專利名稱：一種雙鏈核酸及其應(yīng)用和核糖核酸酶的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙鏈核酸，以及利用所述雙鏈核酸的核糖核酸酶的檢測方法和檢測試劑盒。具體而言，本發(fā)明涉及一種雙鏈核酸底物，利用所述雙鏈核酸底物并通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移法檢測核糖核酸酶的方法，以及該方法在檢測樣本中核糖核酸酶的活性及含量中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)或稱RNA酶,是一大類包括數(shù)十個種類的、能夠?qū)NA底物水解成小分子核酸的酶。按切割位點的位置，可將這些酶分為內(nèi)切酶和外切酶兩類，分屬于EC 2.7(磷酸化酶)與EC 3. 1(水解酶)中的多個次分類。不同來源的核糖核酸酶，其專一性、作用方式都有所不同。例如，核糖核酸酶Tl的催化產(chǎn)物為單核苷酸、 和以3'-鳥苷酸為組成的或末端為3'-鳥苷酸的低聚核苷酸，核糖核酸酶T2的催化產(chǎn)物為單核苷酸、和以3'-腺苷酸為組成的或末端為3'-腺苷酸的低聚核苷酸。絕大部分的核糖核酸酶需要二價陽離子作為輔因子(例如Ca2+、Mg2+等)，因此其活性可被乙二胺四乙酸(EDTA)阻斷。
在實驗室研究中，最主要的兩種核糖核酸酶是RNase A和RNase H。RNase H是一種核糖核酸內(nèi)·切酶，能特異性地水解與DNA鏈形成互補的RNA鏈骨架上的磷酸二酯鍵，即， 分解RNA/DNA雜交鏈中的RNA鏈，但該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。RNase A是另一種被詳細研究和具有廣泛應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶。RNase A對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用。 RNase A在嘧啶核苷酸殘基C和U的3'端處高效且專一地催化RNA鏈骨架上的磷酸二酯鍵的裂開，形成具有2'，3'-環(huán)磷酸衍生物的寡聚核苷酸，從而可以用來去除DNA制品中的污染RNA。
為了檢測樣本中核糖核酸酶的活性或含量，研究人員在分析底物降解的基礎(chǔ)上， 建立了許多技術(shù)方案。這些方案大體上分為兩類一類是以異質(zhì)性的核糖核酸分子為底物， 另一類是以人工合成的核糖核酸分子為底物，例如寡聚核糖核苷酸。通常情況下，以人工合成的寡聚核糖核酸為底物的檢測技術(shù)具有更高的靈敏度和更好的特異性。在這些方案中， 眾多檢測技術(shù)得到了巧妙的應(yīng)用，其中包括直接染色法、分光光度法、比色法檢測、級聯(lián)顯色法、同位素不蹤技術(shù)、突光偏振技術(shù)和突光淬滅技術(shù)。
檢測手段的選擇在很大程度上決定了分析技術(shù)的靈敏度和適用范圍。例如，為了檢測實驗試劑是否受到核糖核酸酶的污染，需要使用非常靈敏的檢測技術(shù)，以確定實驗試劑中微量核糖核酸酶的存在，從而避免實驗樣本的降解。如果檢測手段不夠靈敏，不能檢測到雖然微量但足以影響實驗結(jié)果的核糖核酸酶的存在，將會直接導(dǎo)致實驗的失??；反之，如果檢測手段過于靈敏，將會排除雖然存在極微量的核糖核酸酶但不至于對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響的試劑，這種高靈敏性雖然能夠保證實驗結(jié)果的準確性，但同時會增加實驗的難度，提高實驗成本。在實際操作中，檢測靈敏度在l-100picogram/ml(pg/ml)RNase A的范圍內(nèi)是比較理想的，但目前商品化的檢測試劑的靈敏度在10-100pg/ml RNase A范圍內(nèi)。另一方面，由于核糖核酸酶的監(jiān)測是一項常規(guī)的實驗室操作，這就要求檢測技術(shù)具有較高的穩(wěn)定性并易于操作。
早期的核糖核酸酶活性檢測是建立在Kunitz技術(shù)上(Kunitz M. Aspectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity. J. Biol. Chem.，1946，164 :563-568)。在該技術(shù)中，他們向被檢測樣本中加入異質(zhì)性的RNA 樣本，通過分光光度法檢測RNA樣本在300nm吸收值的變化，計算樣本中核糖核酸酶的活性。Oshima 隨后對這項技術(shù)進行了優(yōu)化(Oshima T，Uenishi N and Imahori K. Simple assay methods for ribonuclease Tl，T2，and nuclease P1.Anal. Biochem.，1976，71 632-634)?？偟膩碚f，這種檢測方案的靈敏度不高，不適合核糖核酸酶活性檢測的要求。
