專(zhuān)利名稱(chēng)：Ibdv無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)增殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將雞傳染性法氏囊病毒在無(wú)血清培養(yǎng)基及微載體的懸浮培養(yǎng)Vero上的增殖，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)，是由傳染性法氏囊病毒 (IBDV)引起的雞的一種高度接觸性傳染病，最早發(fā)生于美國(guó)Delaware州的Gamboro地區(qū)， 主要感染3飛周齡的青年雞，病毒在法氏囊的淋巴細(xì)胞中迅速繁殖，損傷法氏囊的B淋巴細(xì)胞，引起嚴(yán)重的免疫抑制。1980年以后該病傳入我國(guó)并大面積暴發(fā)和持續(xù)流行，嚴(yán)重影響了我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，當(dāng)前對(duì)于該病普遍采用接種疫苗的進(jìn)行預(yù)防。目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)IBDV疫苗大部分采用雞胚培養(yǎng)增殖病毒或有血清培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞。在培養(yǎng)基中添加一定量的新鮮血清，常用胎牛血清或小牛血清，因?yàn)檠蹇晒┙o細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成份，血清中的激素可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，血清中的許多結(jié)合蛋白對(duì)激素、維生素和脂類(lèi)等有穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用。但是，培養(yǎng)基中含有血清成份，用以制造疫苗可誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)提純和收獲細(xì)胞產(chǎn)物帶來(lái)很大困難，加上每批血清的質(zhì)量不同，從而影響疫苗的穩(wěn)定性。由血清使用所造成的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物安全性的不確定因素增加的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，成為動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應(yīng)用的發(fā)展動(dòng)因。隨著動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，為包括Vero細(xì)胞在內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用提供了必要的技術(shù)支撐，無(wú)血清培養(yǎng)已成為包括疫苗在內(nèi)的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)的總趨勢(shì)。2010 年，美國(guó)、歐盟和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家將全面停止在生物制藥中應(yīng)用血清，F(xiàn)DA將停止含血清細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)的生物技術(shù)新藥的申報(bào)受理。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)普遍使用轉(zhuǎn)瓶接種IBDV的生產(chǎn)方式，培養(yǎng)體積0. 5L左右，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模制備。國(guó)外已經(jīng)使用微載體在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)部分病毒性疫苗產(chǎn)品， 國(guó)內(nèi)個(gè)別企業(yè)通過(guò)引進(jìn)技術(shù)已經(jīng)使用微載體Vero細(xì)胞生產(chǎn)疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種IBDV病毒在無(wú)血清培養(yǎng)基以及微載體懸浮培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞上增殖的方法，本發(fā)明的另一個(gè)目的是篩選出適合IBDV病毒在無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下增殖新的培養(yǎng)基成分，適合大批量病毒的制備，并避免了血清中攜帶外源性病毒的危害。本發(fā)明的IBDV無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)增殖的方法，包括下列步驟
DVero細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)的馴化逐步降低Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度，在15代之內(nèi)將血清降低到0. 2% ；將低血清培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)到無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞適應(yīng)后， 擴(kuò)增細(xì)胞作為種子庫(kù)細(xì)胞；
2) IBDV病毒增殖將馴化的細(xì)胞接種到含0. 25%的乳清蛋白水解物的無(wú)血清培養(yǎng)基， 待細(xì)胞粘附到微載體并開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)接種IBDV病毒，90h收獲病毒。
優(yōu)選地，
所說(shuō)的步驟2)中IBDV病毒增殖具體包括以下步驟
1)將無(wú)血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞消化后離心，按照3、XIO5ceIVmL的初始密度重懸到病毒維持液中；病毒維持液成分為含0. 25%的乳清蛋白水解物的無(wú)血清培養(yǎng)基IVT ；細(xì)胞初始培養(yǎng)條件為PH值7. 1、懸浮培養(yǎng)攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37 °C ；
