胞(10代以內(nèi))做核供體，不過也有例夕卜，Kubota等用成年牛體細(xì)胞傳至10和15代的細(xì)胞進(jìn)行克隆的重構(gòu)胚發(fā)育率比傳5代的高，并且只有傳至10和15代的細(xì)胞進(jìn)行克隆得到了克隆牛犢。這個明顯不同的研究結(jié)果可能是與供體動物年齡和供體細(xì)胞體外培養(yǎng)的時間長短有很大關(guān)系，也可能是由于不同細(xì)胞系在分化過程中上產(chǎn)生競爭的差異引起的。但理論傾向于原代細(xì)胞(十代以內(nèi))作為核供體較好。還有些研究是從細(xì)胞的來源上進(jìn)行選擇，如牛的卵丘細(xì)胞，輸卵管上皮細(xì)胞跟成纖維細(xì)胞比較前兩者克隆囊胚率較高(Kato Y, et al. Eight calves cloned from somaticcells of a single adult. Science，1998，282 :2095. Kato Y，et al. Cloning of calvesfrom various somatic cell types of male and female adult，new born and fetalcows. J Reprod Fertil, 2000,120 :231)，但是材料的獲得會涉及動物的屠宰或?qū)游矬w傷害較大的手術(shù)，在科技日益發(fā)達(dá)和動物福利日益提高的今天，我們并不提倡用前兩種材料。用牛耳組織成纖維細(xì)胞，不但對牛的傷害較小，改善細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)后還可相應(yīng)的提高克隆形成率，是值得推廣的技術(shù)?；钚匝?Reactive Oxygen Species, R0S)又被稱為三原子氧,是在自然界普遍存在的，它是氧的代謝產(chǎn)物和一些氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的含氧物質(zhì)的總稱(Kalghatgi,Fridmanet al，2009)。生物體內(nèi)的ROS可通過機體酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的內(nèi)源性活性氧，也可來自環(huán)境的外源性活性氧。體內(nèi)ROS可在很多反應(yīng)過程中產(chǎn)生(Miranda, Purdie et al.)。在有機體組織的正常氧化代謝過程中產(chǎn)生的R0S，通常通過組織內(nèi)部的防御機制來維持平衡。但是在一些損傷因素的作用下，細(xì)胞中抗氧化保護(hù)機制不足時，細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝物增加，使ROS產(chǎn)生堆積并對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。在體外培養(yǎng)的情況下，我們可以人為的加入一定量的抗氧化劑(Antioxidants),使細(xì)胞免于氧化應(yīng)激和一些可控制的氧化損傷,使細(xì)胞保持更強的活力，更好的傳代培養(yǎng)，以供我們的后續(xù)研究。
目前研究中所用的抗氧化劑主要分為兩類酶類抗氧化劑主要包括超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、?；撬?、亞?；撬岬群头敲割惪寡趸瘎┲饕ňS生素C(VC)、維生素E(VE)、β-巰基乙醇(2-巰基乙醇，β -mercaptoethanol, β -ME),氮-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine),谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、裡黑素(Melatonin, MLT)、類胡蘿卜素(Carotenoid)、α -硫辛酸(a -Lipoic acid)、微量兀素銅、 鋒、硒(Se)等(Sakamoto, Munemura et al, 2008) 有研究證實，在體外培養(yǎng)動物體細(xì)胞時，在培養(yǎng)過程中添加抗氧化劑能夠提高細(xì)胞的抗氧化能力。Zhou等考察了抗氧化劑對鼠角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)壽命的影響。試驗發(fā)現(xiàn)在角質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)過程中添加抗氧化劑有利于延長細(xì)胞的壽命，其中效果最好的是巰基乙醇，其次為CAT和S0D，試驗還發(fā)現(xiàn)，添加抗氧化劑可在一定程度上提高角質(zhì)細(xì)胞的克隆形成率，減緩細(xì)胞衰老速率，利于細(xì)胞的生長(Zhou T et al，2002)。