專利名稱：無血清培養(yǎng)bhk21細胞的方法和制備疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)BHK21細胞的方法以及制備疫苗的方法，尤其是一種無血清 培養(yǎng)BHK21細胞的方法以及包括所述培養(yǎng)BHK21細胞的方法的制備疫苗的方法。
背景技術：
現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法中，一般通過增加大豆水解產(chǎn)物作為無血 清動物細胞培養(yǎng)基的組分，來提高被培養(yǎng)BHK21細胞培養(yǎng)穩(wěn)定性和培養(yǎng)密度、增加被培養(yǎng) BHK21細胞產(chǎn)量及利用BHK21細胞作為表達載體后所產(chǎn)生重組靶蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)量。并且認 為其它植物的水解產(chǎn)物，例如小麥水解產(chǎn)物不能得到與大豆水解產(chǎn)物相當?shù)挠幸嫘Ч?。例如CN 1318577C(專利號00816020. 1)中公開了一種培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法， 該方法使用了無蛋白無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物，其中至少40%的所述 大豆水解產(chǎn)物的分子量< 500道爾頓。該培養(yǎng)基能夠起到提高被培養(yǎng)重組細胞培養(yǎng)穩(wěn)定 性、終細胞密度以及重組細胞靶蛋白產(chǎn)率的作用。WO 02/29084也在說明書實施例中提及可 以向培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基中添加大豆蛋白的水解產(chǎn)物。但是大豆水解產(chǎn)物中除了含有大豆蛋白外還含有許多其他成分，比如，大豆油、大 豆多糖、大豆皂甙等，因此在向無血清動物細胞培養(yǎng)基中添加大豆水解產(chǎn)物的同時，極有可 能加入上述其他成分即加入雜質(zhì)成分，從而不利于細胞的增殖和生長。此外，由于大豆蛋白 在不同水解條件下被水解程度不同，因而得到的大豆蛋白水解產(chǎn)物成分很難統(tǒng)一，會造成 培養(yǎng)基成分不確定，從而使被培養(yǎng)細胞的批次差異性大，且使被培養(yǎng)細胞的下游產(chǎn)品分離 困難。綜上，雖然現(xiàn)有技術已經(jīng)出現(xiàn)了使用添加大豆水解產(chǎn)物的無血清動物細胞培養(yǎng)基 的培養(yǎng)動物細胞的方法，但目前這類動物細胞培養(yǎng)方法仍然存在細胞培養(yǎng)密度低、分離細 胞下游產(chǎn)品成本高、被培養(yǎng)細胞的批次差異性大、安全性差的缺陷。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法存在細胞培養(yǎng)密度低、分 離細胞下游產(chǎn)品成本高、被培養(yǎng)細胞的批次差異性大、安全差的缺點，提供一種新的無血清 培養(yǎng)BHK21細胞的方法，該方法的細胞培養(yǎng)密度高、利于分離細胞下游產(chǎn)品、成本低、被培 養(yǎng)細胞的批次差異性小、安全性好。本發(fā)明的第二個目的是提供包括所述培養(yǎng)BHK21細胞的方法的制備狂犬病疫苗 的方法。本發(fā)明的第三個目的是提供包括所述培養(yǎng)BHK21細胞的方法的制備口蹄疫疫苗 的方法?，F(xiàn)有技術公開的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法揭示，向無血清細胞培養(yǎng)基中加入 除大豆水解蛋白外的其他蛋白效果不好，例如，在CN 1318577C的說明書第3-4頁明確記 載，“與現(xiàn)有技術已知的其它水解產(chǎn)物(例如小麥水解產(chǎn)物、水稻水解產(chǎn)物或酵母水解產(chǎn)物)相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅大豆水解產(chǎn)物介導按照本發(fā)明的特性，并且導致例如顯著提高重組 靶蛋白的得率。”在該文件的實施例7中揭示出小麥水解產(chǎn)物不如大豆蛋白水解產(chǎn)物效果 好。然而本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，向無血清基本培養(yǎng)基中以培養(yǎng)基溶劑的體積為 基準，加入100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蠶豆 蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0-200g/100L的小麥麩蛋白和50_100g/100L的水稻蛋 白，用于無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)敘利亞地鼠腎細胞(BHK21細胞)時，能夠達到的細胞培養(yǎng)密度 遠高于現(xiàn)有技術添加大豆水解產(chǎn)物或大豆蛋白水解產(chǎn)物的無血清培養(yǎng)方法所能達到的細 胞培養(yǎng)密度；由于添加的成分確定，一方面有利于分離細胞下游產(chǎn)品，使成本降低，另一方 面使被培養(yǎng)細胞的批次差異性大大減小，安全性更好。本發(fā)明提供了一種無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法，該方法包括將BHK21細胞接 種到細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，所述細胞培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基，并且以所述培養(yǎng)基溶劑 的體積為基準，所述培養(yǎng)基還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋 白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0_200g/100L的小麥麩蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。