2)待細(xì)胞在微載體上貼附后，接種IBDV病毒，接種病毒時(shí)的微載體的粘球率達(dá)到 40^50% ；病毒接種量病毒以0. 0Γ0. 2的感染復(fù)數(shù)接種；IBDV病毒增殖期間，維持條件ρΗ 值7. 2、懸浮培養(yǎng)攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37°C，接種90h收獲病毒。本發(fā)明對(duì)從ATCC引進(jìn)的Vero細(xì)胞進(jìn)行馴化，降血清的培養(yǎng)，最終獲得無(wú)血清微載體培養(yǎng)條件下的Vero細(xì)胞，同時(shí)改進(jìn)IBDV病毒增殖時(shí)培養(yǎng)基成分，減少外源性病毒的影響，提高IBDV在無(wú)血清微載體培養(yǎng)條件下的病毒效價(jià)。通過(guò)優(yōu)化病毒繁殖培養(yǎng)基增殖的 IBDV病毒效價(jià)高于未優(yōu)化培養(yǎng)基增殖的IBDV和采用雞胚成纖維細(xì)胞增殖的IBDV病毒效價(jià)；與Vero細(xì)胞有血清培養(yǎng)的IBDV相當(dāng)；免疫原性實(shí)驗(yàn)表明該病毒的免疫原性強(qiáng)，適合作為疫苗生產(chǎn)。


圖1是經(jīng)馴化的Vero細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞形態(tài)；
圖2是經(jīng)馴化的Vero細(xì)胞在無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞形態(tài)； 圖3是經(jīng)馴化的Vero細(xì)胞在無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)時(shí)的具體生長(zhǎng)曲線； 圖4是無(wú)血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)增殖IBDV的細(xì)胞形態(tài)(接毒后Mh、48h、 72h、90h)；
圖5不同培養(yǎng)方式增殖的IBDV效價(jià)比較。
具體實(shí)施例方式以下敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例，應(yīng)該說(shuō)明的是實(shí)施例只對(duì)本發(fā)明有說(shuō)明作用，而沒(méi)有限制作用。本發(fā)明使用的無(wú)血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞由江蘇省農(nóng)科院國(guó)家獸用生物制品研究中心馴化并保存；無(wú)血清培養(yǎng)IVT購(gòu)于Cell Culture "Technologies公司；降血清培養(yǎng)過(guò)程中使用的培養(yǎng)基一199購(gòu)于北京清大天一公司；微載體Cytodex 1購(gòu)于GE healthcare，將干燥的微載體放入無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS中浸泡池，之后再用PBS洗滌2次，經(jīng)121 °C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后置4°C待用，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2次后即可使用；5L細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器購(gòu)于上海國(guó)強(qiáng)生物技術(shù)有限公司，乳清蛋白水解物購(gòu)于Sigma公司。實(shí)施例1馴化Vero細(xì)胞在無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)馴化Vero細(xì)胞在無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)包括下列步驟 1、馴化Vero細(xì)胞
復(fù)蘇Vero細(xì)胞，采用序貫適應(yīng)法適應(yīng)方法馴化細(xì)胞。在細(xì)胞適應(yīng)過(guò)程中，以 1 X 105cell/mL細(xì)胞濃度傳代。序貫適應(yīng)法詳細(xì)步驟Vero細(xì)胞在10% FCS的DMEM中復(fù)蘇培養(yǎng)，再依次在5%、洲 、1%、0. 5%FCS的199培養(yǎng)基中傳代，逐步降低血清濃度，最后在15代內(nèi)將細(xì)胞轉(zhuǎn)到無(wú)血清IVT培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖1所示。馴化后的細(xì)胞較10%血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)；細(xì)胞1分3傳代后，4h后細(xì)胞貼壁開(kāi)始生長(zhǎng)；在培養(yǎng)24h后達(dá)到生長(zhǎng)高峰，72h長(zhǎng)滿細(xì)胞瓶。穩(wěn)定培養(yǎng)5代后，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞，建立初始細(xì)胞庫(kù)F0-IVT。,Vero細(xì)胞的復(fù)蘇與擴(kuò)大培養(yǎng)
從初始細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇FO-IVT的Vero細(xì)胞，將細(xì)胞在方瓶中擴(kuò)增到一定數(shù)量。、Vero細(xì)胞在無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)
將無(wú)血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞用0. 25%的胰酶消化后，重懸于新鮮的IVT培養(yǎng)基中， 1500rpm離心IOmin后，棄上清。將細(xì)胞再次重懸在新鮮的IVT培養(yǎng)基中，細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照按照3、X IO5ceIVmL的初始密度接種到含2g/L的微載體懸液中，進(jìn)入反應(yīng)器培養(yǎng)。5L細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件pH值7. 1、攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度 37°C。如圖2所示，細(xì)胞在他后貼附微載體，并開(kāi)始生長(zhǎng)。每天取樣觀察細(xì)胞狀態(tài)，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞在4天后達(dá)到最大細(xì)胞密度1. 2X106cell/mL,具體生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。
實(shí)施例2 IBDV (雞傳染性法氏囊病毒)在無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上增殖
1、初始Vero細(xì)胞在無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)