而將β-巰基乙醇用于牛供體細(xì)胞的培養(yǎng)現(xiàn)在還未發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，建立新的方法篩選牛核移植供體細(xì)胞，提高供體細(xì)胞的活力，從而提高體細(xì)胞核移植的效率。本發(fā)明利用接種法培養(yǎng)牛耳組織成纖維細(xì)胞，挑選細(xì)胞活力最強的第六代細(xì)胞進(jìn)行β -巰基乙醇的不同濃度梯度處理，選擇活力和抗氧化能力最強100 μ mol/L β-巰基乙醇處理的細(xì)胞進(jìn)行核移植，檢測胚胎的卵裂率和囊胚率。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種利用抗氧化劑篩選核移植供體細(xì)胞的方法，其步驟如下I)剪取牛耳尖端4_5cm2的組織，利用接種法培養(yǎng)得到牛耳組織成纖維細(xì)胞；2)在步驟I)的細(xì)胞傳至2、6、13、20代時分別測定細(xì)胞活力(MTT OD值)；3)挑選細(xì)胞活力較強，即MTT OD值為O. 609±0. 053的第六代的細(xì)胞，備用；4)用濃度為100 μ mol/L的β -巰基乙醇處理步驟3)所得細(xì)胞培養(yǎng)24h的細(xì)胞作為供體細(xì)胞；5)取牛卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)至成熟,備用；6)將步驟5)的牛卵母細(xì)胞作為受體，進(jìn)行核移植，觀察并記錄重構(gòu)胚的卵裂率和囊胚率；其中上述試劑的組分及配制方法如下細(xì)胞培養(yǎng)液-I和細(xì)胞培養(yǎng)液-2 ；細(xì)胞培養(yǎng)液-I :胎牛血清10ml，青霉素-鏈霉素抗菌液1ml，用杜貝柯氏最小必需培養(yǎng)液定容至IOOml ；細(xì)胞培養(yǎng)液-2 :胎牛血清20ml，青霉素-鏈霉素抗菌液1ml，用杜貝柯氏最小必需培養(yǎng)液定容至IOOml ；抗氧化劑培養(yǎng)液向細(xì)胞培養(yǎng)液-I中添加巰基乙醇，其濃度分別為O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、和 150 μ mol/L,過濾除菌，4°C下保存；成熟培養(yǎng)液TCM199(購自Gibco公司，下同)26ml ;胎牛血清3. Oml ;促卵泡激素15 μ g ;促黃體素150ng ;雌二醇30 μ g ;表皮生長因子150ng ;丙酮酸鈉6. 6mg ;青霉素_鏈霉素抗菌液O. 3ml ;過濾滅菌，4°C下保存；胚胎培養(yǎng)液肌醇O. 015g;必須氨基酸900 μ I ;非必需氨基酸300 μ I ;牛血清白蛋白0.09g ;青霉素-鏈霉素抗菌液300 μ I ;丙酮酸鹽600 μ I ；Stock G30 μ I ；StockC28ml ;過濾滅菌，4 °C下保存；各種鹽溶液的配制Stock A NaCll. 267g ；KC10. 107g ；KH2PO4O. 032g ；MgS04 · 7H200. 036g ;青霉素-鏈霉素抗菌液 O. 2ml ;Na_LactateO. 12ml ；H2019. 5ml ；Stock B =NaHCO3O. 21g ；H2OIOml ；Stock D =CaCl2 · 2H200. 262g ；H2OIOml ；Stock G :L_GlucoseO. 292g ；H2010ml ；Stock C STOCK Al. Iml ；STOCK BI. 0ml ；STOCK DO. Iml ；H207. 9ml。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對現(xiàn)有技術(shù)的貢獻(xiàn)主要體現(xiàn)在以下幾個方面本發(fā)明利用不同濃度的抗氧化劑處理供體細(xì)胞，直接檢測細(xì)胞的抗氧化能力，來對細(xì)胞進(jìn)行篩選，避免了核移植顯微注射過程中選擇供體細(xì)胞的盲目性。本發(fā)明選擇活力最為旺盛，增殖最為迅速的第六代細(xì)胞進(jìn)行處理再細(xì)胞核移植，避免了細(xì)胞代數(shù)選擇的盲目性，節(jié)省了時間和資源?！?br> 本發(fā)明得到β -巰基乙醇處理牛供體細(xì)胞的的最佳濃度為100 μ mol/L,此濃度處理的供體細(xì)胞的抗氧化能力最強，活力最高，用這種細(xì)胞進(jìn)行核移植，可為重構(gòu)胚更好的發(fā)育提供基礎(chǔ)。樣品采集后，可在4攝氏度冰箱中短期保存，給試驗者提供了足夠的準(zhǔn)備時間，降低了試驗者的壓力，也提高了試驗的成功率。本發(fā)明可在不對動物體造成巨大傷害的情況下應(yīng)用，成纖維細(xì)胞材料只需剪去牛耳尖少部分組織即可，剪取組織后，可用抗生素對牛進(jìn)行靜脈注射，和對傷口進(jìn)行處理，來降低傷口感染的幾率。對牛的應(yīng)激也比非常小，響應(yīng)了社會對提高動物福利的呼吁。目前大部分核移植選取的供體細(xì)胞是從屠宰后的個體取得的，個體死亡后細(xì)胞的活力有相應(yīng)的降低，再經(jīng)過長時間的試驗過程，細(xì)胞的活力會明顯的下降，核移植效果就會受到影響。本發(fā)明可進(jìn)行活體采樣，在對個體不產(chǎn)生大的應(yīng)激的情況下，提高核移植的效率。