另一種核糖核酸酶活性檢測方案首先利用聚丙烯酰胺凝膠對樣本進行分離(Wilson Cff. A rapid staining technique for detection of RNase after polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. , 1969, 31 :506-511)。利用使凝膠中被分離的核糖核酸酶樣本與異質(zhì)性RNA底物接觸及隨后的RNA染色，分析RNA底物的降解情況，并進而檢測核糖核酸酶的活性。雖然這種方案在概念上較為簡單，但實施起來非常耗時，并且靈敏度不高，只能檢測I個單位或以上的RNase I。在該方案的改進型中，Karpetsky通過改善凝膠分離技術(shù)，使檢測靈敏度提高到能檢測IOOpg以下的 RNase A(Karpetsky TP, Davie GE, Shriven KK and Levy CC.Use of polynucleotide/ polyacryIamide-gel electrophoresis as a sensitive technique for the detection and comparison of ribonuclease activities. Biochem. J. , 1980,189 :277-284)。即便如此，改進方案并沒有有效的減少檢測時間，使得該方案仍然不適合實驗檢驗的需要。
另一種核糖核酸酶活性檢測方案是由Egly和Kempf建立的(Egly JM and Kempf J. Detection and estimation of very low ribonuclease activities in biological fluids. FEBS Letters, 1976,63 :250-254)。利用核糖核酸酶對不溶性底物的降解，通過分析降解產(chǎn)生的125Iodine標記的核苷酸，他們的檢測靈敏度可達到O. 01pg/ml，適合于常規(guī)的質(zhì)控檢測應(yīng)用。但是由于這項技術(shù)采 用了具有危害性的放射性同位素，使其不適合普通實驗室或產(chǎn)業(yè)界的常規(guī)使用，大大限制了該技術(shù)的適應(yīng)范圍。
另一項核糖核酸酶活性檢測技術(shù)是由Wagner建立的(Wagner AP, Iordachel MC and Wagner LP. A simple spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity in biological fluids. J. Biochem. Biophys. Methods,1983,8 291-297)。通過使RNA與Pyronine-Y結(jié)合，使其最大吸收峰值提高到572nm，樣本中核糖核酸酶對RNA的降解導(dǎo)致該吸光值呈現(xiàn)線性降低。這項檢測技術(shù)的靈敏度在2ng/ml RNase A左右，不適合用于核糖核酸酶活性的檢測。
另一種核糖核酸酶檢測技術(shù)是由Greiner-StoefEele建立的 (Greiner-StoefEele T, Grunow M and Hahn U. A general ribonuclease assay using methylene blue. Anal. Biochem. ,1996,240 :24-28)。利用一種染料methyleneblue 與高分子量的RNA底物結(jié)合形成一種染料-RNA復(fù)合物，樣本中核糖核酸酶對底物RNA的降解使得染料從復(fù)合物中釋放出來，導(dǎo)致688nm處的吸光值下降。這種方案也存在敏感性較低的問題，最低檢測限只有25ng/ml，不適合檢測常規(guī)樣本中核糖核酸酶活性的需要。
另一種核糖核酸酶檢測技術(shù)是由Karn建立的(Karn RC, Crisp M, Yount EA andHodes ME. A positive zymogram method for ribonuclease. Anal. Biochem.，1979，96: 464-468)。在這個方案中，利用RNase A對一種合成底物的降解，產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終形成一種可檢測藍色物質(zhì)。這種檢測方案可以檢測到O. 066單位的RNase A(大約IOOng)， 也不適合通常的核糖核酸酶檢測的需要。
另一種核糖核酸酶檢測技術(shù)是由Witmer建立的(Witmer MRiFalcomer CM，Weiner MPiKay MSiBegley TPiGanem B and Scheraga HA. U-3' -BCIP achromogenic substrate for the detection of RNase A in recombinant DNA expression systems. Nucleic Acids Res.，1991，19 :1-4)。該技術(shù)的主要特點是合成了核糖核酸酶底物U_3' -BCIP，該底物在核糖核酸酶的作用下會釋放一種報告基團，利用分光光度計在650nm條件下檢測報告基團的釋放情況，從而計算樣本中核糖核酸酶的活性和含量。這種方案雖然簡便易行，但是仍然不夠敏感。
