專利名稱：一種水稻庫源新基因(ss1)的緊密連鎖分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制水稻庫源新基因SSl的緊密連鎖分子標(biāo)記，屬于水稻超高產(chǎn)育種和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，適用于在水稻高產(chǎn)育種中引入新的產(chǎn)量相關(guān)基因SS1，并利用緊密連鎖分子標(biāo)記對該基因進(jìn)行水稻庫源相關(guān)性狀的輔助選擇育種。
背景技術(shù)：
水稻產(chǎn)量的高低主要取決于源、庫、流三者的強(qiáng)弱及其相互間的協(xié)調(diào)程度，其中穗部性狀特別是每穗總粒數(shù)是光合產(chǎn)物積累的主要庫性狀，倒三葉尤其是劍葉大小是光合產(chǎn)物生產(chǎn)的主要源性狀，穗莖中的大維管束數(shù)量通常被作為從葉片向穗部輸送同化物的一個 “流”性狀。劍葉是穗部最重要的同化產(chǎn)物來源，其大小與每穗粒數(shù)、小穗育性、高容重籽粒、 千粒重及籽粒產(chǎn)量密切相關(guān)。在不同條件下，源、庫、流三者之一都有可能成為作物產(chǎn)量的限制因素，因而單方面強(qiáng)調(diào)源或庫對產(chǎn)量的重要性都是不全面的。要獲得高產(chǎn)，不僅源、庫要協(xié)調(diào)，還要考慮到流(運(yùn)轉(zhuǎn))的協(xié)調(diào)，即源要足、庫要大和運(yùn)轉(zhuǎn)通暢。由此可見，源、庫、流三者之間是相互促進(jìn)、相互影響、相互制約的關(guān)系。目前一般采用源/庫、源/流和流/庫 “三比”來評價源、庫、流三者間的平衡關(guān)系，進(jìn)而分析“三比”變化對水稻產(chǎn)量及生理的影響，從而找出水稻高產(chǎn)所需的最佳“三比”值。盡管人們已經(jīng)認(rèn)識到充足而且彼此協(xié)調(diào)的庫源關(guān)系是水稻高產(chǎn)理想株型和超高產(chǎn)育種的重要目標(biāo)，但至今對庫源性狀的遺傳特別是兩者間的分子調(diào)控機(jī)制還缺少研究。因此，鑒定影響庫源性狀的重要基因，通過分子標(biāo)記輔助選擇培育庫源協(xié)調(diào)的高產(chǎn)品種進(jìn)而解析庫源性狀調(diào)控的分子機(jī)制，意義重大。數(shù)量性狀基因座(QTL)定位的應(yīng)用極大的促進(jìn)了對包括產(chǎn)量在內(nèi)的許多重要復(fù)雜性狀遺傳機(jī)理的認(rèn)識。鑒定影響庫、源和流及產(chǎn)量性狀的QTL有助于增加對這些復(fù)雜性狀相互關(guān)系的理解，從而達(dá)到通過遺傳操縱改良這些性狀并最終提高產(chǎn)量的目的。Cui等 (2003)利用珍汕97與明恢63的重組自交系群體，定位了劍葉、倒二葉和倒三葉(源性狀)、 每穗總粒數(shù)(庫性狀)、莖中大維管束數(shù)量(流性狀)及三者衍生的比例性狀與籽粒產(chǎn)量及產(chǎn)量相關(guān)性狀(結(jié)實率和千粒重)的QTL，在定位影響庫-源-流的25個主效QTL中，其中有8個與影響產(chǎn)量性狀的QTL定位在相同或相近的區(qū)域，認(rèn)為一因多效或緊密連鎖是籽粒產(chǎn)量與庫、源、流之間相關(guān)的遺傳基礎(chǔ)。Li等(1998)在美國德州生態(tài)條件下種植Lemont/特青的早世代(F4)重組自交系群體，研究了水稻劍葉和倒二葉與庫容量之間的遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)作為主要庫容量的每穗粒重有50%的變異是由劍葉大小引起，并利用分子標(biāo)記鑒定出位于第4染色體RG143-RG214區(qū)間同時影響庫性狀(每穗粒數(shù)和每穗粒重)和源(劍葉和倒二葉的葉面積和葉寬)性狀的1個主效QTL(QLw4)，分別解釋劍葉葉寬、倒二葉葉寬和每穗粒數(shù)表型變異的20%、19%和16%，是一個影響庫源性狀的重要主效QTL。該基因座上來自 Lemont的等位基因能夠在增加葉寬和葉面積的同時增加每穗粒數(shù)和穗粒重，一因多效是該基因控制庫源性狀的遺傳基礎(chǔ)。Xu等Q004)在菲律賓熱帶條件下種植Lemont/特青的高世代(F13)重組自交系群體，在第4染色體的RM317-RM255區(qū)間檢測到影響每穗粒數(shù)的主效 QTL，其增加每穗粒數(shù)的等位基因也同樣來自Lemont。經(jīng)比較作圖分析發(fā)現(xiàn)，與該QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記RM255正好落在RG143-RG214區(qū)間。因此，推斷該QTL與Li等(1998)定位到影響庫源性狀的QLw4很可能是同一個位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，申請人又進(jìn)一步利用Lemont/ 特青的雙向回交導(dǎo)入系群體，分別在北京和海南的種植條件下檢測到影響每穗粒數(shù)和劍葉寬度的主效QTL(所在區(qū)間為RM317-RM255)，該位點(diǎn)上增加葉寬和每穗粒數(shù)的等位基因都來自親本Lemont。