專利名稱：尿足細胞特異信使核糖核酸聚合酶鏈反應檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于糖尿病腎病尿液生物標志物研究方法的建立，特別涉及一種基于STOR Green I實時熒光定量PCR方法的尿液足細胞特異性信使核糖核酸(mRNA)檢測技術(shù)的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)在西方發(fā)達國家是導致終末期腎衰 (end-stage renal disease, ESRD)的首要病因。在我國，DN也是僅次于腎小球疾病而導致 ESRD的第二位病因。DN的發(fā)病機制目前尚未完全闡明。足細胞是一類附著于腎小球基底膜上的高度分化的上皮細胞，參與維持濾過屏障的完整性。最近大量研究證實，足細胞損傷在DN發(fā)病及進展過程中發(fā)揮極為重要的作用。足突融合、足細胞肥大、凋亡、脫落，以及足細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化都是可能參與DN發(fā)展的機制。因此，檢測足細胞特異性表達的蛋白及基因已成為研究DN的一種方法。目前，腎穿刺以及免疫組化技術(shù)是研究足細胞標志分子的常規(guī)方法，然而腎穿刺作為一項創(chuàng)傷性檢查，具有穿刺后出血、感染等不可避免的操作風險，且無法對患者進行連續(xù)動態(tài)觀察。因此，需求無創(chuàng)、動態(tài)監(jiān)測患者足細胞特異分子表達改變的技術(shù)成為研究熱
點ο實施熒光定量PCR(real-time quantitive PCR)作為一項成熟可靠的技術(shù)以其高靈敏度、高特異性及穩(wěn)定性而廣發(fā)用于各項分子生物學研究。尿液中蘊藏著大量生物學信息且具有無創(chuàng)收集、標本處理相對簡便的優(yōu)勢，而目前尚無基于real-time PCR技術(shù)檢測尿液足細胞特異性mRNA方法構(gòu)建的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種基于STOR GREEN I實時熒光定量PCR技術(shù)的尿足細胞特異信使核糖核酸聚合酶鏈反應檢測方法。本發(fā)明利用STOR GREEN I實時熒光定量PCR技術(shù)，建立尿液足細胞相關(guān) mRNA (podocalyxin, CD2-AP)的檢測方法，評估其檢測范圍及穩(wěn)定性。本發(fā)明技術(shù)解決方案如下一種尿足細胞特異信使核糖核酸聚合酶鏈反應檢測方法，構(gòu)建步驟為步驟1、尿液標本的收集留取晨尿200-300ml，將晨尿置于離心機上并在離心力為3000g、溫度4°C 下，離心30分鐘，棄上清，細胞沉渣重新懸浮于Iml焦碳酸二乙酯-PBS緩沖液(焦碳酸二乙酯與PBS緩沖液按體積比1 1000配制)，得到懸浮液，將懸浮液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘，棄上清，剩余沉渣中加入Iml RNAiso Plus，充分混勻，得到沉渣與RNAiso Plus的混合液；步驟2、總RNA提取步驟步驟2. 1將所述沉渣與RNAiso Plus的混合液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘，吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管；步驟2. 2向由步驟2. 1獲得的上清液中加入200ul氯仿，蓋緊離心管，劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化且分層現(xiàn)象消失后，再室溫靜置5分鐘，得到混懸液；步驟2. 3將步驟2. 2得到的混懸液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C 下，離心5分鐘；步驟2. 4取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；步驟2. 5向由步驟2. 4得到的上清液中加入等體積異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15-30°C 下靜置10分鐘，得到混合液；步驟2. 6將步驟2. 5得到的混合液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘；步驟2. 7棄去上清，沿離心管壁加入體積濃度為 75%的乙醇1ml，上下顛倒洗滌離心管，置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下， 離心5分鐘后棄去乙醇，得到RNA沉淀；步驟2. 8室溫干燥RNA沉淀2_5分鐘，加入30ul Rnase-free水，用移液槍吹打RNA沉淀并使其溶解，得到RNA溶液，再利用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度；步驟3、逆轉(zhuǎn)錄反應體系lug步驟2. 