一種包埋有凝血相關(guān)酶水凝膠微球的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水凝膠微球的應(yīng)用，特別是一種包埋有凝血相關(guān)酶的水凝膠微球 在血液凝固中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前公開的針對血液（或血漿）凝固的方法均是采用凝血相關(guān)酶的直接凝固，這 種方法僅適用于少量靜態(tài)樣品或比較細(xì)小的管路的凝結(jié)。但如果是直徑很大的管腔體系， 且有正壓推進(jìn)的情況下，難以在短時間內(nèi)實現(xiàn)流動態(tài)的血液（或血漿）的快速凝固以及目 標(biāo)管腔的有效封堵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述問題，本發(fā)明將凝血酶的生化促凝活性與水凝膠微球的阻塞作用相結(jié) 合，提出一種包埋有凝血相關(guān)酶的水凝膠微球在凝血過程的應(yīng)用。其特征在于：水凝膠微 球的主要成分是海藻酸鹽材料，微球粒徑100-1000微米，粒徑均一（CV〈20 % )，含有凝血相 關(guān)酶的海藻酸鈉水凝膠微球中凝血相關(guān)酶與海藻酸鈉的質(zhì)量比1:3-4:1，除水后凝血相關(guān) 酶的載藥量在25% -80%，載有凝血相關(guān)酶的水凝膠微球用于下述三種情形之一或二種以 上；
[0004] A、含有纖維蛋白原液體于管路中流動過程的管路阻塞；
[0005] 或，B、含有纖維蛋白原液體于管路中流動過程的一個或二個以上管路開口端封 閉；
[0006] 或，C、含有纖維蛋白原液體的凝結(jié)。
[0007] 其中，所述含有纖維蛋白原的液體包括離體的血液或血漿。
[0008] 所述流動的含有纖維蛋白原液體管路的阻塞、開口端封閉及液體凝結(jié)包括物 理-化學(xué)的聯(lián)合作用；
[0009] 物理作用包括微球的機(jī)械阻塞和水凝膠迅速吸水膨脹后加強(qiáng)阻塞封閉作用；化學(xué) 作用指凝血相關(guān)酶作用于纖維蛋白原引發(fā)液體凝固后帶來的阻塞封閉及凝結(jié)效應(yīng)。
[0010] 所述水凝膠微球尤其適用于在一定壓力（60-150mmHg)存在的含有纖維蛋白原的 流動液體的管路阻塞、管路開口端封閉或液體凝結(jié)的情形之一或二種以上。
[0011] 所述水凝膠微球中的凝血相關(guān)酶，包括凝血酶或血凝酶中的一種或兩種。
[0012] 所述海藻酸鹽水凝膠微球中，海藻酸鹽分子量10kDa-2000kDa，所述海藻酸鹽包括 海藻酸鈣鹽或海藻酸鋇鹽中的一種或二種，也可同時包含或不包含海藻酸鈉鹽或鉀鹽中的 一種或二種。
[0013] 所述水凝膠微球的制備方法包括如下步驟：
[0014] A、配制濃度10_30g/L海藻酸鈉溶液；
[0015] B、將凝血相關(guān)酶溶解到步驟A制備的海藻酸鈉溶液中，凝血相關(guān)酶的濃度為 10-40g/L，即得含有凝血相關(guān)酶的海藻酸鈉溶液；
[0016] C、配制凝膠浴水溶液，凝膠浴中含有總濃度5_30g/L氯化鈣或氯化鋇的一種或兩 種，凝膠浴水溶液還含有總濃度l_20g/L氯化鈉或氯化鉀中的一種或二種；凝膠浴水溶液 還含有總濃度〇. 5-20g/L檸檬酸鈉或磷酸鈉或磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉中的一種或二種 以上；凝膠浴水溶液還含有總濃度l-30g/L吐溫或F68中的一種或二種；
[0017] D、在高壓靜電場下，將步驟B配制的含有凝血相關(guān)酶的海藻酸鈉溶液形成均勻的 射流液滴，液滴進(jìn)入步驟C配制的凝膠浴溶液中，發(fā)生凝膠化反應(yīng)，即得包埋有凝血相關(guān)酶 的海藻酸鹽水凝膠微球。
[0018] 所述包埋有凝血相關(guān)酶的海藻酸鹽水凝膠微球可進(jìn)一步與聚陽離子溶液交聯(lián)反 應(yīng)，在微球表面形成聚電解質(zhì)絡(luò)合膜，形成包埋有凝血相關(guān)酶的海藻酸鹽-聚陽離子微球， 具體步驟為：
[0019] 1)將包埋有凝血相關(guān)酶的海藻酸鹽水凝膠微球投入到聚陽離子溶液中，微球與聚 陽離子溶液的體積比為1:2-1:10,旋轉(zhuǎn)震蕩，讓微球在溶液中處于均勻懸浮狀態(tài)，進(jìn)行聚電 解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)2-60分鐘；
[0020] 2)微球與聚陽離子反應(yīng)液分離，收集微球，生理鹽水清洗后即獲得包埋有凝血相 關(guān)酶的海藻酸鹽-聚陽離子微球；
[0021] 其中，聚陽離子包括殼聚糖及其衍生物，α或ε聚賴氨酸，聚鳥氨酸、聚精氨酸， 聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亞胺及其衍生物，及上述任一一種或二種以上聚 陽離子的共聚物中的一種或二種以上，聚陽離子分子的分子量在lkDa-500kDa，聚陽離子溶 液濃度 〇· 2_20g/L。