圖I :是本發(fā)明的技術(shù)路線。圖2 :是第I代牛耳組織成纖維細(xì)胞。圖3 :是第6代牛耳組織成纖維細(xì)胞。圖4 :是第13代牛耳組織成纖維細(xì)胞。圖5 :是第20代牛耳組織成纖維細(xì)胞。圖6 :處于卵裂期的牛克隆胚胎(X 100)。圖7 :處于囊胚期的?？寺∨咛?X200)。
具體實施例方式I、供體細(xì)胞的培養(yǎng)和核移植I)采樣用75%的酒精擦洗牛耳尖端4-5cm2的組織，用眼科剪刀剪取組織，用75%的酒精沖洗組織三遍，再用含有雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗三遍，放入細(xì)胞培養(yǎng)液-I中，得到牛耳組織樣品；2)接種法培養(yǎng)牛耳成纖維細(xì)胞將所述的牛耳組織樣品分別用75%酒精和1%雙抗的PBS沖洗三次，置玻璃皿中，剔除毛發(fā)和表皮，用眼科剪剝?nèi)∑湔嫫そM織，用含I %雙抗的PBS充分沖洗后剪至Imm3左右的小組織塊,置于細(xì)胞培養(yǎng)液_1中，于800r/min離心3min,反復(fù)洗滌6-8次；加入少量細(xì)胞培養(yǎng)液_2，將離心洗滌后的組織塊均勻鋪于培養(yǎng)皿底部，吸出多余培養(yǎng)液，置于37. 5°C，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育；孵育時間為8-12h ;再加入細(xì)胞培養(yǎng)液-22. 5-3ml，每隔兩天更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液-2 —次；
3)傳代觀察培養(yǎng)皿中組織塊邊緣是否有細(xì)胞長出，當(dāng)細(xì)胞長滿皿底95%以上時，剔除組織塊；用胰蛋白酶消化細(xì)胞3-5min，觀察細(xì)胞是否變圓，并漂浮于培養(yǎng)液中，力口入含細(xì)胞培養(yǎng)液-I終止消化，1200r/min離心5min，重復(fù)離心兩次，將一個培養(yǎng)皿的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至兩個新的培養(yǎng)皿中；4)在細(xì)胞傳至2、6、13、20代時分別測定細(xì)胞活力，即MTT-OD值測定；5)挑選細(xì)胞活力最強(MTT-0D值為O. 609 ±O. 053)的第六代細(xì)胞，備用；6)分別用含有 O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、和 150 μ mol/L β -疏基乙醇(β -ME)的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，然后測定細(xì)胞的MTT-OD值和抗氧化指標(biāo)，即測定細(xì)胞中總谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dimutese, S0D)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、丙二醒(Malondialdehyde,MDA)和總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity, T-A0C),計 5 個指標(biāo)(GSH-Px、SOD、CAT為細(xì)胞內(nèi)的三種抗氧化酶，T-AOC為細(xì)胞內(nèi)總的抗氧化能力，這四種指標(biāo)的高低能夠直接反應(yīng)細(xì)胞的抗氧化能力的高低；機體產(chǎn)生的氧自由基能夠引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物MDA的量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化強弱，進(jìn)而間接的反應(yīng)細(xì)胞損傷程度)；7)選擇細(xì)胞活力和抗氧化力最強的100 μ mol/L的β -巰基乙醇處理24h的細(xì)胞使用含0. 