將無(wú)血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞用0. 25%的胰酶消化后，重懸于新鮮的IVT培養(yǎng)基中， 1500rpm離心IOmin后，棄上清。將細(xì)胞按照3、X 105cell/mL的初始密度重懸在病毒維持液中含0. 25%的乳清蛋白水解物的無(wú)血清培養(yǎng)基IVT，進(jìn)入反應(yīng)器培養(yǎng)。細(xì)胞初始培養(yǎng)條件pH值7. 1、懸浮培養(yǎng)攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37°C ；
2、IBDV病毒的增殖
待細(xì)胞在微載體上貼附后，接種IBDV病毒，接種病毒時(shí)的微載體的粘球率達(dá)到 40 50% ；
病毒接種量病毒以0. ΟΓΟ. 2的感染復(fù)數(shù)接種；
IBDV病毒增殖期間，維持條件ρΗ值7. 2、懸浮培養(yǎng)攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度 37 °C。接毒后24h取樣觀察，接毒后24h細(xì)胞仍處于生長(zhǎng)階段，細(xì)胞密度可以達(dá)到 5、X IO5Cel 1/mL，48h細(xì)胞有部分開(kāi)始從微載體上脫落，72h有50%左右細(xì)胞脫落，最終90h 細(xì)胞大部分從微載體上，收獲病毒。、IBDV病毒效價(jià)的測(cè)定
病毒收獲后反復(fù)凍融3次，釋放病毒，在制備好的CEF上測(cè)定病毒效價(jià)，同時(shí)測(cè)定CEF 增殖的IBDV、10%血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞增殖IBDV病毒效價(jià)，進(jìn)行比較。結(jié)果顯示無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞增殖的IBDV病毒效價(jià)TCID5tl從Mh IO4 VmL到最終培養(yǎng)90h收獲病毒時(shí)的IO7 5AiL ；病毒增殖1000倍。高于未優(yōu)化培養(yǎng)基增殖的IBDV的IOVmL ；比CEF增殖的IBDV的107/mL高；等同于10%血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞增殖IBDV病毒效價(jià)(圖5)。、IBDV病毒免疫原性檢測(cè)
將病毒制成疫苗后，免疫21日齡雞，免疫疫苗后7、14、21二8天，采血分離血清。采用固定病毒稀釋血清法進(jìn)行血清中和試驗(yàn)，檢測(cè)血清中抗體效價(jià)，當(dāng)血清稀釋2500倍后仍能中和100 TCID5tl的病毒，不產(chǎn)生病變，認(rèn)為合格，判為陽(yáng)性血清。 檢測(cè)結(jié)果表明自制油苗，在免疫后14天產(chǎn)生20%的陽(yáng)性率，21J8天陽(yáng)性率升高到83. 3%,90. 7%，可以肯定由無(wú)血清微載體懸浮增殖的IBDV免疫原性較好。
權(quán)利要求
1.IBDV無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)增殖的方法，其特征在于，包括下列步驟DVero細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)的馴化逐步降低Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度，在15代之內(nèi)將血清降低到0. 2% ；將低血清培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)到無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞適應(yīng)后， 擴(kuò)增細(xì)胞作為種子庫(kù)細(xì)胞；2) IBDV病毒增殖將馴化的細(xì)胞接種到含0. 25%的乳清蛋白水解物的無(wú)血清培養(yǎng)基， 待細(xì)胞粘附到微載體并開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)接種IBDV病毒，90h收獲病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IBDV無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)增殖的方法，其特征在于，所說(shuō)的步驟2)中IBDV病毒增殖具體包括以下步驟1)將無(wú)血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞消化后離心，按照3、XIO5ceIVmL的初始密度重懸到病毒維持液中；病毒維持液成分為含0. 25%的乳清蛋白水解物的無(wú)血清培養(yǎng)基IVT ；細(xì)胞初始培養(yǎng)條件為PH值7. 1、懸浮培養(yǎng)攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37 °C ；2)待細(xì)胞在微載體上貼附后，接種IBDV病毒，接種病毒時(shí)的微載體的粘球率達(dá)到 40^50% ；病毒接種量病毒以0. ΟΓΟ. 2的感染復(fù)數(shù)接種；IBDV病毒增殖期間，維持條件ρΗ 值7. 2、懸浮培養(yǎng)攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37°C，接種90h收獲病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種IBDV無(wú)血清微載體懸浮培養(yǎng)增殖的方法，包括下列步驟1)Vero細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)的馴化；2)IBDV病毒增殖將馴化的細(xì)胞接種到含0.25%的乳清蛋白水解物的無(wú)血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞粘附到微載體并開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)接種IBDV病毒，90h收獲病毒。本發(fā)明對(duì)從ATCC引進(jìn)的Vero細(xì)胞進(jìn)行馴化，降血清的培養(yǎng)，最終獲得無(wú)血清微載體培養(yǎng)條件下的Vero細(xì)胞，同時(shí)改進(jìn)IBDV病毒增殖時(shí)培養(yǎng)基成分，減少外源性病毒的影響，提高IBDV在無(wú)血清微載體培養(yǎng)條件下的病毒效價(jià)。通過(guò)優(yōu)化病毒繁殖培養(yǎng)基增殖的IBDV病毒效價(jià)高于未優(yōu)化培養(yǎng)基增殖的IBDV和采用雞胚成纖維細(xì)胞增殖的IBDV病毒效價(jià)；與Vero細(xì)胞有血清培養(yǎng)的IBDV相當(dāng)；免疫原性實(shí)驗(yàn)表明該病毒的免疫原性強(qiáng)，適合作為疫苗生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102268411SQ20111023180
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者侯繼波, 馮磊, 吳培培, 王偉峰 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院