熒光淬滅技術(shù)是一項被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)不同領(lǐng)域的研究技術(shù)，例如被應(yīng)用于蛋白酶活性的檢測(Yaron A，Carmel A and Katchalsk1-Katzir Ε· Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. ,95 228-235，1979)、DNA 限制性內(nèi)切酶的活性的檢測(Ghosh S S，Eis PS，Blumeyer K，F(xiàn)earon K and Millar DP. Real time kinetics of restriction endonuclease cleavage monitored by fluorescence resonance energy transfer. Nucleic Acids Res.，1994， 22 :3155-3159)、DNA 聚合酶的 5'外切酶活性的檢測(Gelfand DH, Holland PM，Saiki RK and Watson RM. Homogenous assay using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase. U. S. Pat. No. 5，210，015，1993)、特異性核酸序列的檢測(Gelfand DH, Holland PM，Saiki RK and Watson RM. Homogenous assay using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase. U. S. Pat. No.5，210，015，1993 ；Tyagi S， Kramer FR and Lizardi PM. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits. U. S. Pat. No. 5,925, 517,1999 ；Livak KJ，F(xiàn)lood SJA，Marmaro J and Mullah KB. Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe. U. S. Pat. No. 5，876，930，1999 ；Nazarenko IA, Bhatnagar SK, Winn-Deen ES and Hohman RJ. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon. U. S. Pat. No. 5，866，336，1999 ；Nadeau JG, Pitner B， Linn CP and Schram JL Detection of nucleic acids by fluorescence quenching. U. S. Pat. No. 5，958，700，1999)、以及免疫反應(yīng)檢測等(Maggio ET. Chemically induced fluorescence immunoassay. U. S. Pat. No. 4，220，450，1980)。在一個應(yīng)用焚光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)檢測錘頭樣核酶活性的方案中，使用了一條合成的寡聚核糖核酸底物，該寡聚核糖核酸底物的一端與Fam焚光基團連接，另一端與Tamara淬滅基團連接(Hanne A， Ramanujam MV,Rucker R and Krupp G. Fluorescence resonance energy transfer(FRET) to follow ribozyme reactions in real time. Nucleosides and Nucleotides. 1998,17 1835-1850)。
在另一個技術(shù)方案中，Zelenko等人合成了一條雙核苷酸的底物，其一端與熒光基團(0-aminobenzoic acid)連接，另一端與淬滅基團連接(2，4_nitroaniline) (Zelenko 0， Neumann U， Brill W， Pieles U， Moser HE and Hofsteenge J.A novel fluorogenicsubstrate for ribonucleases synthesis and enzymatic characterization. Nucleic Acids Res.，1994，22 :2731-2739), RNase A對該底物的切割使得熒光基團與淬滅基團分離，使反應(yīng)體系的熒光讀值增加。這個方案被設(shè)計用于研究RNase A的作用動力學(xué)，在檢測靈敏度上存在一定的局限，也不適合常規(guī)樣本核糖核酸酶活性的檢測。
在另一個方案中，James設(shè)計了一條9-mer長的嵌合寡聚核苷酸,用于RNaseA 的作用動力學(xué)研究，在該嵌合底物的中間是一個尿嘧啶核苷酸，兩側(cè)均為脫氧核糖核酸， 寡核苷酸的一端與突光基團連接，另一端與淬滅基團連接(James DA and Woolley GA. A fluorescence-based assay for ribonuclease aactivity. Anal. Biochem.，1998，264 26-33)。該方案的缺陷在于僅能應(yīng)用于研究能切割尿嘧啶核苷酸的核糖核酸酶的活性，另一方面需要用到靈敏的熒光光度計。
在另一個方案中，Kelemen等人報告了另一項類似的技術(shù)(Kelemen BR, Klink TA, Behlke MA, Eubanks SR, Leland PA and Raines RT. Hypersensitive substrate for ribonucleases. Nucleic Acids Res. ,1999,27 :3696-3701)。與 James 的研究方案一樣，這個方案也只能檢測能切割尿嘧啶核苷酸的核糖核酸酶，并且需要用到熒光光度計。