8所述的RNA溶液，4ul 5X PrimeScriptTM Buffer,Iul PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I,Iul Oligo dT Primer,Iul Random 6mers, dH20混勻至20ul，將反應體系升溫至37°C，反應15分，再繼續(xù)升溫至85°C， 反應5秒，逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA置于-20°C保存；步驟4、引物設(shè)計與合成p0d0CalyXin forward 5’ -CTTGAGACACAGACACAGAG, reverse 5’ -CCGTATGCCGCACTTATC ；CD2-AP forward 5，-AGGCTGGTGGAGTGGAAC,，reverse 5’ -CAGAGAAGGTATAGGTGAAGTAGG ； β -actin forward 5，-TGGCACCCAGCACAATGAA, reverse 5，-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA ；步驟 5、實時熒光定量 PCR 反應PCR 反應體系2ul 由步驟 3 得到的 cDNA，10ul SYBR Premix Ex TaqTM, 0. 4ul 正義引物，0. 4ul反義引物，0. 4ul ROX Reference dye 以及6. 8ul dH20，采用兩步法進行 PCR擴增①將PCR反應體系加熱至95°C，反應30s，②在95°C下反應k后降溫至60°C反應31s，并以95°C下反應k后降溫至60V反應31s為一個循環(huán)，如此擴增40個循環(huán)，最后建立熔解曲線(dissociation curve, DC)并鑒定產(chǎn)物特異性；步驟6、準標準品制備及準標準曲線制作將步驟5獲得的反應產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋后得到不同濃度的準標準品，將不同濃度的準標準品作為模板分別加入PCR反應體系進行PCR擴增，用準標準品濃度和Ct 值制作準標準曲線；步驟7、如果準標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0. 99，則將準標準品作為標準品，并進入8，否則，返回步驟6 ；步驟8、將待檢測尿液進行步驟1 3的處理，得到待測cDNA，再分別對待測cDNA和步驟7得到的標準品進行步驟5所述的實時熒光定量PCR反應，制作標準曲線并根據(jù)標準曲線計算待測cDNA中各基因的含量，并與待測cDNA內(nèi)參基因含量進行校正，最終得出各基因表達量。 發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明可無創(chuàng)、動態(tài)檢測糖尿病腎病患者尿液足細胞特異性mRNA， 且該方法標準品構(gòu)建簡便快速，靈敏度、特異性高，穩(wěn)定性可靠。產(chǎn)生此優(yōu)點的原因與以下因素有關(guān)1、標本的獲得尿液標本可無創(chuàng)獲得，收集處理過程簡便，且尿液中含有大量來源于腎臟及泌尿道的脫落細胞，為研究提供了素材；2、本發(fā)明利用標準曲線法對待測基因進行相對定量。理論上待測樣品總RNA、cDNA以及已知相對稀釋度的DNA都可作為該定量方法的標準品。目前絕大部分研究采用的標準品來源為模板cDNA以及純化的普通PCR產(chǎn)物。以模板cDNA倍比稀釋作為標準品可能會受限于檢測范圍較小，而純化PCR產(chǎn)物操作步驟較多且涉及到致癌試劑溴化乙錠的使用等。本發(fā)明標準品來源于預先擴增的目的基因的產(chǎn)物，較之目前常用標準品制備所需的瓊脂糖電泳以及DNA回收提純等操作步驟，具有快速簡便的特征，并避免接觸致癌試劑溴化乙錠；3、基于STOR GREEN I的實時熒光定量PCR 技術(shù)自身靈敏度及特性型高，穩(wěn)定性好。


圖1為本發(fā)明的流程圖。圖2 為 podocalyxin 熔解曲線。圖3為⑶2-AP熔解曲線。圖4為β -actin熔解曲線。圖5為podocalyxin檢測范圍及標準曲線。Podocalyxin在IO2-IO11倍稀釋范圍內(nèi)標準曲線的斜率為-3. 52，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9958。圖6為⑶2-AP檢測范圍及標準曲線。⑶2-AP在IO3-IOki倍稀釋范圍內(nèi)標準曲線的斜率為-3. 81，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9992。圖7DN患者及健康對照尿液podocalyxin水平差異比較。圖8DN患者及健康對照尿液⑶2-AP水平差異比較
具體實施例方式實施例1 構(gòu)建檢測尿液podocalyxin、⑶2-AP mRNA檢測方法步驟1、尿液標本的收集留取晨尿200-300ml，將晨尿置于離心機上并在離心力為3000g、溫度4°C下，離心30分鐘，棄上清，細胞沉渣重新懸浮于Iml焦碳酸二乙酯-PBS緩沖液(焦碳酸二乙酯與PBS緩沖液按體積比1 1000配制)，得到懸浮液，將懸浮液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘，棄上清，剩余沉渣中加入Iml RNAiso Plus (TAKARA, 大連，中國)，充分混勻，得到沉渣與RNAiso Plus的混合液；步驟2、總RNA提取步驟步驟2. 1將所述沉渣與RNAiso Plus的混合液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C 下，離心5分鐘，吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管；步驟2. 2向由步驟2. 1獲得的上清液中加入 200ul氯仿，蓋緊離心管，劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化且分層現(xiàn)象消失后，再室溫靜置5 分鐘，得到混懸液；步驟2. 3將步驟2. 