本發(fā)明還提供了一種制備疫苗的方法，所述方法包括培養(yǎng)作為病毒宿主的BHK21 細胞的步驟，其中，所述培養(yǎng)BHK21細胞的步驟按照本發(fā)明所述無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方 法進行。與現(xiàn)有的添加大豆水解產(chǎn)物或大豆蛋白水解產(chǎn)物的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的 方法相比，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法中還包括向無血清基本培養(yǎng)基中以培 養(yǎng)基溶劑的體積為基準，加入100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、 100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0_200g/100L的小麥麩蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。使用本發(fā)明的方法無血清培養(yǎng)BHK21細胞時，能夠達到的細胞 培養(yǎng)密度大大提高；由于添加的成分確定，一方面有利于分離細胞下游產(chǎn)品，使成本降低， 另一方面使被培養(yǎng)細胞的批次差異性大大減小，安全性更好。包括本發(fā)明的無血清培養(yǎng) BHK21細胞的方法的制備病毒疫苗的方法，大大提高了疫苗生產(chǎn)的效率。
圖1為使用本發(fā)明實施例1的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法培養(yǎng)72小時的BHK21 細胞的照片(放大300倍)；圖2為使用對比例1 (CN 1318577C)的無血清動物細胞培養(yǎng)方法(包括大豆水解 產(chǎn)物)培養(yǎng)72小時的BHK21細胞的照片(放大300倍)；圖3為使用對比例2 (W0 02/29084)的無血清動物細胞培養(yǎng)方法(包括大豆水解 產(chǎn)物)培養(yǎng)72小時的BHK21細胞的照片(放大300倍)；圖4為使用本發(fā)明實施例2的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法培養(yǎng)72小時的BHK21 細胞的照片(放大300倍)；圖5為使用實施例3的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法培養(yǎng)48小時的BHK21細胞 的照片(放大300倍)；圖6為使用實施例4的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法培養(yǎng)48小時的BHK21細胞的照片(放大200倍)；圖7為對比例1-2和實施例1-4隨培養(yǎng)時間變化的BHK21細胞密度對比圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法，該方法包括將BHK21細胞接 種到細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，所述細胞培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基，并且以所述培養(yǎng)基溶劑 的體積為基準，所述培養(yǎng)基還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋 白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0_200g/100L的小麥麩蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法，優(yōu)選其中以所述培養(yǎng)基溶劑的體 積為基準，所述培養(yǎng)基包括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋白、 150-180g/100L的蠶豆蛋白、50-80g/100L的馬鈴薯蛋白、150_180g/100L的小麥麩蛋白 和50-80g/100L的水稻蛋白；更優(yōu)選其中以所述培養(yǎng)基溶劑的體積為基準，所述培養(yǎng)基包 括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的豌豆蛋白、170_180g/100L的蠶豆蛋白、 50-60g/100L的馬鈴薯蛋白、150-160g/100L的小麥麩蛋白、50_60g/100L的水稻蛋白。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法中，所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、 馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水稻蛋白可以是商業(yè)上可供的商品，也可以是按照常規(guī)實驗手 段從相應植物種子或果實中分離出來的蛋白。蛋白質(zhì)的分離提純方法以及定性定量的檢 測方法為本領域技術人員公知，比如TCA-丙酮法(Mechin V，Damerval C, Zivy M. Total protein extraction with TCA-acetone. Methods MolBiol 2007 ;355 :1-8)、酸水解以及 酶水解法，優(yōu)選酶水解法。優(yōu)選本發(fā)明所述的大豆蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水 稻蛋白通過以下方法制備a)粉碎大豆、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、小麥麩或水稻植物原料至直徑為0. l-3mm3的顆 粒；b)在酶解時間為0. 