在另一個方案中，Burke等人報道了利用熒光偏振技術(shù)檢測核糖核酸酶對合成底物的切割活性(Burke TJ, Bolger RE, Checovich WJ and Tompson DV. Method and kit for detecting nucleic acid cleavage utilizing a covalently attached fluorescent tag. U. S. Pat. No. 5, 786, 139,1998)，目前市場上已有基于該技術(shù)的商品化的試劑盒(PanVera Corporation Catalog 2000, Section 3. 10. 545 Science Drive, Madison, Wis. 53711)。Wilson等人對該技術(shù)做了進一步的改進，實現(xiàn)了實時檢測的目標 (Wi lson GM, Lu H, Sun H, Kennedy A and Brewer G. Afluorescence-based assay for 3' S1 exoribonucleases-potential applications to the study of mRNA decay. RNA, 2000,6 :458-464) 0但是該技術(shù)需要用到一般實驗室不具備的熒光偏振儀，影響了該技術(shù)方案的廣泛使用。
另一個商品化的核糖核酸酶活性檢測試劑盒由PanVera公司提供(PanVera Corporation Catalog 2000,Section 3.10.545 Science Drive,Madison,Wis. 53711)。與熒光偏振方案相比，該技術(shù)的靈敏度較低。
另一個商品化的核糖核酸酶活性檢測試劑盒由Ambion公司提供，該方案基于一種生物素標記的核糖核酸底物，通過普通的顯色反應(yīng)進行核糖核酸酶活性的檢測(Ambion， Inc. Catalog 1999, pl04. 2130 Woodward Street, Austin, Tex. 78744.)。在沒有核糖核酸酶的情況下，底物能夠保持完整，在顯色反應(yīng)中呈現(xiàn)藍色；如果底物被樣本中的核糖核酸酶降解，則不能形成藍色反應(yīng)。該方案工作量較大，并且不適合高通量應(yīng)用。
另一個商品化的核糖核酸酶活性檢測試劑盒是通過凝膠電泳分析底物的降解情況(Mo Bio,ffeb Catalog，2000)。該方案涉及多步反應(yīng)，工作量較大，不適合常規(guī)的檢測工作。
綜上所述，盡管以上這些現(xiàn)有的檢測方法在提高核糖核酸酶活性檢測的靈敏度和準確性方面起了一定的作用，但均存在一定的缺陷，不適合作為一個通用的手段用于樣本中核糖核酸酶活性的高靈敏的檢測，相關(guān)技術(shù)方案還有較大的可改進的空間。發(fā)明內(nèi)容
為了開發(fā)一種更穩(wěn)定、更特異的核糖核酸酶檢測底物，提高檢測的靈敏度和特異性，發(fā)明人對核糖核酸酶降解雙鏈核糖核酸底物的降解過程及機制進行了廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)降解發(fā)生在雙鏈核糖核酸底物的兩個敏感位點CA/UG和UA/UA上。 在這一研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明內(nèi)容。
一方面，本發(fā)明提供一種雙鏈核酸，所述雙鏈核酸為能夠被核糖核酸酶切割的雙鏈核酸，所述雙鏈核酸的長度為7-30個堿基對，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個CA堿基序列或UA堿基序列，所述雙鏈核酸的第二單鏈的堿基序列中含有與所述第一單鏈中CA堿基序列或UA堿基序列互補的UG堿基序列或UA堿基序列，所述雙鏈核酸的一端連接有能量供體基團，另一端連接有能量受體基團，且所述能量供體基團和能量受體基團之間能夠進行能量轉(zhuǎn)移。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述雙鏈核酸的長度為7-30個堿基對，優(yōu)選為22、 23、24、25、26、27、28、29 或 30 個堿基對；還可以優(yōu)選為 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18,19,20或21個堿基對，進一步優(yōu)選為9、10、11、12、13、14或15個堿基對，還可以進一步優(yōu)選為7、8、9、10、11或12個堿基對。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個CA堿基序列，所述雙鏈核酸的第二單鏈的堿基序列中含有與所述第一單鏈中CA 堿基序列互補的UG堿基序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個UA堿基序列，所述雙鏈核酸的第二單鏈的堿基序列中含有與所述第一單鏈中UA 堿基序列互補的UA堿基序列。