2得到的混懸液置于離心機上并在離心力為12000g、 溫度4°C下，離心5分鐘；步驟2. 4取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；步驟2. 5向由步驟2. 4得到的上清液中加入等體積異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在 15-30°C下靜置10分鐘，得到混合液；步驟2. 6將步驟2. 5得到的混合液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘；步驟2. 7棄去上清，沿離心管壁加入體積濃度為75%的乙醇1ml，上下顛倒洗滌離心管，置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C 下，離心5分鐘后棄去乙醇，得到RNA沉淀；步驟2. 8室溫干燥RNA沉淀2_5分鐘，加入30ul Rnase-free水，用移液槍吹打RNA沉淀并使其溶解，得到RNA溶液，再利用紫外分光光度計 (Nanodrop, Thermo, USA)測定RNA濃度及純度；步驟3、逆轉(zhuǎn)錄反應體系lug步驟2. 8所述的RNA溶液，4ul 5X PrimeScriptTM Buffer, Iul PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I, Iul Oligo dT Primer, Iul Random 6mers (TAKARA，大連，中國)，dH20 混勻至 20ul，將反應體系升溫至37°C，反應15分，再繼續(xù)升溫至85°C，反應5秒，逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA置于_20°C 保存；步驟 4、引物設(shè)計與合成podocalyxin forward 5，-CTTGAGACACAGACACAGAG, reverse 5’ -CCGTATGCCGCACTTATC ；CD2-AP forward 5’ -AGGCTGGTGGAGTGGAAC，，reverse 5，-CAGAGAAGGTATAGGTGAAGTAGG ； β -actin forward 5’ -TGGCACCCAGCACAATGAA, reverse 5’ -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA ；步驟5、實時熒光定量PCR反應PCR反應體系2ul由步驟 3 得到的 cDNA，IOul SYBR Premix Ex TaqTM，0. 4ul 正義引物，0. 4ul 反義引物，0. 4ulR0X Reference dye (TAKARA,大連，中國)以及6. 8ul dH20,采用兩步法進行PCR擴增①將PCR 反應體系加熱至95°C，反應30s，②在95°C下反應k后降溫至60°C反應31s，并以95°C 下反應k后降溫至60°C反應31s為一個循環(huán)，如此擴增40個循環(huán)，最后建立熔解曲線 (dissociation curve, DC)并鑒定產(chǎn)物特異性；步驟6、準標準品制備及準標準曲線制作 將步驟5獲得的反應產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋后得到不同濃度的準標準品，將不同濃度的準標準品作為模板分別加入PCR反應體系進行PCR擴增，用準標準品濃度和Ct值制作準標準曲線；步驟7、如果準標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0. 99，則將準標準品作為標準品，并進入8，否則，返回步驟6 ；步驟8、將待檢測尿液進行步驟1 3的處理，得到待測cDNA，再分別對待測cDNA和步驟7得到的標準品進行步驟5所述的實時熒光定量PCR反應，制作標準曲線并根據(jù)標準曲線計算待測cDNA中各基因的含量，并與待測cDNA內(nèi)參基因含量進行校正，最終得出各基因表達量。9、熒光定量PCR敏感性測定將獲得的各基因標準品10倍稀釋，進行real-time PCR擴增，直至熒光定量PCR無法檢測出，上一濃度標準品對應的Ct 值作為該種基因的最低檢測濃度；10、重復性檢驗針對某一基因分別選擇相對高濃度(IO6 倍稀釋)及低濃度標(IO9倍稀釋)準品進行STOR GREEN I熒光定量PCR反應，每一基因濃度重復5次，通過Ct值和溶解曲線峰值的分析，驗證熒光定量PCR方法檢測podocalyxin 以及CD2-AP mRNA的穩(wěn)定性。同時比較相同樣本在不同次PCR反應間的可重復性。
表1. podocalyxin及CD2-AP標準品批內(nèi)變異。podocalyxin相對高濃度及低濃度標準品批內(nèi)變異系數(shù)分別為0. 68%,0. 65% ；CD2-AP相對高濃度及低濃度標準品批內(nèi)變異系數(shù)分別為0. 23%,0. 78% ；
權(quán)利要求