5-10h、酶解PH值為5_9、酶解溫度為45°C -60°C、酶量為2_5 重量％的條件下酶解步驟a)所得的顆粒；其中，所述酶選自胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋 白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或幾種，所述酶的酶活> IX IO5單位/克；c)在80_100°C保持5-20min以終止步驟b)所述的酶解；d)將步驟c)所得的酶解產(chǎn)物在3000-8000rpm下離心5-20min，收集上清液；e)將步驟d)所得上清液用中空纖維過濾器超濾，所述過濾器所用膜的透過分子 量為10000-20000道爾頓；f)收集步驟e)所得超濾液，真空冷凍干燥，獲得相應植物蛋白。更優(yōu)選所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水稻蛋白 通過以下方法制備a)粉碎大豆、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、小麥麩或水稻植物原料至直徑為0. I-Imm3的顆 粒；b)在酶解時間為2-10h、酶解PH值為5-8、酶解溫度為45°C _60°C、酶量為2_5重 量％的條件下酶解步驟a)所得的顆粒；其中，所述酶選自胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或幾種，所述酶的酶活> IXlO5單位/克；c)在80_90°C保持5-lOmin以終止步驟b)所述的酶解；d)將步驟c)所得的酶解產(chǎn)物在3000-5000rpm下離心15-20min，收集上清液；e)將步驟d)所得上清液用中空纖維過濾器超濾，所述過濾器所用膜的透過分子 量為10000-20000道爾頓；f)收集步驟e)所得超濾液，真空冷凍干燥，獲得相應植物蛋白。更優(yōu)選地，根據(jù)不同的植物原料進行不同的前處理，例如，對于豆類原料(大豆、 豌豆和蠶豆)可以先脫脂前處理。不同的植物原料也可以采用不同的酶解條件，例如，在 溫度為52. 9°C、堿性蛋白酶(IO5單位/克)加酶量為5. 2%、pH為8. 7、底物濃度為8. 06 重量％以及提取時間為2小時的條件下制備小麥麩蛋白；或者在溫度為50°C、中性蛋白酶 (IO5單位/克)加酶量為4%、pH為6. 8、底物濃度為6. 5重量％以及提取時間為2. 5小時 的條件下制備小麥麩蛋白。馬鈴薯蛋白可以通過以下方法制得清洗去皮馬鈴薯原料與等 體積亞硫酸鈉溶液勻漿，固液分離(離心、靜置或榨汁)，收集所得馬鈴薯汁在pH為3. 0 下靜置5h，離心收集沉淀，噴霧干燥得粉末。收集所述粉末加緩沖液，在溫度為50°C、胰蛋 白酶加酶量(IO5單位/克)為4%、pH為8.0、底物濃度為20重量％ (IO5單位/克)以及 提取時間為1. 5小時的條件下制備馬鈴薯蛋白。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法，其所使用的基本培養(yǎng)基是本領域常用 的各種基本培養(yǎng)基，例如，選自BME細胞培養(yǎng)基、DMEM細胞培養(yǎng)基、DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、 Fischer' s細胞培養(yǎng)基、IMDM細胞培養(yǎng)基、199細胞培養(yǎng)基、MEM細胞培養(yǎng)基、FlO細胞培 養(yǎng)基、F12細胞培養(yǎng)基和1640細胞培養(yǎng)基中的一種或幾種。優(yōu)選包括的所述基本培養(yǎng)基為 重量比1 1的F12細胞培養(yǎng)基和DMEM細胞培養(yǎng)基。所述基本培養(yǎng)基的成分為本領域公 知，上述列舉的基本培養(yǎng)基名稱為它們的商品名，商業(yè)上可供。更優(yōu)選本發(fā)明無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法所使用的培養(yǎng)基中，以所述培養(yǎng)基溶 劑的體積為基準，所述培養(yǎng)基包括下表1所示的組分表 權利要求
1.一種無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法，該方法包括將BHK21細胞接種到細胞培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基，并且以所述培養(yǎng)基溶劑的體 積為基準，所述培養(yǎng)基還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、 100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0_200g/100L的小麥麩蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，以所述培養(yǎng)基溶劑的體積為基準，所述培養(yǎng)基包 括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋白、150_180g/100L的蠶豆蛋白、 50-80g/100L的馬鈴薯蛋白、150-180g/100L的小麥麩蛋白和50_80g/100L的水稻蛋白。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，以所述培養(yǎng)基溶劑的體積為基準，所述培養(yǎng)基包 括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的豌豆蛋白、170_180g/100L的蠶豆蛋白、 50-60g/100L的馬鈴薯蛋白、150-160g/100L的小麥麩蛋白、50_60g/100L的水稻蛋白。
