專利名稱：一種將胞內(nèi)蛋白基質(zhì)表達的方法和其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種將胞內(nèi)蛋白基質(zhì)表達的方法和其應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
根據(jù)定位方式，基因工程表達外源蛋白一般分為兩種形式胞內(nèi)表達，目的蛋白在細胞質(zhì)核糖體中合成后，在一系列伴侶因子幫助下仍定位于胞內(nèi)；胞外表達，目的蛋白合成后借助蛋白本身的功能序列和宿主菌的加工運輸體系分泌至胞外。胞外分泌型表達可大大簡化下游純化過程，節(jié)約成本，因此在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中具有絕對優(yōu)勢。大腸桿菌(Escherichia coli)遺傳背景清楚,培養(yǎng)周期短,操作簡單,是目前應用最廣泛、最成功的外源重組蛋白表達系統(tǒng)。大腸桿菌天然存在5種分泌途徑，各種分泌途徑均有其特定的轉運蛋白和分泌機制，且對重組蛋白均有獨特的要求，一般來講，只有在天然狀態(tài)下為胞外酶在重組表達時才有可能實現(xiàn)基質(zhì)分泌型表達，而未見胞內(nèi)蛋白通過宿主菌的分泌系統(tǒng)轉運至細胞外的報道。大腸桿菌的細胞膜有兩層，內(nèi)膜由磷脂和膜蛋白組成，其中磷脂包括 70-80 % 的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine)，15-20 % 的磷脂酰甘油 (phosphatidylglycerol)和低于5%的心磷脂(cardiolipin),外膜內(nèi)側富含飽和脂肪酸和磷脂酰乙醇胺，外側主要為脂多糖。人為地增大細胞膜的通透性，可以加快胞內(nèi)產(chǎn)物的排出速率，以利于目標蛋白在培養(yǎng)基中的積累。對細胞膜通透性進行調(diào)控的方法很多，從遺傳學的角度來看，可以選育出細胞膜通透性突變株；從后期調(diào)控角度看，根據(jù)物質(zhì)跨膜轉運機制的不同，可以采取相應的方法。目前應用較為廣泛的是化學法，在培養(yǎng)基中添加諸如青霉素、Mn2+、表面活性劑、Na+、甘露醇等，可在一定程度上破壞細胞膜的完整性，提高發(fā)酵產(chǎn)量。角質(zhì)酶是一種多功能酶，可水解各種可溶性酯類、乳化的甘油三酯、不溶性脂肪酸酯、不溶性多聚體角質(zhì)等，目前已有報道來源于F. solani的角質(zhì)酶具有磷脂酰乙醇胺(大腸桿菌內(nèi)膜磷脂的主要成分，外膜的組成部分)的水解活性。因此可通過角質(zhì)酶對大腸桿菌細胞膜磷脂成分的水解作用提高細胞膜的通透性來使胞內(nèi)目標蛋白基質(zhì)表達。本發(fā)明選取兩種重要的工業(yè)用酶半乳糖苷酶和異淀粉酶作為報告蛋白。 β-半乳糖苷酶是一種多功能酶，能作用于乳糖的β (I —4)糖苷鍵，形成半乳糖基-酶復合物，在該酶的水解活性下，復合物進一步水解，生成半乳糖；而在該酶的轉苷活力作用下， 復合物進一步與單糖、二糖或三糖等結合，生成低聚半乳糖。β -半乳糖苷酶是工業(yè)酶法生產(chǎn)新型功能性低聚糖低聚半乳糖的主要用酶，市場需求大；異淀粉酶能夠?qū)Ｒ恍缘厍虚_支鏈淀粉分支點中的α-1，6糖苷鍵，剪下整個側枝，生成長短不一的直鏈淀粉。目前已廣泛應用于淀粉糖漿、啤酒和酒精生產(chǎn)等多個淀粉深加工領域和醫(yī)藥領域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種將胞內(nèi)蛋白基質(zhì)表達的方法，是將T.fusca角質(zhì)酶基因(NCBI 編號AAZ54921)和胞內(nèi)目標蛋白基因在宿主菌大腸桿菌中共表達，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵上清液。為解決上述技術問題，具體方法為I)將pETDuet-Ι質(zhì)粒和Tfu_0883/pET20b (+)進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉化E. coli JM109感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒Tfu_0883/pETDuet-l ；2)將Tfu_0883/pETDuet-l和含有胞內(nèi)目標蛋白基因的重組質(zhì)粒pET20b (+)進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉化E. coli JM109感受態(tài)細胞，得到含有目標蛋白基因的重組質(zhì)粒 Tfu_0883/pETDuet-l ；3)將含有目標蛋白基因的重組質(zhì)粒Tfu_0883/pETDuet_l導入宿主大腸桿菌；4)步驟3)構建的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)目標蛋白，收集發(fā)酵上清液。所述宿主菌可以為E.coli BL21(DE3)、Ε· coliW3110、Ε· coliJM109、 E. coliJM109(DE3)、E. coliDH5a 等，其中優(yōu)選 E. coli BL21(DE3)。