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述雙鏈核酸的第二單鏈與第一單鏈完全互補， 所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列優(yōu)選為5 ’ -AUGAGCCUGAUUU、5 ’ -AUGAGCCUAAUUU、 5，-GGCUGCU、5，_GAAUGAGCU、5，_GAGUCAGCUAATCUU、5，-UGGUAUGAGCCUG AUUUUGAU 或 5，-AGC UGGUGGUACAGAUGAUCUUGCAUCGUC，進一步優(yōu)選為 5’ -AUGAGCCUGAUUU。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述雙鏈核酸中含有至少一個脫氧核糖核苷酸基團。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述雙鏈核酸中含有至少一個修飾的核苷酸基團。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述修飾的核苷酸基團為磷酸基團、核糖基團和堿基中的至少一種被修飾的核苷酸基團，其中，核糖基團被修飾的核苷酸基團為核糖基團的2’ -羥基被修飾的核苷酸基團，所述核糖基團被修飾的核苷酸基團優(yōu)選為核糖基團的 2’ -羥基被甲氧基或氟取代的核苷酸基團。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述能量供體基團和所述能量受體基團位于雙鏈核酸的同一條核酸單鏈上，或者位于不同核酸單鏈上。優(yōu)選所述能量供體基團和所述能量受體基團位于同一或不同單鏈的兩端。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述能量供體基團為熒光供體基團，所述能量受體基團為熒光受體基團，其中，所述的熒光受體基團優(yōu)選為熒光淬滅基團。
優(yōu)選所述突光供體基團為選自突光素(fluorescein)基團、四氯突光素 (tetrachlorofIuorescein)基團、六氯突光素(hexachlorofIuorescein)基團、羅丹明(rhodamine)基團、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)基團、花青染料(Cydye)、德克薩斯紅(Texas Red)基團、氟硼突光染料(Bodipy dye)基團和亞歷克薩突光染料(Alexa dye)基團中的至少一種,更優(yōu)選為選自6-羧基突光素基團、5-四氯突光素基團、5_六氯突光素基團、6-羧基-X-羅丹明基團、N，N'-對羧芐基吲哚三菁基團和6-羧基四甲基羅丹明基團中的至少一種。優(yōu)選所述突光受體基團為選自氮代氧雜蒽(nitrogen-substituted xanthene)基團、取代或未取代的四偶氮苯基苯胺(substituted 4-(phenyldiazenyl)phenylamine)基團、取代或未取代的四偶氮苯基萘胺(substituted4_(phenyldiazenyl)naphthyIamine) 基團，更優(yōu)選所述熒光受體基團為選自4-(4' - 二甲基對氨基偶氮苯)苯甲酸 (4-(4' -dimethylaminophenylazo)benzoic acid))基團、N, N1 -雙甲基-N, N1 -聯(lián)苯-4- (5-叔丁氧羰基戍胺)哌唳砜基羅丹明(N, N’ -dimethyl-N, N’ -diphenyl-4- ((5_t_b utoxycarbonylaminopentyI) aminocarbonyI) piperidinylsulfonerhodamine)基團、4', 5' - 二硝基突光素(4' , 5' -dinitrofiuorescein)基團、氨基哌唳酸(pipe-colic acid amide)基團、4-(4-硝化苯嗪基)苯胺(4-[4_nitrophenyldiazinyl]phenylamine)基團、 4-(4-硝化苯嗪基)萘胺(4-[4_nitrophenyldiazinyl]naphthylamine)基團中的至少一種。
另一方面，本發(fā)明提供如上所述的雙鏈核酸在核糖核酸酶檢測中的應(yīng)用。其中，所述核糖核酸酶包括但不限于RNase1、RNase A、RNase H。
另一方面，本發(fā)明提供如上所述的雙鏈核酸在制備核糖核酸酶檢測試劑中的應(yīng)用。其中，所述核糖核酸酶包括但不限于RNase1、RNase A、RNase H。
另一方面，本發(fā)明提供一種核糖核酸酶的檢測方法，具體包括以下步驟1)獲得如上所述的雙鏈核酸；2)使步驟I)中的雙鏈核酸與被檢測樣本接觸，使得所述雙鏈核酸能夠被所述被檢測樣本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)檢測步驟2)中的接觸后的產(chǎn)物，從而檢測所述被檢測樣本中的核糖核酸酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種核糖核酸酶的定量檢測方法，該方法包括以下步驟1) 獲得如上所述的雙鏈核酸；2)使步驟I)中的雙鏈核酸與被檢測樣本接觸，使得所述核酸能夠被所述被檢測樣本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)檢測步驟2)中的接觸后的產(chǎn)物中的切割產(chǎn)物的量，從而檢測所述被檢測樣本中核糖核酸酶的含量。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，檢測所述切割產(chǎn)物的方法可以包括直接檢測法和間接檢測法。所述直接檢測法是指直接檢測雙鏈核酸底物在與樣本接觸前后的變化，具體方法包括但不限于電泳法、雜交法或高效液相色譜(HPLC)法。所述間接檢測法是指利用間接的檢測技術(shù)檢測雙鏈核酸底物在與樣本接觸前后的變化，具體方法包括但不限于熒光能量共振轉(zhuǎn)移方法。