由此證明RM317-RM255區(qū)間確實存在一個在不同的生態(tài)條件下穩(wěn)定表達(dá)的影響庫源性狀的基因，暫且將該基因命名為SSl (Source-sink 1)。水稻庫源性狀是水稻產(chǎn)量形成的農(nóng)學(xué)基礎(chǔ)。庫源相關(guān)性狀(如劍葉長、寬及葉面積，每穗粒數(shù)及粒重)的QTL定位研究表明，影響水稻庫源相關(guān)性狀的QTL(基因位點(diǎn))大致分成3種類型，一是同時控制葉片源性狀和穗部庫性狀，二是只控制葉片源性狀，三是只控制穗部庫性狀。在這3種類型中，只有第一種基因，對水稻庫源協(xié)調(diào)起關(guān)鍵作用，是通過庫源協(xié)調(diào)培育超高產(chǎn)品種的重要遺傳基礎(chǔ)。雖然通過常規(guī)的表型鑒定，可以對葉片寬窄和葉片大小等源性狀進(jìn)行選擇，但是卻無法對不同類型的庫源相關(guān)基因位點(diǎn)加以區(qū)別利用；只有通過分子標(biāo)記的方法，對于同時控制庫性狀和源性狀的基因位點(diǎn)進(jìn)行有針對性的選擇， 才能實現(xiàn)庫源協(xié)調(diào)超高產(chǎn)品種的高效選育。因此，鑒定和精細(xì)定位水稻庫源性狀的重要基因，尋找與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，對于通過標(biāo)記輔助選擇技術(shù)培育水稻超高產(chǎn)新品種具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
(一)技術(shù)問題本發(fā)明針對上述研究背景，從特青背景的高代回交導(dǎo)入系中選擇出帶有影響源 (劍葉葉寬)、庫(每穗粒數(shù))性狀SSl基因的回交導(dǎo)入系GG253，其輪回親本背景恢復(fù)率為98. 9%，進(jìn)一步以特青作為輪回親本與GG253進(jìn)行2次回交，通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法篩選到目標(biāo)區(qū)段為SSl基因雜合導(dǎo)入、背景完全恢復(fù)為輪回親本特青的近等基因系， 利用該近等基因系所構(gòu)建的F2次級分離群體為試材，篩選目標(biāo)染色體區(qū)段的交換單株，從而構(gòu)建了一套亞區(qū)間的跨疊系，并結(jié)合表現(xiàn)型對目標(biāo)基因進(jìn)行高精確度的連鎖分析，將SSl 基因精細(xì)定位到一個^lA的區(qū)間內(nèi)；獲得與之緊密連鎖的基于PCR的分子標(biāo)記FL41，借助該標(biāo)記可以有效篩選到帶有SSl基因的寬劍葉且每穗粒數(shù)多的庫源充足且協(xié)調(diào)的水稻新品種(系)，主要應(yīng)用于培育水稻超產(chǎn)新品種。( 二 )技術(shù)方案控制水稻庫源新基因緊密連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于用一對特異擴(kuò)增水稻位于第4染色體上控制水稻庫源新基因(SSl)的緊密連鎖分子標(biāo)記的引物FL41，其中正向引物序列為AAACCCTGGCATTACATT ；反向引物序列為 CATAGACATAAGAACCCT，共同擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)段為雜合導(dǎo)入的近等基因系(攜帶有一個包含SSl 的551Λ雜合片段)自交所衍生的F2分離群體中各單株的基因組DNA，然后用Ddel限制性內(nèi)切酶37°C酶切2小時，電泳分離出2種分子量大小的片段，其中與Lemont親本相同片段的分子量大小為171bp，與特青相同片段的分子量大小為IMbp (

圖1)。如果FL41的引物擴(kuò)增后酶切獲得與親本Lemont大小相同或者雜合片段的單株，那么這些單株帶有SSl高產(chǎn)等位基因，表現(xiàn)型表現(xiàn)為劍葉增寬且穗粒數(shù)增多，反之，則不帶有SSl高產(chǎn)等位基因，表現(xiàn)劍葉較窄且穗粒數(shù)較少。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施實例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。其中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。(一 )控制水稻庫源新基因的初步定位1.供試材料以美國南部的優(yōu)質(zhì)粳稻品種Lemont和我國廣東的高產(chǎn)秈稻品種特青所構(gòu)建的雙向回交導(dǎo)入系為主要研究材料。