所述攜帶角質(zhì)酶和目標蛋白的載體為pETDuet-1、pCOLADuet-1等雙啟動子載體； pUC系列，pET系列，pT7-7, pGEX等任--種。所述胞內(nèi)目標蛋白是指目標蛋白在胞內(nèi)表達，其在細胞質(zhì)核糖體中合成后，在一系列伴侶因子幫助下仍定位于胞內(nèi)；例如半乳糖苷酶(NCBI編號ΑΕ006641)和異淀粉酶(NCBI編號NC_007333)。β -半乳糖苷酶是一種多功能酶，能作用于乳糖的β (I — 4) 糖苷鍵，形成半乳糖基-酶復合物，在該酶的水解活性下，復合物進一步水解，生成半乳糖； 而在該酶的轉苷活力作用下，復合物進一步與單糖、二糖或三糖等結合，生成低聚半乳糖。 β -半乳糖苷酶是工業(yè)酶法生產(chǎn)新型功能性低聚糖低聚半乳糖的主要用酶，市場需求大； 異淀粉酶能夠?qū)Ｒ恍缘厍虚_支鏈淀粉分支點中的a -I，6糖苷鍵，剪下整個側枝，生成長短不一的直鏈淀粉。目前已廣泛應用于淀粉糖漿、啤酒和酒精生產(chǎn)等多個淀粉深加工領域和醫(yī)藥領域。含角質(zhì)酶重組質(zhì)粒的構建方法為將pETDuet-Ι質(zhì)粒(購自Novagen公司)和Tfu 0883/pET20b (+)進行雙酶切，用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉化E. coli JM109感受態(tài)細胞，挑選轉化子并提取質(zhì)粒。所述Tfu_0883/pET20b (+) (Chen S，Tong X，Woodard Rff, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008, 283 (28) 25854-25862)為含有 T. fusca 角質(zhì)酶基因(NCBI 編號AAZ54921)的重組質(zhì)粒。胞內(nèi)目標蛋白的表達將上述含角質(zhì)酶重組質(zhì)粒與含胞內(nèi)目標蛋白基因的重組質(zhì)粒進行雙酶切，連接酶連接，轉化E. coli JM109感受態(tài)細胞，挑選轉化子并提取重組質(zhì)粒， 將其導入宿主菌，進行液體培養(yǎng)。本發(fā)明通過共表達T. fusca角質(zhì)酶，大腸桿菌細胞通透性提高，目標蛋白在培養(yǎng)基中酶活可達到總酶活的80%以上,使胞內(nèi)蛋白實現(xiàn)基質(zhì)表達。
具體實施例方式實施例I :Tfu_0883/pETDuet-l重組質(zhì)粒的構建將pETDuet-Ι質(zhì)粒和實驗室前期構建的 Tfu_0883/pET20b (+)進行NcoI和HandI 11雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，用T4連接酶16 °C連接過夜，連接產(chǎn)物轉化E. coli JM109感受態(tài)細胞，轉化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB固體平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒Tfu_0883/pETDuet-l。Tfu_0883/lacS/pETDuet-l 重組質(zhì)粒的構建Tfu_0883/pETDuet_l 質(zhì)粒和實驗室前期構建的lacS/pET20b(+)(吳敬，陳晟，吳玉飛，陳堅，夏澤華一種β _半乳糖苷酶的突變體及其制備方法和應用.201110247338. 3)進行NdeI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用Τ4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉化Ε. coli JM109感受態(tài)細胞，轉化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB固體平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒Tfu_0883/lacS/pETDuet-l。β -半乳糖苷酶的表達與制備將Tfu_0883/lacS/pETDuet-l轉化E. coli BL21 (DE3)宿主菌，在含100mg/L氨芐青霉素的LB固體平板上經(jīng)37°C培養(yǎng)8_10h，挑選轉化子在LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8-10h，后以5%接種量接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L， 酵母膏 24g/L，K2HPO4 12. 54g/L，KH2PO4 2. 31g/L)發(fā)酵液體培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL 氨芐青霉素)37°C培養(yǎng)2h后用ImM IPTG (異丙基硫代-β -D半乳糖苷)誘導約16h。發(fā)酵液于4°C，SOOOrpm離心lOmin，分別測定發(fā)酵液上清和細胞中的β-半乳糖苷酶酶活為102U/mL和17U/mL，胞外酶活占總酶活的85. 