本發(fā)明還提供一種核糖核酸酶檢測試劑盒，該試劑盒含有有效量的如上所述的雙鏈核酸。優(yōu)選所述試劑盒進一步還包含核糖核酸酶標準品。所述標準品即為陽性對照品， 是已知的具有核糖核酸酶活性的物質(zhì)。
利用本發(fā)明所提供的雙鏈核酸底物和核糖核酸酶檢測方法，能夠靈敏、準確地檢測不同來源樣本中核糖核酸酶的活性和含量。本發(fā)明提供的核糖核酸酶檢測方法不僅操作簡便，而且大大降低了檢測費用，對于多種疾病的早期檢測、療效評價、人群普查等大規(guī)模應(yīng)用均具較高的使用價值。相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明提供的雙鏈核酸底物和核糖核酸酶檢測方法具有明顯技術(shù)優(yōu)勢，具體體現(xiàn)在以下幾個方面。
I)底物穩(wěn)定性相對于現(xiàn)有技術(shù)的單鏈核糖核酸底物，本發(fā)明提供的雙鏈核酸底物的穩(wěn)定性更高，在實際應(yīng)用中具有更為明顯的技術(shù)優(yōu)勢。
2)高度特異性本發(fā)明是建立在對核糖核酸底物中的核糖核酸酶切割敏感位點進行分析的基礎(chǔ)上完成的，利用所鑒定的核糖核酸酶切割敏感位點，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)核糖核酸酶的特異性檢測，提高了檢測的特異性和準確性。
3)定量檢測技術(shù)在本發(fā)明的兩個突出的技術(shù)特點，即，底物穩(wěn)定性和高度特異性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供的檢測方案能夠更加穩(wěn)定地檢測樣本中核糖核酸酶的活性，并進一步計算出核糖核酸酶的含量，從而建立了可行的核糖核酸酶定量檢測技術(shù)，是對現(xiàn)有檢測技術(shù)的一個重大發(fā)展和進步。
4)高通量檢測技術(shù)本發(fā)明提供的利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移法檢測樣本中核糖核酸酶活性和含量的方法操作簡單，適合于作為標準化的檢測方法，從而對大量樣本進行高通量、低成本的檢測。
5)廣泛的適用性本發(fā)明提供的雙鏈核酸底物及核糖核酸酶檢測方法可用于建立標準的核糖核酸酶檢測體系，及用于分析、比較樣本中或樣本間不同核糖核酸酶的活性及含量。
本發(fā)明提供了一種高度穩(wěn)定和特異的核糖核酸酶檢測底物、檢測方案及其在核糖核酸酶活性和含量檢測中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，一方面，本發(fā)明提供的檢測底物更穩(wěn)定和更特異，具有顯著的技術(shù)進步；另一方面，本發(fā)明建立了一種適合于高通量和大規(guī)模應(yīng)用的定量檢測樣本中核糖核酸酶的方法，為實際應(yīng)用提供了一種簡便、高效的檢測技術(shù)。



圖1為本發(fā)明一種實施方式中RNase A處理前的反應(yīng)體系在500-650nm范圍內(nèi)的熒光光譜。
圖2為本發(fā)明一種實施方式中RNase A處理后的反應(yīng)體系在500-650nm范圍內(nèi)的突光光譜。
圖3為本發(fā)明一種實施方式中酶促反應(yīng)時的檢測時間對熒光強度的曲線。
圖4為本發(fā)明一種實施方式中RNase A濃度對K值的曲線。
具體實施方式
本發(fā)明中，突光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer， FRET)是指，當一個熒光基團(又稱為熒光供體基團)的熒光光譜與另一個熒光基團(又稱為熒光受體基團)的激發(fā)光譜相重疊時，熒光供體基團的激發(fā)能誘發(fā)熒光受體基團發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減的一種現(xiàn)象。FRET的產(chǎn)生及效率與熒光供體基團與熒光受體基團的空間距離緊密相關(guān)，該空間距離在7-10nm時FRET的效率最佳。隨著距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱。熒光供體基團和熒光受體基團之間的FRET的效率，可以由E =l/l+(R/Ro)6反映。其中，R表示熒光供體基團和熒光受體基團之間的距離，Rtl表示福氏距離。在福氏距離R0處，熒光供體基團與熒光受體基團間的FRET效率為50%。福氏距離R0依賴于供體發(fā)射譜和受體激發(fā)譜的重疊程度、以及供體和受體能量轉(zhuǎn)移的偶極子的相對方位。
應(yīng)當理解，凡是具有熒光發(fā)射光譜和熒光激發(fā)光譜重疊的熒光基團組合，S卩，能夠發(fā)生FRET現(xiàn)象的熒光基團組合均能應(yīng)用于本發(fā)明。這些熒光基團組合包括但不限于本說明書中提到的熒光基團組合。