4.根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的無血清動物細胞培養(yǎng)基干粉，其中，所述大豆 蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水稻蛋白通過以下方法制備a)粉碎大豆、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、小麥麩或水稻植物原料至直徑為0.l-3mm3的顆粒；b)在酶解時間為0.5-10h、酶解PH值為5-9、酶解溫度為45°C -60°C、酶量為2_5重 量％的條件下酶解步驟a)所得的顆粒；其中，所述酶選自胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白 酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或幾種，所述酶的酶活> IX IO5單位/克；c)在80-100°C保持5-20min以終止步驟b)所述的酶解；d)將步驟c)所得的酶解產(chǎn)物在3000-8000rpm下離心5-20min，收集上清液；e)將步驟d)所得上清液用中空纖維過濾器超濾，所述過濾器所用膜的透過分子量為 10000-20000 道爾頓；f)收集步驟e)所得超濾液，真空冷凍干燥，獲得相應植物蛋白。
5.根據(jù)權利要求4所述的無血清動物細胞培養(yǎng)基干粉，其中，所述大豆蛋白、豌豆蛋 白、蠶豆蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水稻蛋白通過以下方法制備a)粉碎大豆、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、小麥麩或水稻植物原料至直徑為0.I-Imm3的顆粒；b)在酶解時間為2-10h、酶解PH值為5-8、酶解溫度為45°C_60°C、酶量為2_5重量％ 的條件下酶解步驟a)所得的顆粒；其中，所述酶選自胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或幾種，所述酶的酶活> IXlO5單位/克；c)在80-90°C保持5-lOmin以終止步驟b)所述的酶解；d)將步驟c)所得的酶解產(chǎn)物在3000-5000rpm下離心15-20min，收集上清液；e)將步驟d)所得上清液用中空纖維過濾器超濾，所述過濾器所用膜的透過分子量為 10000-20000 道爾頓；f)收集步驟e)所得超濾液，真空冷凍干燥，獲得相應植物蛋白。
6.根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述基本培養(yǎng)基選自BME細胞培 養(yǎng)基、DMEM細胞培養(yǎng)基、DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、Fischer ‘ s細胞培養(yǎng)基、IMDM細胞培養(yǎng)基、 199細胞培養(yǎng)基、MEM細胞培養(yǎng)基、FlO細胞培養(yǎng)基、F12細胞培養(yǎng)基和1640細胞培養(yǎng)基中 的一種或幾種。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，以所述培養(yǎng)基溶劑的體積為基準，所述培養(yǎng)基包 括下表1所示的組分
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，以所述培養(yǎng)基溶劑的體積為基準，所述培養(yǎng)基包括0. l-lg/100L的次黃嘌呤和/或0. l-2g/100L的酚紅。
9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，以所述培養(yǎng)基溶劑的體積為基準，所述培養(yǎng)基包括下表2所示的組分 表2
10. 一種制備疫苗的方法，所述方法包括培養(yǎng)作為病毒宿主的BHK21細胞的步驟，其特 征在于，所述培養(yǎng)BHK21細胞的步驟按照權利要求1-9中任意一項所述的無血清培養(yǎng)BHK21 細胞的方法進行。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，所述疫苗為狂犬病疫苗，所述方法包括培養(yǎng)作為狂 犬病病毒宿主的BHK21細胞的步驟，其特征在于，所述培養(yǎng)BHK21細胞的步驟按照權利狂犬 病疫苗要求1-9中任意一項所述的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法進行。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，所述疫苗為口蹄疫疫苗，所述方法包括培養(yǎng)作為口 蹄疫病毒宿主的BHK21細胞的步驟，其特征在于，所述培養(yǎng)BHK21細胞的步驟按照權利要求 1-9中任意一項所述的無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法進行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種無血清培養(yǎng)BHK21細胞的方法，該方法包括將BHK21細胞接種到細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，所述細胞培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基，并且以所述培養(yǎng)基溶劑的體積為基準，所述培養(yǎng)基還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0-200g/100L的小麥麩蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。此外，本發(fā)明還提供了包括所述培養(yǎng)BHK21細胞的方法的制備疫苗(例如狂犬病疫苗和口蹄疫疫苗)的方法。由于本發(fā)明的方法使用了含有植物蛋白的培養(yǎng)基來培養(yǎng)BHK21細胞，本發(fā)明的方法所得BHK21細胞培養(yǎng)密度高、利于分離細胞下游產(chǎn)品、被培養(yǎng)細胞的批次差異性小、安全性好，適于用作生產(chǎn)疫苗等生物制品的病毒宿主、表達載體等。
文檔編號A61K39/205GK102115729SQ20091026598
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權日2009年12月31日
發(fā)明者張韌, 王建超, 陳文慶 申請人:北京清大天一科技有限公司