專利名稱：高效表達(dá)人pkm1蛋白的dld1穩(wěn)定細(xì)胞株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)人丙酮酸激酶PKMl蛋白的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞即使在有氧存在的情況下，也主要通過糖酵解而不是氧化磷酸化進(jìn)行代謝，同時(shí)伴有葡萄糖消耗和乳酸生成率的升高。這一糖代謝異常現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)。糖酵解作為腫瘤細(xì)胞的主要產(chǎn)能方式，在腫瘤細(xì)胞生存、增殖中起到重要作用。為什么腫瘤細(xì)胞產(chǎn)能方式會(huì)發(fā)生改變呢？雖然該過程并完未被完全理解，但目前認(rèn)為丙酮酸激酶在腫瘤細(xì)胞能量代謝改變過程中發(fā)揮重要作用。丙酮酸激酶是糖酵解途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶。在哺乳細(xì)胞株中，丙酮酸激酶存在PKMl、PKM2、PKL和PKR四種同工酶，它們只在特定的組織中表達(dá)。PKL和PKR由基因PKL編碼，分別表達(dá)于肝細(xì)胞和紅細(xì)胞中。PKMl和PKM2是PKM基因選擇性剪切的產(chǎn)物，兩者都由531個(gè)氨基酸組成，其中23個(gè)氨基酸存在差異，這導(dǎo)致它們酶學(xué)特征完全不同。其中PKMl在于腦與骨骼肌中表達(dá)，保留了外顯子9，它的丙酮酸激酶活性比PKM2要高，不能被磷酸化和被別構(gòu)調(diào)控；PKM2在胚胎組織和腫瘤組織中表達(dá)，保留了外顯子10。Christofk等在Nature上的報(bào)道發(fā)現(xiàn)用PKMl取代腫瘤細(xì)胞中的PKM2會(huì)降低糖酵解速率，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明PKMl取代PKM2會(huì)降低成瘤率和瘤塊大小。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路激活與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。結(jié)腸癌DLDl細(xì)胞的fct信號(hào)處于活化狀態(tài)，有助于DLDl細(xì)胞適應(yīng)腫瘤微環(huán)境和生存。然而PKMl在結(jié)腸癌Wnt/i3-catenin信號(hào)中的作用機(jī)制未見報(bào)道。目前，文獻(xiàn)報(bào)道PKMl功能研究主要采用表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，其缺點(diǎn)是PKMl的表達(dá)不穩(wěn)定、不持久。然而，慢病毒表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)染效率高，用量少，能特異、持續(xù)、高效、穩(wěn)定促進(jìn)目的基因表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中尚無持續(xù)、高效表達(dá)PKMl基因的結(jié)腸癌DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株。本發(fā)明通過慢病毒轉(zhuǎn)染得到的穩(wěn)定細(xì)胞株，為研究結(jié)腸癌fct信號(hào)通路與腫瘤能量代謝提供有力工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效表達(dá)人PKMl蛋白的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株及其構(gòu)建方法，該細(xì)胞株可用于研究結(jié)腸癌fct信號(hào)通路與腫瘤能量代謝提供有力工具。本發(fā)明提供的一種高效表達(dá)人PKMl蛋白的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟:I)利用基因重組技術(shù)將人PKMl基因克隆入慢病毒表達(dá)載體pLVX-AcGFPl-Nl中，構(gòu)建成pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定；2)在IOcm的培養(yǎng)皿中鋪1.4X IO6個(gè)293T細(xì)胞，加入IOmL含10%胎牛血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5%C02培養(yǎng)細(xì)胞使匯合度達(dá)到80% ；3)在無菌 EP 管中將載體 pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl、psPAX2、pMD2.G 以質(zhì)量比為 4:3:1且總體積不超過120ul混合，按磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；48h后收集293T細(xì)胞的上清，在IOOkD濃縮管中2000r/min離心lOmin，除去細(xì)胞碎片，得到病毒濃縮液，于一 80°C長(zhǎng)期保存；4)在6孔板中培養(yǎng)DLDl細(xì)胞，用含10%胎牛血清不含任何抗生素的RPM1-1640培養(yǎng)基，37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞匯合度達(dá)到80% ;然后換含8μ g/ml polybrene的RPM1-1640培養(yǎng)基，加入IOOul步驟3)得到的病毒濃縮液，轉(zhuǎn)染48h后，加入終濃度5 μ g/mL的puromycin進(jìn)行加藥篩選；每3天更換一次含5 μ g/mL puromycin的RPM1-1640培養(yǎng)基，篩選4周后在顯微鏡下挑取陽性細(xì)胞簇，再用有限稀釋法把陽性細(xì)胞簇在96孔板中篩選；5)通過RT-PCR鑒定陽性細(xì)胞簇、擴(kuò)大培養(yǎng)，收獲蛋白再用Western blot進(jìn)行鑒定，最終獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，將其凍于液氮中保藏。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過慢病毒轉(zhuǎn)染得到的穩(wěn)定細(xì)胞株，具有轉(zhuǎn)染效率高，用量少，能特異、持續(xù)、高效、促進(jìn)PKMl穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為研究結(jié)腸癌fct信號(hào)通路與腫瘤能量代謝提供有力工具。