5%胎牛血清的DMEM饑餓處理，同時將第六代細(xì)胞做同樣的饑餓處理，均作為供體細(xì)胞，備用；8)卵母細(xì)胞的制備將離體卵巢迅速放入37°C PBS中，用75%的酒精泡lmin，再用含有雙抗的PBS沖洗3 4次，之后用帶有12#針頭的IOml —次性注射器從大小為2_8mm卵泡中吸取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs)放入成熟培養(yǎng)微滴中成熟培養(yǎng)，每100 μ I成熟培養(yǎng)微滴中含20-25個卵母細(xì)胞，培養(yǎng)皿放入38. 5°C>5% CO2和相對飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22-24h至成熟，備用；9)將上述的牛卵母細(xì)胞作為受體，進(jìn)行核移植，設(shè)計了以下三個試驗第一組將第六代牛耳組織成纖維細(xì)胞為供體進(jìn)行核移植；第二組(單處理組)將第六代牛耳組織成纖維細(xì)胞為供體進(jìn)行核移植，重構(gòu)胚用100 μ mol/L胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)；第三組(雙處理組)將第六代牛耳組織成纖維細(xì)胞作為供體進(jìn)行核移植，得到重構(gòu)胚。重構(gòu)胚用ΙΟΟμπιοΙ/L^-ME的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)。觀察并記錄重構(gòu)胚的卵裂率和囊胚率；10)核移植將體外成熟培養(yǎng)的COCs轉(zhuǎn)入含O. I %濃度的透明質(zhì)酸酶的成熟培養(yǎng)液中消化5分鐘，再用移液槍反復(fù)吹打，之后用成熟培養(yǎng)液(OMM)洗2-3次，盡量去掉卵丘細(xì)胞，隨后放在體視顯微鏡下挑選包含第一極體的卵母細(xì)胞作為受體，之后將其放入含5 μ g/ml細(xì)胞松弛素的新鮮配制的OMM的操作液微滴中，其上覆蓋礦物油平衡10-15min，在顯微操作儀下，用去核針去除第一極體及附近的胞質(zhì)，放在5 μ g/ml Hoechst 33342染色液中檢測去核效果，將去核完全的受體卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)用注核針吸入邊緣光滑、胞質(zhì)均勻的步驟8中的供體細(xì)胞，形成重組胚；重組胚轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)液中修復(fù)2-3h ；11)修復(fù)后的重組胚在含5 μ mol/L離子霉素的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)5min，再用培養(yǎng)液洗2-3遍，然后將其放入含2mmol/L 6- 二甲氨基吡啶的SOF胚胎培養(yǎng)液中孵育4h，再沖洗2-3次之后，第二組和第三組轉(zhuǎn)移到含β -巰基乙醇100 μ mol/L的胚胎培養(yǎng)液微滴中，第一組轉(zhuǎn)移到不含β -巰基乙醇的SOF胚胎培養(yǎng)液微滴中，置38. 5°C>5% CO2和相對飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中，每48h換一次液，72h后加入10%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)，觀察并記錄胚·胎發(fā)育情況；其中上述各試劑的配制細(xì)胞培養(yǎng)液-I和細(xì)胞培養(yǎng)液-2的配制細(xì)胞培養(yǎng)液-I (10% DMEM):胎牛血清10ml，Iml青霉素-鏈霉素抗菌液(簡稱雙抗，P/S)，用杜貝柯氏最小必需培養(yǎng)液(DMEM)定容至IOOml ；細(xì)胞培養(yǎng)液-2 (20% DMEM):胎牛血清20ml，Iml青霉素-鏈霉素抗菌液(簡稱雙抗，P/S)，用杜貝柯氏最小必需培養(yǎng)液(DMEM)定容至IOOml ；抗氧化劑培養(yǎng)液向細(xì)胞培養(yǎng)液-I中添加巰基乙醇(β-ΜΕ)，其濃度分別為O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、和 150 μ mol/L,過濾除菌，4°C下保存；磷酸鹽緩沖液(PBS)NACL 8. 00g/L ；KCL 0. 20g/L ；KH2PO4 0. 20g/L ；NA2HPO4
I.15g/L ;用超純水溶解,滅菌后常溫保存；成熟培養(yǎng)液(OocyteMature Medium, 0MM,以 30ml 為例):TCM199(購自 Gibco公司)26ml ;胎牛血清(FBS) 3. Oml ;促卵泡激素(FSH) 15 μ g ;促黃體素(LH)150ng;雌二醇30yg(E2);表皮生長因子150ng;丙酮酸鈉6.6mg，青霉素-鏈霉素抗菌液(雙抗，P/