本發(fā)明中，對雙鏈核酸進行修飾的方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，本發(fā)明對雙鏈核酸進行的化學(xué)修飾為以下的一種或一種以上化學(xué)修飾的組合
(I)對雙鏈核酸的骨架結(jié)構(gòu)中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；
(2)對雙鏈核酸的骨架結(jié)構(gòu)中核糖的修飾；
(3)對雙鏈核酸的核苷酸殘基中堿基的修飾。
所述磷酸二酯鍵的修飾是指對磷酸二酯鍵中的氧進行修飾，包括硫代磷酸修飾 (Phosphorthioate)和硼燒化磷酸鹽修飾(Boranophosphate)。如下式所示分別用硫和硼烷置換磷酸二酯鍵中的氧。兩種修飾都能穩(wěn)定核糖核酸分子的結(jié)構(gòu)，保持堿基配對的高特異性和高親和力。
權(quán)利要求
1.一種雙鏈核酸，所述雙鏈核酸為能夠被核糖核酸酶切割的雙鏈核酸， 其中，所述雙鏈核酸的長度為7-30個堿基對， 所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個CA堿基序列或UA堿基序列，所述雙鏈核酸的第二單鏈的堿基序列中含有與所述第一單鏈中CA堿基序列或UA堿基序列互補的UG堿基序列或UA堿基序列， 所述雙鏈核酸的一端連接有能量供體基團，另一端連接有能量受體基團，且所述能量供體基團和能量受體基團之間能夠進行能量轉(zhuǎn)移。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸，其中，所述核酸的長度為22、23、24、25、26、27、28、29或30個堿基對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸，其中，所述雙鏈核酸的長度為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 21 個堿基對。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙鏈核酸，其中，所述核酸的長度為9、10、11、12、13、14或15個堿基對。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙鏈核酸，其中，所述核酸的長度為7、8、9、10、11或12個堿基對。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的雙鏈核酸，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個CA堿基序列，所述雙鏈核酸的第二單鏈的堿基序列中含有與所述第一單鏈中CA堿基序列互補的UG堿基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的雙鏈核酸，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個UA堿基序列，所述雙鏈核酸的第二單鏈的堿基序列中含有與所述第一單鏈中UA堿基序列互補的UA堿基序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的雙鏈核酸，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈和第二單鏈完全互補，所述第一單鏈的堿基序列為5’ -AUGAGCCUGAUUU、5’ -AUGAGCCUAAUUU、5’ -GGCUGCU、5’ _GAAUGAGCU、5’ _GAGUCAGCUAATCUU、5’ -UGGUAUGAGCCUGAUUUUGAU 或 5’ -AGCUGGUGGUACAGAUGAUCUUGCAUCGUC。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的雙鏈核酸，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈和第二單鏈完全互補，所述第一單鏈的堿基序列為5’ -AUGAGCCUGAUUU。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項所述的雙鏈核酸，其中，所述雙鏈核酸中含有至少一個脫氧核糖核苷酸基團。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項所述的雙鏈核酸,其中，所述雙鏈核酸中含有至少一個修飾的核苷酸基團。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈核酸，其中，所述修飾的核苷酸基團為磷酸基團、核糖基團和堿基中的至少一種被修飾的核苷酸基團。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的雙鏈核酸，其中，核糖基團被修飾的核苷酸基團為核糖基團的2’ -羥基被修飾的核苷酸基團。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的雙鏈核酸，其中，所述核糖基團被修飾的核苷酸基團為核糖基團的2’ -羥基被甲氧基或氟取代的核苷酸基團。