圖1:pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl重組質(zhì)粒的酶切圖(其中泳道I是重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切)圖2:pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定3:高效表達(dá)人PKMl基因的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株在Delta vision下(20X)的細(xì)胞熒光鑒定圖

圖4:高效表達(dá)人PKMl基因的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株RT-PCR鑒定5:高效表達(dá)人PKMl基因的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株Western blot鑒定圖。泳道I為對(duì)照，泳道2為穩(wěn)定細(xì)胞株，抗體為GFP
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、重組人丙酮酸激酶PKMl基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)PKMl基因的編碼序列(GenBank NM_182471.2)設(shè)計(jì)兩端帶有BamHI和Xho I 酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的特異引物:5 ’ -CCGCTCGAGGCCACCATGTCGAAGCCCCATAGTGAAG-3’ 和 5’ -CGCGGATCCCGCGGCACAGGAACAACACG-3’，從人結(jié)腸細(xì)胞 NCM460 的 cDNA 中擴(kuò)增PKMl基因。BamHI和XhoI雙酶切、膠回收目的基因片段，與同樣BamHI和XhoI雙酶切的pLVX-AcGFPl-Nl載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl，通過雙酶切鑒定(見圖1)及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒(見圖2)。2、DLDl細(xì)胞和293T細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代細(xì)胞來源于山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，復(fù)蘇好的DLDl細(xì)胞置于IOcm培養(yǎng)皿，在含10% (V/V)的胎牛血清及不添加任何抗生素的RPM1-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用0.lmg/mL的多聚賴氨酸鋪被IOcm培養(yǎng)皿5min，將其吸除，干燥培養(yǎng)皿，復(fù)蘇好的293T細(xì)胞置于該培養(yǎng)皿中。293T細(xì)胞在含10% (V/V)的胎牛血清，不添加任何抗生素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%傳代，用PBS洗2次，加入ImL的0.25%胰酶消化，分別加入相應(yīng)的含10%胎牛血清的RPM1-1640、DMEM終止消化，按1:3分裝于3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。3、293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染、慢病毒包裝和收獲1)轉(zhuǎn)染第一天，在IOcm培養(yǎng)皿中鋪1.4X IO6個(gè)293Τ細(xì)胞，過夜培養(yǎng)使得次日細(xì)胞匯合度達(dá)到80%。2)轉(zhuǎn)染第二天，在3個(gè)無菌EP管分別以質(zhì)量比為4:3:1且總體積不超過120ul混合質(zhì)粒 pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl (以 pLVX-AcGFPl-Nl 為對(duì)照)、psPAX2、pMD2.G，加入到 600ulCaCl2溶液中輕柔混勻。將混合液加入至600ul BBS溶液中(碧云天公司)，輕柔混勻，室溫放置20min。將混合液加入IOcm培養(yǎng)皿的293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕柔混勻，37°C、5%C02培養(yǎng)12h，倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36h。4)轉(zhuǎn)染第四天，收集293T細(xì)胞上清液。將上清液置于IOOkD濃縮管中2000r/min離心lOmin，除去細(xì)胞碎片，至500ul的病毒濃縮體積，將病毒濃縮液按IOOul分裝于一80°C長(zhǎng)期保存。4、DLDl細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選I)轉(zhuǎn)染第一天，在6孔板中鋪I X IO6個(gè)DLDl細(xì)胞，夜培養(yǎng)使得次日細(xì)胞匯合度達(dá)到 80%ο2)轉(zhuǎn)染第二天，將培養(yǎng)基換成無血清、無抗生素且polybrene終濃度為8 μ g/ml的RPM1-1640培養(yǎng)基，加入100μ I用pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl包裝的病毒濃縮液(以pLVX-AcGFPl-Nl病毒濃縮液為對(duì)照)輕柔混勻。