[0022] 所述包埋有凝血相關(guān)酶的水凝膠微球可根據(jù)應(yīng)用需求，實現(xiàn)凝血相關(guān)酶在應(yīng)用環(huán) 境的緩控釋。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0024] 1.載凝血酶的海藻酸鹽水凝膠微球用于流動的含有纖維蛋白原液體管路的阻塞、 開口端封閉及液體凝結(jié)。較單純凝膠微球或單純凝血酶的作用效果相比，本發(fā)明發(fā)揮了水 凝膠微球的物理效應(yīng)及凝血酶的化學(xué)效應(yīng)相聯(lián)合的作用。其中，物理效應(yīng)包括微球的機(jī)械 阻塞和水凝膠迅速吸水膨脹后加強(qiáng)阻塞封閉作用；化學(xué)作用指凝血相關(guān)酶作用于纖維蛋白 原引發(fā)液體凝固后帶來的阻塞封閉及凝結(jié)效應(yīng)。因此，本發(fā)明中的載有凝血酶的海藻酸鹽 水凝膠微球能夠充分發(fā)揮對流動的含有纖維蛋白原液體管路的阻塞、開口端封閉及液體凝 結(jié)的應(yīng)用效果。
[0025] 2.由于能夠?qū)崿F(xiàn)體外緩釋。因此，將凝血酶的生化促凝血功能與海藻酸鹽水凝膠 微球的物理阻塞作用相結(jié)合，實現(xiàn)在一定壓力（60-150mmHg)存在的含有纖維蛋白原的流 動液體的管路阻塞、開口端封閉及液體凝結(jié)。
[0026] 3.本發(fā)明的工藝制備過程條件溫和，易于凝血相關(guān)酶生物活性的保持。
[0027] 4.本發(fā)明采用的凝血相關(guān)酶包埋工藝，是在海藻酸鹽水凝膠微球制備過程中直 接將凝血相關(guān)酶包埋進(jìn)微球，凝血相關(guān)酶的包封率高達(dá)90%以上，除水后的載藥量高到 25% -80%。
【附圖說明】
[0028] 附圖1 :新西蘭大白兔腎動脈造模及微球栓塞影像；
[0029] A:正常腎臟影像；
[0030] B:腎臟血管損傷造模后影像（紅色箭頭所示為損傷后出血）；
[0031] C:利用微球栓塞受損動脈后影像，顯示出血停止；
[0032] D:栓塞后lOmin復(fù)查血管造影顯示無出血，凝血酶微球栓塞止血成功。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1
[0034] 【1】配制海藻酸鈉溶液（濃度15g/L);
[0035] 【2】將凝血酶（lOOmg)溶解到步驟【1】制備的海藻酸鈉溶液中，濃度為10g/L，即 得含有凝血酶的海藻酸鈉溶液；
[0036] 【3】配制凝膠浴溶液，凝膠浴中含有氯化鈣（濃度30g/L)，氯化鈉（濃度5g/L)，磷 酸二氫鈉（濃度lg/L)，吐溫5g/L ;
[0037] 【4】在高壓靜電場下，將步驟【2】配制的含有凝血酶的海藻酸鈉溶液形成均勻的射 流液滴，液滴進(jìn)入步驟【3】配制的凝膠浴溶液中，發(fā)生凝膠化反應(yīng)，反應(yīng)30分鐘后即得包埋 有凝血酶的海藻酸鹽水凝膠微球，微球粒徑500± 100微米。
[0038] 【5】將步驟【4】制備的包埋有凝血酶的海藻酸鹽水凝膠微球，與殼聚糖溶液（濃 度5g/L)常溫下進(jìn)行成膜反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌3遍，即獲得包埋有凝血酶的海藻酸 鹽-殼聚糖微球。
[0039] 【6】配制纖維蛋白原溶液：取纖維蛋白原，加入0. 9 %氯化鈉溶液制備成含lg/L的 溶液。
[0040] 【7】通過微加工技術(shù)制備一分二、二分四的三級分枝的管路，最后一級形成長lcm， 直徑:φ =2mm的4條并聯(lián)管路，管路末端開放，與儲液池相連，并通過蠕動泵將儲液池液體 重新泵回三級分枝管路中一級管路加樣入口，形成循環(huán)回路。將步驟【6】配制的纖維蛋白 原溶液放在儲液池中，即在蠕動泵作用下，以i〇ml/s的流速穩(wěn)定通過三級流動管路。
[0041] 【8】將步驟【5】制備的包埋有凝血酶的海藻酸鹽-殼聚糖微球通過毛細(xì)導(dǎo)管（內(nèi) 徑為1mm)導(dǎo)入三級流動管路最后一級距離開口端5mm處，向流動管路中放入0. 2ml微球， 取出導(dǎo)管，發(fā)現(xiàn)放有微球的導(dǎo)管在30秒鐘后即發(fā)生血漿流體凝固，而未放置微球的管路， 仍然保持正常的流動狀態(tài)。
[0042] 比較例1
[0043] 【1】配制纖維蛋白原溶液：取纖維蛋白原，加入0. 9 %氯化鈉溶液制備成含lg/L的 溶液。
[0044] 【2】與實施例1相同方法加工成相同的三級分枝管路。
[0045] 【3】將與實施例1等量的凝血酶溶液通過毛細(xì)導(dǎo)管（內(nèi)徑為1mm)導(dǎo)入三級流動管 路最后一級距離開口端5_處，取出導(dǎo)管，發(fā)現(xiàn)30秒鐘后各導(dǎo)管均未發(fā)生凝固反應(yīng)，仍然保 持正常