1. 一種尿足細胞特異信使核糖核酸聚合酶鏈反應檢測方法，其特征在于構(gòu)建步驟為 步驟1、尿液標本的收集留取晨尿200-300ml，將晨尿置于離心機上并在離心力為 3000g、溫度4°C下，離心30分鐘，棄上清，細胞沉渣重新懸浮于Iml焦碳酸二乙酯-PBS緩沖液(焦碳酸二乙酯與PBS緩沖液按體積比1 1000配制)，得到懸浮液，將懸浮液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘，棄上清，剩余沉渣中加入Iml RNAiso Plus，充分混勻，得到沉渣與RNAiso Plus的混合液； 步驟2、總RNA提取步驟步驟2. 1將所述沉渣與RNAiso Plus的混合液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘，吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管；步驟2. 2向由步驟2. 1獲得的上清液中加入200ul氯仿，蓋緊離心管，劇烈振蕩15秒， 待溶液充分乳化且分層現(xiàn)象消失后，再室溫靜置5分鐘，得到混懸液；步驟2. 3將步驟2. 2得到的混懸液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘；步驟2. 4取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；步驟2. 5向由步驟2. 4得到的上清液中加入等體積異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15-30°C下靜置10分鐘，得到混合液；步驟2. 6將步驟2. 5得到的混合液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘；步驟2. 7棄去上清，沿離心管壁加入體積濃度為75%的乙醇1ml，上下顛倒洗滌離心管，置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4°C下，離心5分鐘后棄去乙醇，得到RNA沉淀；步驟2. 8室溫干燥RNA沉淀2-5分鐘，加入30ul Rnase-free水，用移液槍吹打RNA沉淀并使其溶解，得到RNA溶液，再利用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度；步驟3、逆轉(zhuǎn)錄反應體系lug步驟2. 8所述的RNA溶液，4ul 5X PrimeScriptTM Buffer,Iul PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I,Iul Oligo dT Primer,Iul Random 6mers, dH20混勻至20ul，將反應體系升溫至37°C，反應15分，再繼續(xù)升溫至85°C，反應5秒，逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA置于_20°C保存；步驟 4、引物設(shè)計與合成:podocalyxin forward 5，-CTTGAGACACAGACACAGAG, reverse 5’ -CCGTATGCCGCACTTATC ；CD2-AP forward 5’ -AGGCTGGTGGAGTGGAAC，，reverse 5，-CAGAGAAGGTATAGGTGAAGTAGG ； β -actin forward 5’ -TGGCACCCAGCACAATGAA, reverse 5’ -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA ；步驟5、實時熒光定量PCR反應PCR反應體系2ul由步驟3得到的cDNA，IOul SYBR Premix Ex TaqTM，0. 4ul 正義引物，0. 4ul 反義引物，0. 4ul ROX Reference dye 以及 6. 8ul dH20，采用兩步法進行PCR擴增①將PCR反應體系加熱至95°C，反應30s，②在95°C 下反應k后降溫至60°C反應31s，并以95°C下反應k后降溫至60°C反應31s為一個循環(huán)， 如此擴增40個循環(huán)，最后建立溶解曲線(dissociation curve, DC)并鑒定產(chǎn)物特異性；步驟6、準標準品制備及準標準曲線制作將步驟5獲得的反應產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋后得到不同濃度的準標準品，將不同濃度的準標準品作為模板分別加入PCR反應體系進行PCR擴增，用準標準品濃度和Ct值制作準標準曲線；步驟7、如果準標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0. 99，則將準標準品作為標準品，并進入 8，否則，返回步驟6，步驟8、將待檢測尿液進行步驟1 3的處理，得到待測cDNA，再分別對待測cDNA和步驟7得到的標準品進行步驟5所述的實時熒光定量PCR反應，制作標準曲線并根據(jù)標準曲線計算待測cDNA中各基因的含量，并與待測cDNA內(nèi)參基因含量進行校正，最終得出各基因表達量。
全文摘要
一種尿足細胞特異信使核糖核酸聚合酶鏈反應檢測方法的建立，其特征在于構(gòu)建步驟為尿液標本的收集；總RNA提取及濃度純度檢測；逆轉(zhuǎn)錄；引物設(shè)計與合成；real-timePCR反應；標準品制備及標準曲線制作；待測樣本及標準品real-time PCR反應。本發(fā)明具有快速簡便的特征，且可獲得優(yōu)異的定量直線相關(guān)系數(shù)(R2＞0.99)。同時，所建立的方法檢測濃度范圍廣，podocalyxin及CD2-AP分別跨10個及8個數(shù)量級，兩種基因最低檢測濃度所對應的Ct值分別可達35、33.2286。此外，利用該方法檢測兩種基因高濃度及低濃度模板Ct值的組間及批間差異均小于3％，提示該方法穩(wěn)定性高，可重復性好。該方法的建立為快速、簡便檢測尿液足細胞特異性mRNA提供了穩(wěn)定的技術(shù)平臺。
文檔編號C12Q1/68GK102443651SQ20111044365
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者劉必成, 鄭敏 申請人:東南大學