37°C、5%C02培養(yǎng)48h。3)轉(zhuǎn)染第四天，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(見圖3)，換含10%胎牛血清的RPM1-1640 培養(yǎng)基,加 5 μ g/mL puromycin 篩選。每 3 天更換一次含 puromycin (5 μ g/mL)的培養(yǎng)液，篩選4周左右，6孔板中可見陽性細(xì)胞簇。4)在顯微鏡下挑取陽性細(xì)胞簇，再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。在熒光顯微鏡下觀察單克隆形成的情況，對(duì)熒光強(qiáng)度較高的陽性克隆孔，擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過RT-PCR進(jìn)行鑒定。對(duì)于經(jīng)RT-PCR鑒定陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取蛋白進(jìn)行western blot鑒定，最終獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，并凍存于液氮中。5、高效表達(dá)人PKMl蛋白的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株的鑒定I)根據(jù)人丙酮酸激酶PKMl基因的外顯子9，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物F:5 ‘-GAAGAACTTGTGCGAGCCT-3’ 和 R:5 ‘-CGTCAGAACTATCAAAGCTGC-3’。以這兩種穩(wěn)定細(xì)胞株的mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，通過RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)變化(見圖4)，反應(yīng)條件為95°C, 30s ；(95°C /5s,60°C 34s) 40 個(gè)循環(huán)；添加熔解曲線。2)提取兩種穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞總蛋白，western blot檢測(cè)細(xì)胞PKMl的蛋白水平(見圖5)。
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)人PKMl蛋白的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)利用基因重組技術(shù)將人PKMl基因克隆入慢病毒表達(dá)載體pLVX-AcGFPl-Nl中，構(gòu)建成pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定； 2)在IOcm的培養(yǎng)皿中鋪1.4父106個(gè)2931'細(xì)胞，加入IOmL含10%胎牛血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5%C02培養(yǎng)細(xì)胞使匯合度達(dá)到80% ； 3)在無菌EP 管中將載體 pLVX-AcGFP1-Nl-PKMl、psPAX2、pMD2.G 以質(zhì)量比為 4:3:1且總體積不超過120ul混合，按磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；48h后收集293T細(xì)胞的上清，在IOOkD濃縮管中2000r/min離心lOmin，除去細(xì)胞碎片，得到病毒濃縮液，于一 80°C長(zhǎng)期保存； 4)在6孔板中培養(yǎng)DLDl細(xì)胞，用含10%胎牛血清不含任何抗生素的RPM1-1640培養(yǎng)基，37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞匯合度達(dá)到80% ;然后換含8 μ g/ml polybrene的RPM1-1640培養(yǎng)基，加入IOOul步驟3)得到的病毒濃縮液，轉(zhuǎn)染48h后，加入終濃度5 μ g/mL的puromycin進(jìn)行加藥篩選；每3天更換一次含5 μ g/mL puromycin的RPM1-1640培養(yǎng)基，篩選4周后在顯微鏡下挑取陽性細(xì)胞簇，再用有限稀釋法把陽性細(xì)胞簇在96孔板中篩選; 5)通過RT-PCR鑒定陽性細(xì)胞簇、擴(kuò)大培養(yǎng)，收獲蛋白再用Westernblot進(jìn)行鑒定，最終獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，將其凍于液氮中保藏。
2.如權(quán)利要 求1所述構(gòu)建方法獲得的高效表達(dá)人PKMl蛋白的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)人PKM1蛋白的DLD1穩(wěn)定細(xì)胞株及其構(gòu)建方法，屬于動(dòng)物細(xì)胞株領(lǐng)域。該細(xì)胞株的建立方法是構(gòu)建重組人PKM1基因慢病毒表達(dá)載體，慢病毒包裝、收獲，轉(zhuǎn)染DLD1細(xì)胞，經(jīng)puromycin篩選、RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)，得到穩(wěn)定細(xì)胞株。依照該方法建立的穩(wěn)定細(xì)胞株為研究結(jié)腸癌Wnt信號(hào)通路與腫瘤能量代謝提供了有力的工具。
文檔編號(hào)C12N15/54GK103160469SQ20131008801
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者楊鵬, 李卓玉, 李宗偉, 付榮, 李漢卿 申請(qǐng)人:山西大學(xué)