S)0. 3m ;過濾滅菌，4°C下保存；SOF胚胎培養(yǎng)液肌醇0.015g ;必須氨基酸900 μ 1+ ;非必需氨基酸300 μ I ;牛血清白蛋白出3六)0.098;30(^1青霉素-鏈霉素抗菌液(雙抗，P/S)300y I ;丙酮酸鹽600 μ I ；Stock G30 μ I ；Stock C28ml ;過濾滅菌，4°C下保存；各種鹽溶液的配制Stock A NaCll. 267g ；KC10. 107g ；KH2PO4O. 032g ；MgS04 · 7H200. 036g ;青霉素-鏈霉素抗菌液 0. 2ml ;Na_Lactate0. 12ml ；H2019. 5ml ；Stock B =NaHCO3O. 21g ；H2010ml ；Stock D =CaCl2 · 2H200. 262g ；H2010ml ；Stock G :L_Glucose0. 292g ；H2010ml ；
Stock C STOCK Al. Iml ；STOCK BI. Oml ；STOCK DO. Iml ；H207. 9ml。2、不同代次細(xì)胞活力的測定MTT分析法，活細(xì)胞的線粒體中存在與NADPH相關(guān)的脫氫酶，可將黃色MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色的結(jié)晶甲臢(Formazan)，死細(xì)胞此酶消失，MTT不被還原。用DMSO溶解甲臢后可用酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測光密度。收集對數(shù)期生長的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5. OX IO4個/ml，每孔加入IOOul，使待測細(xì)胞調(diào)密度為5000個/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。5% C02，37. 5°C孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，每孔加入20 μ IMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μ I 二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀0D490nm處測量各孔的吸光值。得到如表I所示的數(shù)據(jù) 表I β -ME處理前的細(xì)胞MTTOD值比較
代次261320
MTTOD0.591±0.030a0.609±0.053a0.590±0.022a0.221±0.032b注同行肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P < 0. 05)從表I我們可以看出，牛第20代和2,6,13之間差異都極顯著(P < 0. 01)，第2，6，13代之間差異不顯著(P >0.05)。YCF第2和6代次之間差異顯著(P < 0. 05)，第20和2，6，13代之間差異極顯著(P <0.01)?？偨Y(jié)第六代細(xì)胞活力最為旺盛，增殖最為迅速，為使核移植效率達(dá)到最高，又不浪費時間和資源的情況下，我們就可以對第六代細(xì)胞進(jìn)行處理后再細(xì)胞核移植。3、不同濃度β-ME處理后供體細(xì)胞活力的測定得到如表2所示的數(shù)據(jù)表2用不同濃度β -ME處理后細(xì)胞的MTT-OD值比較
β-ΜΕOpmol/L50pmol/L100pmo]/L150μηιο1/
MTT(OD)0.632±0.034a0.817±0.013b0.941±0.028°0.910±0.061d注同行肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P < 0. 05)從表2可以看出，在β-ΜΕ濃度為100 μ mol/L時，細(xì)胞的OD值最高，且細(xì)胞的四種處理之間差異均顯著(P < 0. 05)。說明添加β -ΜΕ，可以明顯提高細(xì)胞的活性(P < 0. 05)，有利于細(xì)胞的增殖，降低了細(xì)胞的凋亡率，用100 μ mol/L的β-ΜΕ處理最為合適，既提高了細(xì)胞的活性，又避免了 β -ME可能對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性。3、不同濃度β -ME處理后供體細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的測定去除細(xì)胞培養(yǎng)液后，加入3ml0. 