其構(gòu)建過程如下將Lemont與特青配制雜種FnF1植株分別與雙親回交，分別形成Lemont和特青背景的雙向回交BC1F1群體，在雙向回交后代隨機(jī)選單株分別與各自的輪回親本進(jìn)行2-4次不等的連續(xù)回交并經(jīng)自交多代穩(wěn)定，最后分別獲得了 201個Lemont背景導(dǎo)入系(LT-ILs)和252個特青背景的導(dǎo)入系(TQ-ILs)。另一套材料是來自同一個雜交組合(Lemont/特青)的294個高世代重組自交系(RILs)。2. DNA提取、PCR擴(kuò)增及凝膠電泳參考TemnyW1等(2000年)的DNA提取方法，對各株系的代表單株分別混合提取基因組DNA。根據(jù)參考圖譜，選取均勻分布于全基因組的142個SSR標(biāo)記，合成引物。以各個株系的基因組DNA為模板進(jìn)行，聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，genefinder染色后，在凝膠成像系統(tǒng)下成像。參考雙親的擴(kuò)增條帶，對后代株系的帶型進(jìn)行判別記錄。3.完備區(qū)間作圖分析根據(jù)后代株系的擴(kuò)增條帶所表示的基因型，將其對應(yīng)的庫(每穗粒數(shù))和源(劍葉寬度)相關(guān)性狀調(diào)查的結(jié)果作為表型值，輸入由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所王建康課題組所發(fā)展的完備區(qū)間作圖軟件(ICIMapping V3. 0，免費(fèi)軟件)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得與水稻庫源相關(guān)的候選區(qū)間及相關(guān)標(biāo)記。我們鑒定出1個在不同遺傳背景下(特青背景導(dǎo)入系、Lemont背景導(dǎo)入系和重組自交系)不同環(huán)境下(北京和海南)均能穩(wěn)定表達(dá)的同時影響庫源性狀的主效QTL(表1)， 即位于第4染色RM255標(biāo)記附近同時影響每穗粒數(shù)(庫性狀)和劍葉葉寬(源性狀)的主效QTL(SSl)，該基因座上來自Lemont的等位基因增加劍葉葉寬的同時增加每穗粒數(shù)，一因多效是控制該庫源性狀的遺傳基礎(chǔ)。表1利用四2個Lemont/特青重組自交系(RILs)、2M個特青背景導(dǎo)入系(TQ-ILs) 和201個Lemont背景導(dǎo)入系(LT-ILs)定位影響劍葉葉寬(FLW，厘米)和每穗粒數(shù)(SNP， 粒/穗)的主效QTL
權(quán)利要求
1.水稻庫源新基因(SSl)緊密連鎖分子標(biāo)記方法，其特征在于以雜合近等基因系構(gòu)建的F2次級分離群體為試材，篩選目標(biāo)染色體區(qū)段的交換單株，從而構(gòu)建了一套覆蓋目標(biāo)區(qū)段的跨疊系，結(jié)合表現(xiàn)型對目標(biāo)基因進(jìn)行高精確度的連鎖分析，最終將SSl基因精細(xì)定位到55Kb的區(qū)間內(nèi)，獲得與庫源新基因(SSl)緊密連鎖的CAPS分子標(biāo)記FL41。
2.按照權(quán)利1所獲得一種與水稻庫源新基因(SSl)緊密連鎖分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于以寬葉品種Lemont導(dǎo)入窄葉品種特青培育的雜合近等基因系的后代分離群體為對象，通過FL41標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，預(yù)測其由SSl等位基因所控制的水稻庫(每穗粒數(shù))源(劍葉葉寬)相關(guān)性狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水稻庫源新基因SS1的分子標(biāo)記方法，屬于水稻超高產(chǎn)育種和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明實質(zhì)是根據(jù)連鎖分離規(guī)律，利用攜帶SS1雜合片段的近等基因系自交所構(gòu)建的F2次級分離群體為試材，構(gòu)建一套目標(biāo)區(qū)段的跨疊系，結(jié)合表現(xiàn)型對目標(biāo)基因進(jìn)行高精確度的連鎖分析，經(jīng)過兩年兩點(diǎn)的重復(fù)鑒定，最終將SS1精細(xì)定位到第4染色體上55Kb的區(qū)間內(nèi)，并獲得了與之緊密連鎖的基于PCR的分子標(biāo)記FL41。將本發(fā)明應(yīng)用于水稻超高產(chǎn)育種，能夠快速準(zhǔn)確的鑒定出同時影響庫(每穗粒數(shù))源(劍葉葉寬和葉面積)性狀的基因型個體，進(jìn)行育種材料的早世代選擇，大大加速水稻超高產(chǎn)分子育種的進(jìn)程。
文檔編號C12N15/10GK102304513SQ20111025364
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者孫勇, 徐建龍, 王韻, 趙秀琴, 鄭天清, 黎志康 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所