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述的雙鏈核酸，其中，所述能量供體基團和所述能量受體基團位于同一條核酸單鏈上。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述的雙鏈核酸，其中，所述能量供體基團和所述能量受體基團位于不同核酸單鏈上。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任意一項所述的雙鏈核酸，其中，所述能量供體基團為熒光供體基團，所述能量受體基團為熒光受體基團。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的雙鏈核酸，其中，所述熒光受體基團為熒光淬滅基團。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的雙鏈核酸，其中，所述熒光供體基團為選自熒光素基團、四氯熒光素基團、六氯熒光素基團、羅丹明基團、四甲基羅丹明基團、花青染料基團、德克薩斯紅基團、氟硼熒光染料基團和亞歷克薩熒光染料基團中的至少一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的雙鏈核酸，其中，所述熒光供體基團為選自6-羧基熒光素基團、5-四氯熒光素基團、5-六氯熒光素基團、6-羧基-X-羅丹明基團、N，N'-對羧芐基吲哚三菁基團和6-羧基四甲基羅丹明基團中的至少一種。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的雙鏈核酸，其中，所述熒光受體基團為選自氮代氧雜蒽基團、四偶氮苯基苯胺基團和四偶氮苯基萘胺基團中的至少一種。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的雙鏈核酸，其中，所述熒光受體基團為選自4-(4’_二甲基對氨基偶氮苯)苯甲酸基團、N，N'-雙甲基-N，N'-聯(lián)苯-4-(5-叔丁氧羰基戊胺)-哌啶砜基羅丹明基團、4'，5' -二硝基熒光素基團、氨基哌啶酸基團、4-(4-硝化苯嗪基)苯胺基團和4-(4-硝化苯嗪基)萘胺基團中的至少一種。
23.權(quán)利要求1-22中任意一項所述的雙鏈核酸在核糖核酸酶檢測中的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其中，所述核糖核酸酶為RNaseKRNase A和RNaseH中的至少一種。
25.權(quán)利要求1-22中任意一項所述的雙鏈核酸在制備核糖核酸酶檢測試劑中的應(yīng)用。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其中，所述核糖核酸酶為RNaseI>RNase A和RNaseH中的至少一種。
27.一種核糖核酸酶的檢測方法，該方法包括以下步驟 1)獲得權(quán)利要求1-22中任意一項所述的雙鏈核酸； 2)使步驟I)中的雙鏈核酸與被檢測樣本接觸，使得所述雙鏈核酸能夠被所述被檢測樣本中可能存在的核糖核酸酶切割； 3)檢測步驟2)中的接觸后的產(chǎn)物，從而檢測所述被檢測樣本中的核糖核酸酶。
28.一種核糖核酸酶的定量檢測方法，該方法包括以下步驟 1)獲得權(quán)利要求1-22中任意一項所述的雙鏈核酸； 2)使步驟I)中的雙鏈核酸與被檢測樣本接觸，使得所述雙鏈核酸能夠被所述被檢測樣本中可能存在的核糖核酸酶切割； 3)檢測步驟2)中的接觸后的產(chǎn)物中的切割產(chǎn)物的量，從而檢測所述被檢測樣本中核糖核酸酶的含量。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的檢測方法，其中，檢測所述切割產(chǎn)物的方法為直接檢測法。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的檢測方法，其中，所述直接檢測法為電泳法、雜交法或HPLC法。
31.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的檢測方法，其中，檢測所述切割產(chǎn)物的方法為間接檢測法。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的檢測方法，其中，所述間接檢測法為熒光能量共振轉(zhuǎn)移法。
33.一種核糖核酸酶檢測試劑盒，該試劑盒含有有效量的權(quán)利要求1-22中任意一項所述的雙鏈核酸。
34.權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中，該試劑盒還包括核糖核酸酶標準品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種雙鏈核酸、一種核糖核酸酶的檢測方法、以及他們在核糖核酸酶檢測中的應(yīng)用。具體來講，本發(fā)明的雙鏈核酸底物中包含至少一個核糖核酸酶的敏感位點，通過分析核糖核酸酶對雙鏈核酸底物的降解來檢測樣本中核糖核酸酶的活性及含量，本發(fā)明進而提供了所述雙鏈核酸底物及檢測方法在樣本核糖核酸酶檢測中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/11GK103013987SQ20111028017
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司