5% Triton的Tirs-HCL溶液，在室溫下溶解細(xì)胞30分鐘，收集細(xì)胞裂解液，置于-20°C冰箱中保存，用于測定細(xì)胞中總谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dimutese, S0D)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、丙二醒(Malondialdehyde, MDA)和總抗氧化能力(TotalAntioxidant Capacity, T-AOC),計5個指標(biāo)。試劑盒購自南京建成生物工程研究所,具體操作步驟按照說明書進(jìn)行，測定數(shù)據(jù)按照說明書計算得出，試驗設(shè)3個重復(fù)。得到如表3所示的數(shù)據(jù)表3不同濃度β-ΜΕ處理后細(xì)胞的抗氧化指標(biāo)比較
權(quán)利要求
1. 一種篩選牛核移植供體細(xì)胞的方法，其特征在于以下步驟 1)剪取牛耳尖端4-5cm2的組織，利用接種法培養(yǎng)得到牛耳組織成纖維細(xì)胞； 2)在步驟I)的細(xì)胞傳至2、6、13、20代時分別測定細(xì)胞活力，即MTTOD值； 3)挑選細(xì)胞活力OD值為O.609±0. 053的第六代的細(xì)胞，備用； 4)用濃度為100μ mol/L的β -巰基乙醇處理步驟所得的細(xì)胞24h的細(xì)胞作為供體細(xì)胞； 5)取牛卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)至成熟，備用； 6)將步驟5)的牛卵母細(xì)胞作為受體，進(jìn)行核移植，觀察并記錄重構(gòu)胚的卵裂率和囊胚率; 其中 上述試劑的組分及配制方法如下 細(xì)胞培養(yǎng)液-I和細(xì)胞培養(yǎng)液-2 ； 細(xì)胞培養(yǎng)液-I :胎牛血清10ml，青霉素-鏈霉素抗菌液1ml，用杜貝柯氏最小必需培養(yǎng)液定容至IOOml ； 細(xì)胞培養(yǎng)液-2 :胎牛血清20ml，青霉素-鏈霉素抗菌液1ml，用杜貝柯氏最小必需培養(yǎng)液定容至IOOml ； 抗氧化劑培養(yǎng)液向細(xì)胞培養(yǎng)液-I中添加巰基乙醇，其濃度分別為O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、和 150 μ mol/L,過濾除菌，4°C下保存； 成熟培養(yǎng)液TCM199 26ml ;胎牛血清3. Oml ;促卵泡激素15 μ g ;促黃體素150ng ;雌二醇30 μ g ;表皮生長因子150ng ;丙酮酸鈉6. 6mg ;青霉素-鏈霉素抗菌液0. 3ml ;過濾滅菌，4°C下保存； 胚胎培養(yǎng)液肌醇0.015g ;必須氨基酸900 μ I ;非必需氨基酸300 μ I ;牛血清白蛋白0.09g ;青霉素-鏈霉素抗菌液300 μ I ;丙酮酸鹽600 μ I ；Stock G30 μ I ；Stock C28ml ;過濾滅菌，4°C下保存； 各種鹽溶液的配制Stock A NaCll. 267g ；KC10. 107g ；KH2PO4O. 032g ；MgS04 · 7H200. 036g ;青霉素-鏈霉素抗菌液 0. 2ml ；Na-Lactate0. 12ml ；H2019. 5ml ；Stock B =NaHCO3O. 21g ；H2010ml ；Stock D =CaCl2 · 2H200. 262g ；H2010ml ；Stock G L-Glucose0. 292g ；H2010ml ；Stock C STOCK AL Iml ；STOCK BI. 0ml ；STOCK DO. Iml ；H207. 9ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物生殖和分子生物學(xué)操作技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及牛體細(xì)胞核移植中供體細(xì)胞的選擇方法。公開了一種利用抗氧化劑篩選牛核移植供體細(xì)胞的方法。為了提高牛核移植效率中的供體細(xì)胞的數(shù)量，本發(fā)明利用活體采樣，接種法培養(yǎng)細(xì)胞，穩(wěn)定傳代的活力為OD值為0.609±0.053的第六代細(xì)胞，用濃度為100μmol/L的β-巰基乙醇處理細(xì)胞24h后的細(xì)胞作為供體細(xì)胞，為重構(gòu)胚更好的發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/071GK102899353SQ20111021895
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月30日
發(fā)明者易建明, 趙玲玲, 宋海泉, 楊利國, 陶林林 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)