4%。實施例2 Tfu_0883/Tfu_1891/pETDuet-l 重組質(zhì)粒的構建將 Tfu_0883/pETDuet_l 質(zhì)粒和實驗室前期構建的Tfu_1891/pET20b(+)(吳敬，陳晟，段緒果，陳堅一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌及其應用.201110459137. X)進行NdeI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉化E. coli JM109感受態(tài)細胞，轉化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB固體平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒Tfu_0883/Tfu_1891/ pETDuet-Ιο異淀粉酶的表達與制備將Tfu_0883/Tfu_1891/pETDuet_l 轉化 E. coli BL21 (DE3)宿主菌，在含100mg/L氨芐青霉素的LB固體平板上經(jīng)37°C培養(yǎng)8_10h，挑選轉化子在LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8-10h，后以5%接種量接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L， 酵母膏 24g/L，K2HPO4 12. 54g/L，KH2PO4 2. 31g/L)發(fā)酵液體培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL 氨芐青霉素)37°C培養(yǎng)2h后用ImM IPTG (異丙基硫代-β -D半乳糖苷)誘導約16h。發(fā)酵液于4°C，SOOOrpm離心lOmin，分別測定發(fā)酵液上清和細胞中的異淀粉酶酶活為733U/mL和142U/mL，胞外酶活占總酶活的83. 8%。
權利要求
1.一種將胞內(nèi)蛋白基質(zhì)表達的方法，其特征在于，將NCBI編號為AAZ54921的角質(zhì)酶基因和胞內(nèi)目標蛋白基因在宿主菌大腸桿菌中表達，發(fā)酵培養(yǎng)并收集發(fā)酵上清液，所述胞內(nèi)目標蛋白為在細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)。
2.權利要求I所述的方法，其特征在于，具體方法為1)將pETDuet-Ι質(zhì)粒和Tfu_0883/pET20b(+)進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉化E. coli JM109感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒Tfu_0883/pETDuet-l 2)將Tfu_0883/pETDuet-l和含有胞內(nèi)目標蛋白基因的重組質(zhì)粒pET20b(+)進行雙酶切，連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉化E. coli JM109感受態(tài)細胞，得到含有目標蛋白基因的重組質(zhì)粒 Tfu_0883/pETDuet-l ；3)將含有目標蛋白基因的重組質(zhì)粒Tfu_0883/pETDuet-l導入宿主大腸桿菌；4)步驟3)構建的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)目標蛋白，收集發(fā)酵上清液。
3.權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)、 E.coli W3110.E. coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E. coli DH5 α 中任——種。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主大腸桿菌為E.coliBL21(DE3)。
5.權利要求3所述的方法，其特征在于，所述含有胞內(nèi)目標蛋白基因的重組質(zhì)粒 pET20b (+)為 lacS/pET20b (+)或 Tfu_1891/pET20b(+)。
6.—種權利要求I所述方法在表達胞內(nèi)蛋白中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將胞內(nèi)蛋白基質(zhì)表達的方法和其應用，屬于生物工程技術領域。是將T.fusca角質(zhì)酶和胞內(nèi)目標蛋白在大腸桿菌中共表達，從而實現(xiàn)目的蛋白的胞外表達，發(fā)酵培養(yǎng)上清酶活可達到總酶活的80％以上，可簡化后提取工藝，具有較高的學術意義和應用價值。
文檔編號C12R1/19GK102586312SQ20121004596
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權日2012年2月27日
發(fā)明者吳敬, 宿玲恰, 陳堅, 陳晟 申請人:江南大學